専用リーダーを用いた新しいアデノウイルス迅速診断法の臨床評価

admin — Mon, 29 Jun 2015 15:22:27 +0000

《第51回日本眼感染症学会原著》あたらしい眼科32（6）：865.869，2015c専用リーダーを用いた新しいアデノウイルス迅速診断法の臨床評価中川尚＊1宮田和典＊2木村泰朗＊3箕田宏＊4大橋秀行＊5栗田正幸＊6中村聡＊7弓狩健一＊8金子久俊＊9松本治恵＊10加藤陽子＊11平山優子＊12前野淳子＊13秦野寛＊14＊1徳島診療所＊2宮田眼科病院＊3上野眼科＊4とだ眼科＊5大橋眼科＊6くりた眼科クリニック＊7吉野町眼科＊8弓狩眼科医院＊9ほばら眼科＊10松本眼科＊11あおと眼科＊12平山眼科クリニック＊13前野眼科＊14ルミネはたの眼科ClinicalEvaluationofaRapidDiagnosticKitforAdenoviruswithaDedicatedDigitalReaderHisashiNakagawa1）,KazunoriMiyata2）,TairouKimura3）,HiroshiMinoda4）,HideyukiOhashi5）,MasayukiKurita6）,SatoshiNakamura7）,KenichiYukari8）,HisatoshiKaneko9）,HarueMatsumoto10）,YokoKato11）,YukoHirayama12）,AtsukoMaeno13）andHiroshiHatano14）1）TokushimaEyeClinic,2）MiyataEyeHospital,3）UenoEyeClinic,4）TodaEyeClinic,5）OhashiEyeClinic,6）KuritaEyeClinic,7）YoshinochoEyeClinic,8）YukariEyeClinic,9）HobaraEyeClinic,10）MatsumotoEyeClinic,11）AotoEyeClinic,12）HirayamaEyeClinic,13）MaenoEyeClinic,14）HatanoEyeClinic目的：専用リーダーを用いて客観的に判定を行うアデノウイルス抗原迅速検出キット「BDベリターTMシステムAdeno」（以下，ベリター）の臨床評価を行った．対象および方法：全国14施設において，結膜炎症状で受診した計245例を対象に，ベリター，チェックAdまたはBDAdenoエグザマンTM（以下，エグザマン）による抗原検出を実施し，あわせてPCR（polymerasechainreaction）法によるアデノウイルス遺伝子の検出を行った．結果：ベリターとチェックAdとの全体一致率は96.0％（48/50），ベリターとエグザマンの全体一致率は93.1％（189/203）であった．PCR法を基準とした各キットの検出感度はベリターで75.9％（63/83），チェックAdで78.6％（11/14），エグザマンで75.4％（52/69）であった．ベリターにおいて目視で陰性，リーダーで陽性と判定された5例中4例はPCR法にて陽性であった．結論：ベリターは既存2製品と同等の性能があると考えられた．また，専用リーダーにより結果を客観的に判定できる利点があると考えられた．Inthisstudy,weconductedaclinicalevaluationofthe“BDVeritorTMSystemAdeno”（Becton,DickinsonandCompany,FranklinLakes,NJ）,anewlydevelopedrapiddiagnostickitforadenoviruswithadedicateddigitalreader.Threerapiddiagnostickits,BDVeritorTM,BDCheckAd,andBDAdenoExaman,werecomparedusingconjunctivalscrapingspecimensobtainedfrom245patientswithconjunctivalsymptomsat14hospitalsandeyeclinics.Polymerasechainreaction（PCR）fordetectionofadenoviruswasalsoconducted.ThetotalagreementrateforBDVeritorTMandBDCheckAd,andBDVeritorTMandBDAdenoExamanwere96.0％（48/50）and93.1％（189/203）,respectively.SensitivitybasedonPCRforBDVeritorTM,BDCheckAd,andBDAdenoExamanwere75.9％（63/83）,78.6％（11/14）,and75.4％（52/69）,respectively.FivenegativeresultsbyvisualjudgmentweredeterminedpositivebytheBDVeritorTMdedicateddigitalreader.FourofthosewerefoundtobepositivebyPCR.Thefindingsofthisstudysuggestthatintheclinicalsetting,theaccuracyoftheBDVeritorTMSystemAdenoisequivalenttothatoftwocurrentlymarketeddiagnostickits,yethastheadvantageofprovidingtheabilitytomakeanobjectivejudgmentbyuseofadedicateddigitalreader.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）32（6）：865.869,2015〕〔別刷請求先〕中川尚：〒189-0024東京都東村山市富士見町1-2-14徳島診療所Reprintrequests：HisashiNakagawa,M.D.,TokushimaEyeClinic,1-2-14Fujimi-cho,Higashimurayama-shi,Tokyo189-0024,JAPAN0910-1810/15/\100/頁/JCOPY（101）865Keywords：アデノウイルス結膜炎，イムノクロマト法，迅速診断キット，専用リーダー，客観的判定．adenoviralconjunctivitis,immunochromatography,rapiddiagnostictesting,dedicatedreader,objectiveresult.はじめに結膜炎を起こすウイルスにはアデノウイルス，エンテロウイルス，単純ヘルペスウイルスなどさまざまなものがあるが，なかでもアデノウイルスは伝染力が強く，ときに院内感染を引き起こすため，迅速な診断と対応が重要である1,2）．近年，イムノクロマト法を原理とするアデノウイルス抗原検出の迅速診断キットが次々と発売され，日常診療において汎用されている3.8）．これらのキットはテストプレート上に現れるテストラインを目視にて判定を行うものが主流であるが，ラインが薄い場合などその判定に苦慮する場合がある．今回，筆者らは，イムノクロマト法を原理とするテストプレートを専用のデンシトメトリー分析装置を用いて判定するBDベリターTMシステム（日本ベクトン・ディッキンソン〔株〕）を臨床評価する機会を得たので報告する．I対象および方法1.対象対象はアデノウイルス結膜炎を疑われた患者245例，271眼で，年齢は0.90歳，平均39歳であった．性別は男性116例，女性129例であった．2.方法a.迅速診断キット今回は，評価対象としたBDベリターTMシステムを既存の2つの抗原検出キットと比較検討した．BDベリターTMシステムは，イムノクロマト法を原理とするテストプレート「BDベリターTMシステムAdeno」（以下，ベリター）とテストラインを読み取る専用のデンシトメトリー分析装置「BDベリターTMシステムリーダー」（以下，専用リーダー）からなり，判定を目視ではなくリーダーによって客観的に行うシステムである（図1）．対照キットはチェックAd（大蔵製薬〔株〕）とBDAdenoエグザマンTM（以下，エグザマン，〔株〕タウンズ）で，いずれもイムノクロマト法を原理とし，目視にて判定を行う製品である．それぞれのキットの特徴を表1にまとめた．b.検体採取と抗原検出の実施検査の同意が得られた患者から，各診断キットに付属の専用綿棒を用いて結膜擦過物を採取した．検体の採取順および擦過回数は統一せず検者に任せた．検体採取後すぐにベリターおよびチェックAd，またはベリターおよびエグザマンの組み合わせで抗原検出を実施した．各迅速診断キットの実施方法は添付文書に従い，判定時間はベリターが10分，チェックAdおよびエグザマンは15分とした．ベリターの判定は，リーダーでの結果を用いた．c.PCR法PCR（polymerasechainreaction）法はチェックAdまたはエグザマンの抽出液の残液を用い，アデノウイルスDNA同定，ウイルスゲノムコピー数の半定量，および遺伝子系統解析による型判定を〔株〕LSIメディエンス（旧〔株〕三菱化学メディエンス）に委託した．