培養ヒト結膜上皮細胞における高浸透圧ストレス負荷に対するカテキンの抑制効果

admin — Wed, 29 Jun 2016 15:22:13 +0000

《第35回日本眼薬理学会原著》あたらしい眼科33（6）：867.873，2016c培養ヒト結膜上皮細胞における高浸透圧ストレス負荷に対するカテキンの抑制効果木崎順一郎＊1,2宇高結子＊1佐々木晶子＊1辻まゆみ＊1友寄英士＊1,2當重明子＊1,2岩井信市＊1,3小口勝司＊1＊1昭和大学医学部薬理学講座医科薬理学部門＊2昭和大学医学部眼科学講座＊3昭和大学薬学部社会健康薬学講座医薬品評価薬学部門Anti-inflammatoryEffectsofEGCGorEGCG3MeagainstHyperosmotic-inducedInflammationinHumanConjunctivalEpitheliumCellsJunichiroKizaki1,2）,YukoUdaka1）,AkikoSasaki1）,MayumiTsuji1）,EijiTomoyori1,2）,AkikoToju1,2）,ShinichiIwai1,3）andKatsujiOguchi1）1）DepartmentofPharmacology,ShowaUniversitySchoolofMedicine,2）DepartmentofOphthalmology,ShowaUniversitySchoolofMedicine,3）DepartmentofResearchandDevelopmentforInnovativeMedicalNeeds,Health,ShowaUniversitySchoolofPharmacyドライアイは，涙液層の浸透圧上昇と，これに伴う眼表面の炎症がおもな病態と考えられている．近年，茶カテキン，とくに（-）-EpigallocatechinGallate（EGCG）および，（-）-Epigallocatechin3-（3”-O-Methyl）Gallate（EGCG3”Me）の高い生理活性が報告されている．本研究では，培養ヒト結膜上皮細胞株を用い，培養液にスクロースを添加することで高浸透圧ストレス負荷を施し，アポトーシス解析，MAPK（ERK，JNK，p38MAPK）リン酸化能およびIL-6生成量を測定し，さらにEGCG，EGCG3”Meを前処置による抑制効果を検討した．その結果，高浸透圧ストレス負荷により，アポトーシス細胞の割合，JNK，p38MAPKリン酸化能およびIL-6生成量が有意に増加した．これに対し，EGCG3”MeはIL-6生成量とp38MAPK活性の上昇を有意に抑制したが，EGCGではIL-6生成の抑制は認めなかった．以上より高浸透圧ストレス誘発性炎症に対し，EGCG3”Meはp38MAPKリン酸化を抑制することで，IL-6生成を抑え，抗炎症作用を示すものと考えた．Osmoticpressureoftearsindryeyepatientsisusuallyhigherthaninnormalpersons.Itisassociatedwithincreasedosmolarityofthetearfilmandinflammationoftheocularsurface.Inaddition,teacatechinssuchas（-）-EpigallocatechinGallate（EGCG）and（-）-Epigallocatechin3-（3”-O-Methyl）Gallate（EGCG3Me）havemultiplebiologicalactions,includinganti-allergy,anti-inflammatoryandanti-canceractivity.Inthisstudy,weexaminedwhetherEGCGandEGCG3Meattenuatethehyperosmosis-inducedinflammationinhumanconjunctivalepitheliumcells（HCEcells）.HCEcellswereexposedtohyperosmoticmedium（423mOsm,i.e.,123mMsucroseinmedium）,andthenexaminedastotherateofapoptosis,IL-6levelsandactivityofMAPKs（ERK,JNKandp38MAPK）.EGCG3MesignificantlysuppressedtheincreaseinIL-6levelandelevationofphosphorylatedp38MAPK.EGCG3MeinductionofinflammationmorepotentthanEGCGwasalsoindicated.TheseresultssuggestthatEGCG3Memightbeuseableasatherapeuticapproachindryeye.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）33（6）：867.873,2016〕Keywords：結膜，ドライアイ，炎症，高浸透圧，カテキン．conjunctiva,dryeye,inflammatory,hyperosmolarity,catechin.〔別刷請求先〕木崎順一郎：〒142-8555東京都品川区旗の台1丁目5-8昭和大学医学部薬理学講座医科薬理学部門Reprintrequests：JunichiroKizaki,M.D.,DepartmentofPharmacology,ShowaUniversitySchoolofMedicine,1-5-8Hatanodai,Shinagawa,Tokyo142-8555,JAPAN0910-1810/16/\100/頁/JCOPY（107）867はじめに近年，生活環境の変化（高齢化，コンタクトレンズ装用者の増加，エアコン普及，パソコン，スマートフォン，ゲームなどのデジタル機器（visualdisplayterminals：VDT）の長時間使用などにより，ドライアイの有病率が増えている．とくにオフィスワーカーの約6割がドライアイもしくはその疑いがあり，QOLの低下や作業効率の低下などにつながるという報告もあり1），いわば現代病の一つといっても過言ではない．ドライアイの発症のメカニズムとして，眼表面の浸透圧の上昇が指摘されている．