図1専用リーダーによる判定（検査陽性例）表1評価したアデノウイルス迅速診断キットの特徴BDベリターTMシステムAdenoBDAdenoエグザマンTMチェックAd製造販売元測定原理標識物質判定時間判定方法採取用綿棒日本ベクトン・ディッキンソンイムノクロマト法金コロイド10分専用リーダーフロックドスワブタウンズイムノクロマト法白金.金コロイド3.15分目視コットンスワブ大蔵製薬イムノクロマト法金コロイド10.15分目視コットンスワブ866あたらしい眼科Vol.32，No.6，2015（102）II結果対象の245例のうち検査未実施などの脱落例を除く228例，253眼を解析対象とした．ベリターは228例253眼，チェックAdは50例50眼，エグザマンは178例203眼が解析対象となった．検査病日は0.23日で，3病日以内が208眼（82％），7病日以内が244眼（96％）と，ほとんどが発病1週間以内の症例であった．1.ベリターとチェックAdの相関性ベリターとチェックAdの陽性一致率は100％（11/11），陰性一致率は94.9％（37/39），全体一致率は96.0％（48/50）で（表2）で，両者の結果に差はみられなかった．このうち，ベリター陽性でチェックAd陰性の2検体はPCR法でアデノウイルスDNAが検出された．2.ベリターとエグザマンの相関性ベリターとエグザマンの陽性一致率は84.9％（45/53），陰性一致率は96.0％（144/150），全体一致率は93.1％（189/203）で（表3），両者の結果に差はみられなかった．このうち，ベリター陽性でエグザマン陰性の6検体中5検体，およびベリター陰性でエグザマン陽性の8検体中7検体はPCR法でアデノウイルスDNAが検出された．すなわち，キットで陽性を示したがPCRが陰性を示したものが2検体表2ベリターとチェックAdとの相関性チェックAd＋.Total＋11213ベリター.03737Total113950（ベリターはリーダーによる判定）陽性一致率：100％（11/11），95％CI［71.5％，100％］陰性一致率：94.9％（37/39），95％CI［82.7％，99.4％］全体一致率：96.0％（48/50），95％CI［86.3％，99.5％］p＝0.500（McNemar’stest）あった（ベリター1検体，エグザマン1検体）．3.PCR法を基準とした各診断キットの感度および特異度PCR法を基準とした各キットの感度および特異度は，ベリターで75.9％（63/83）および99.4％（169/170），チェックAdで78.6％（11/14）および100％（36/36），エグザマンで75.4％（52/69）および99.3％（133/134）であった（表4）．また，ウイルスゲノムコピー数が1.0×104copies/ml以下において迅速診断キットの陽性率が低く，感度は40％未満であった．4.アデノウイルス血清型と各診断キットの検出感度PCR法によるアデノウイルス血清型と各診断キットの検出感度を表5に示した．検体数の少ない血清型もあり，血清型による検出感度の差については明らかなことはわからなかった．D種の型同定不能（notidentified），E種の4型におけるウイルス半定量値は他と比較して1.2管低い値（D種の型同定不能：4.0×105copies/ml，E種4型：9.2×104copies/ml）であり，これらでは迅速診断キットの陽性率が低い傾向が認められた．5.ベリターにおける目視と専用リーダーによる判定結果の比較ベリターの目視と専用リーダーの判定結果は全体で96.8％の一致率であった．目視により陰性と判断されたが，専用表3ベリターとエグザマンとの相関性エグザマン＋.Total＋45651.8144152Totalベリター53150203（ベリターはリーダーによる判定）陽性一致率：84.9％（45/53），95％CI［72.4％，93.3％］陰性一致率：96.0％（144/150），95％CI［91.5％，98.5％］全体一致率：93.1％（189/203），95％CI［88.7％，96.2％］p＝0.791（McNemar’stest）表4PCR法を基準とした各迅速診断キットの感度および特異度PCR抗原検出キット（copies/ml）ベリターチェックAdエグザマン感度1.0×107≦97.2％（35/36）100％（8/8）96.4％（27/28）1.0×10668.4％（13/19）60.0％（3/5）85.7％（12/14）1.0×10573.3％（11/15）0.0％（0/1）78.6％（11/14）1.0×10437.5％（3/8）NoData25.0％（2/8）1.0×10333.3％（1/3）NoData0.0％（0/3）1.0×1020.0％（0/2）NoData0.0％（0/2）Total75.9％（63/83）78.6％（11/14）75.4％（52/69）特異度99.4％（169/170）100％（36/36）99.3％（133/134）（103）あたらしい眼科Vol.32，No.6，2015867表5アデノウイルス血清型と各迅速診断キットの陽性率種型copies/ml＊ベリターチェックAdエグザマンB31.2×10788.9％（16/18）66.7％（2/3）86.7％（13/15）NI†5.8×10650.0％（1/2）NoData100％（2/2）C23.1×1030.0％（0/1）NoData0.0％（0/1）D83.6×107100％（4/4）NoData100％（4/4）19A1.6×107100％（2/2）NoData100％（2/2）37/533.4×10678.9％（15/19）80.0％（4/5）71.4％（10/14）542.3×10785.7％（6/7）NoData100％（7/7）NI†4.0×10561.1％（11/18）100％（4/4）64.3％（9/14）E49.2×10466.7％（8/12）50.0％（1/2）50.0％（5/10）＊平均値，†notidentified（同定不能）表6ベリターの目視と専用リーダーによる判定結果の比較目視＋.Total＋59564リーダー.3185188Total62190252陽性一致率：95.2％（59/62）陰性一致率：97.4％（185/190）全体一致率：96.8％（244/252）リーダーにより陽性と判定された例が5件あった（表6）．このうち4件はPCR法にてアデノウイルスDNAが検出されたが1例は陰性であった．また，逆に目視にて陽性と判断されながら専用リーダーにより陰性と判定された例が3件あった（表6）．これら3件はすべてPCR法にてアデノウイルスDNAが検出された．III考察今回，専用リーダーを用いて客観的に判定を行う迅速診断キット「BDベリターTMシステム」の評価を行った．ベリターと対照2製品との結果の一致率は比較的高く，感度，特異度も対照2製品と同等の結果であり，従来のキットとほぼ同等の性能を有するものと考えられた．しかし，ベリターとエグザマンでは結果の不一致が7％程度にみられ，とくに陽性一致率が85％程度と低値を示した．そのもっとも大きな要因は検体採取の方法と思われる．今回は2つのキットのために2回の結膜擦過を行い，それぞれの抽出液を用いて検査を行った．採取の順番は決めずに，採取器具もキットに付属のもの（綿棒あるいはフロックドスワブ）を用いたため統一されていない．結膜という面積の小さな感染部位では，十分量の検体を複数回採取するのはむずかしいと予想され，検体量の差が結果の差に反映し，不一致例が増えたものと考えられる．また，検者の擦過手技の適否も検体量を左右する要因の868あたらしい眼科Vol.32，No.6，2015一つと考えられる．正確にキットの性能を比較するためには，同一の試料を用いて検査を行うのが理想であろう．今回の検討では，PCR法によるウイルス検出をベリター抽出液からではなく，対照キットのチェックAdあるいはエグザマンの抽出液を試料として行った．同時期に連続して採取した試料中には同程度のウイルスが含まれているという前提で今回の解析を行ったが，前述したように一部では抽出液中のウイルス量に差があった可能性もあり，ベリターの感度・特異度を正確に評価できていない可能性は否定できない．イムノクロマト法のアデノウイルス抗原検出キットは，特異性が高く偽陽性がないことが一つの特徴であるが，今回の研究ではPCR陰性でキット陽性，すなわち「偽陽性」と考えられる検体が2検体（ベリター陽性1検体，エグザマン陽性1検体）あった．ベリターの試料から直接PCR法を行っていないため，ベリター陽性検体が「偽陽性」か否かの判断はむずかしく，PCR用試料のエグザマン抽出液中のウイルス量が少なかったためPCRが陰性になった可能性もある．エグザマンの偽陽性については，目視判定の誤り，試料の展開の問題などが考えられるが，明らかな原因はわからなかった．イムノクロマト法のキットは簡便で短時間で実施でき，アデノウイルス結膜炎の補助病因診断として欠かせない検査である9）．しかし，PCR法を基準とした感度は，今回検討したいずれのキットも80％に達せず十分とはいいがたい．ウイルス半定量の結果から，迅速診断キットが陽性を示すためには1.0×105copies/ml以上のウイルスDNA量が必要と考えられ，そのためには十分量の結膜擦過物を得ることが重要と考えられる．本製品の検体採取綿棒は植毛タイプのフロックドスワブであり，一般の綿棒と比べて検体採取量が多く，かつ抽出効率がよいことが示されているが10,11），今回の検討では陽性率に有意な差は認められず，患部の小さい結膜炎を対象とした場合にはその優位性が発揮されにくいのかもしれな（104）い．今回評価したベリターの最大の特色は，プレート上のテストラインを目視でなくリーダーで読み取って判定する点にある．一般にイムノクロマト法を原理とする迅速診断キットは，目視により判定を行うため簡便であるが主観的であり，ラインが非常に薄い場合など判定に苦慮することもある．山口ら12）は，テストラインの濃さと目視による判定結果のばらつきを検証し，個人差，とくに判定者の熟練度が目視判定に影響を与えることを示し，客観性のあるBDベリターTMシステムの有用性を示している．今回の検討でも，目視で陰性でリーダーで陽性と判定されたものが5件あり，これらは目視では判定のむずかしい極薄いテストラインをリーダーが読み取ったもので，その有用性を示すものと考えられる．しかし一方で，目視で陽性と判定されながらリーダーが陰性を示したものが3件あった．この3件中2件はメンブレン上の抽出液の展開が不均一で，金コロイドの赤紫色がメンブレン上に斑状になっていた．専用リーダーはバックグランドとなるメンブレンとテストラインの濃淡を利用して判定を行うため，不均一な展開により濃淡の差が正確に読み取れなかったものと推察された．テストプレートの検体滴下部に対し斜め方向または滴下部に沿わせながら抽出液を滴下した場合，展開が不均一になる場合があり，検体を垂直に滴下するなど滴下方法に注意が必要と考えられた．ベリターには検体採取効率のよい植毛タイプの採取綿棒が付属され，客観的に結果判定が行えるという他のキットにはない利点がある．判定に際して目視による結果も考慮すべき事例があり，これについては今後のさらなる検討や事例の蓄積が必要であるが，検体採取やイムノクロマトの結果判定に不慣れな場合でも，ベリターがそれを補ってくれる可能性があり，アデノウイルス結膜炎の迅速病因診断キットとして有用と考えられた．＜謝辞＞本研究の実施にあたり，試薬提供およびPCR検査実施にご協力いただいた日本ベクトン・ディッキンソン株式会社に深謝いたします．利益相反：利益相反公表基準に該当なし文献1）大野重昭，内尾英一，岡本茂樹ほか：ウイルス性結膜炎ガイドライン．日眼誌107：1-35,20032）中川尚：とことんわかる！ウイルス性結膜炎．眼科ケア13：74-78,20113）斉藤和香，内尾英一，青木功喜ほか：免疫クロマトグラフィー法によるアデノウイルス結膜炎の迅速診断．臨眼51：1073-1076,19974）竹内聡，中川尚，米本淳一ほか：高感度アデノウイルス結膜炎迅速診断キットの評価─アデノウイルス結膜炎迅速診断キット，キャピリアRアデノとアデノチェックの比較─．あたらしい眼科23：921-924,20065）清水英明，石丸陽子，藤本嗣人：白金─金コロイドイムノクロマトグラフ法を使用したアデノウイルス検査キットの有用性．感染症誌83：64-65,20096）北市伸義，明尾潔，熊埜御堂隆ほか：白金-金コロイド標識抗体を用いたアデノウイルス迅速診断検査キットの評価．医学のあゆみ237：210-214,20117）三田村敬子，清水英明，安倍隆ほか：新しいアデノウイルス抗原検出試薬クリアビューアデノの検討．医学と薬学67：131-136,20128）宮永嘉隆，中川尚，秦野寛ほか：新しいアデノウイルス迅速診断法「クイックナビ-アデノ」の臨床評価．あたらしい眼科29：659-663,20129）平田憲：眼科における感染対策．臨床と研究88：559562,201110）DaleyP,CastricianoS,CherneskyMetal：Comparisonoffllockedandrayonswabsforcollectionofrespiratoryepithelialcellsfromuninfectedvolunteersandsymptomaticpatients.JClinMicrobiol44：2265-2267,200611）藤本嗣人，榎本美貴，小長谷昌未ほか：フロックドスワブのアデノウイル検体採取での有用性．感染症誌83：398400,200912）山口育男，青山知枝，山本優ほか：イムノクロマト法インフルエンザウイルス抗原検出キットBDベリターシステムFluにおける機器判定の感度とその目視判定に対する優越性の検討．臨床微生物23：213-218,2013＊＊＊（105）あたらしい眼科Vol.32，No.6，2015869

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