涙液の産生低下，あるいは蒸発亢進による涙液量の減少により眼表面の浸透圧が上昇すると炎症反応が起こり，結膜傷害，ゴブレット細胞の減少を引き起こし，涙液層の不安定化などにつながる．その結果，さらに涙液が減少するなどの悪循環を起こすこと2）が示されている．米国では，とくにこの考え方が強く，ドライアイの診断において眼表面の浸透圧上昇を重視しており，治療の中心は抗炎症薬投与になっている3）．近年，日本緑茶に豊富に含まれるポリフェノール（greenteapolyphenol）のうち，カテキン類には，抗酸化作用，抗腫瘍作用，抗転移作用，血圧抑制作用，動脈硬化抑制作用，脂質代謝改善作用，抗菌作用，抗ウイルス作用，抗う蝕作用，抗アレルギー作用といった多様な生理作用を有することが報告されている．とくに，（-）-Epigallocatechingallate（EGCG）は，茶特有のポリフェノール成分で4），上記作用が強力に出ることが多数報告されている．いわゆる緑茶の代表的な品種「やぶきた」には，カテキン類が10.20％の割合で含まれており，その約半分をこのEGCGが占めるとされている．一方，EGCGの3つの水酸基のうちortho位をメチル化した（-）-Epigallocatechin3-（3”-O-Methyl）gallate（EGCG3”Me）の強い生理活性が最近注目されている．これは「べにふうき」「べにふじ」「べにほまれ」などの品種の茶葉に多く含まれ，「やぶきた」には含まれていない．EGCG3”Meは高い抗酸化活性を持ち，とくに抗アレルギー作用はEGCGの約2.5倍との報告がある．そこで今回，筆者らは，培養ヒト結膜上皮（humanconjunctivalepithelium：HCE）細胞を用いて，眼表面のドライアイ病態を想定した高浸透圧ストレス負荷状態における炎症誘発経路を明らかにするとともに，これに対するEGCGとEGCG3”Meの抗炎症作用およびその有用性を比較検討した．なお，今回使用した細胞株は，ヒト子宮頸癌由来上皮細胞（HeLa細胞）の混入が疑われているが，株化したヒト結膜上皮細胞の代用がないため，HCE細胞とHeLa細胞の比較検討を行った．I材料および方法1.細胞培養ヒト眼球由来結膜上皮細胞株（Clone-1-5c-4：HCE細胞）をDSファーマメディカル（大阪）より購入，細胞は2mMGlutamine＋10％FetalBovineSerum（FBS）含有Medium199（Sigma-AldrichCo.,MO,USA）培地中，5％CO2，37℃にて培養した．ヒト子宮頸癌由来上皮細胞（ATCCCCL2.2：HeLa細胞）は，FBS含有E-MEMmedium培地中，5％CO2，37℃にて培養した．2.高浸透圧ストレスFBS非含有medium（289mOsm/L）に123mMのスクロース（和光純薬工業，大阪）を添加し，Hyperosmoticmedium（423mOsm/L）を調整し5），培養液をこれに置換することで，高浸透圧ストレス負荷（Hyper）群とした．対照として，スクロース非添加群をコントロール（Cont）群とした．3.使用薬物カテキン類はそれぞれEGCGを和光純薬工業から，EGCG3”Meを長良サイエンス（岐阜）から購入した．Mitogen-activatedproteinkinaseinhibitor（MAPKi）は，p38MAPKinhibitor（p38i）としてSB203585，extracellularsignal-regulatedkinase（ERK）inhibitor（ERKi）としてPD98059をSigma-AldrichCo.（MO,USA）から購入，c-JunN-terminalkinase（JNK）inhibitor（JNKi）としてSP600125を和光純薬工業（東京）から購入した．4.実験プロトコール細胞を測定項目に応じて適切な濃度に調整して播種し，24時間培養後，Cont群には高浸透圧ストレス負荷の1時間前に，p38i1μM，JNKi10μM，ERKi10μM，EGCG5,10,20μM，およびEGCG3”Me5,10,20μMを添加した．その1時間後，Hyper群は培養液を高浸透圧ストレスmediumに置換し，ただちに，各MAPKiおよびカテキン類をCont群と同じ濃度で添加した．両群ともその状態で培養を続け，各時点のサンプルを実験に供した．5.高浸透圧負荷後のアポトーシス細胞の経時的解析HCE細胞を3×105cells/mLに調整し6穴プレートに播種し，先に示した条件で24時間培養後，高浸透圧負荷を行った．その後1,3,6,15,24時間時点で抽出し，MuseRCellAnalyzer（MerckMillipore,Germany）にて，MuseTMAnnexinVandDeadCellKit（EMDMilliporeCorporation,USA）を用いて，アポトーシス細胞の表面に提示されたホスファチジルセリン（PS）とアネキシンV-PEが結合する割合から，アポトーシス細胞の割合を検出した．6.高浸透圧負荷後のIL.6生成量の経時的変化測定HCE細胞を3×105cells/mLに調整し6穴プレートに播種868あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016（108）し，24時間培養後，高浸透圧負荷を行った．その後1,3,6,15,24時間時点の上清をサンプルとし，Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay（ELISA法）にてHRP標識抗リン酸化IL-6抗体と発色試薬を用いてIL-6を検出し，HumansIL-6InstantELISA（eBioscience,AffymetrixInc,CA,USA）を用いて，マイクロプレートリーダーにて波長450nmでの吸光度を測定した．7.高浸透圧負荷1時間後のMAPK（ERK，JNK，p38MAPK）リン酸化能測定HCE細胞，HeLa細胞を1×105cells/mLに調整し，96穴プレートに播種し，24時間培養した．その後，各MAPKiおよび，HCE細胞については5,10,20μMEGCG，EGCG3”Meを，HeLa細胞については10μMEGCG,EGCG3”Meを添加し，その1時間後，高浸透圧ストレス負荷を行い，1時間後のMAPKリン酸化能を測定した．細胞は，HRP標識抗リン酸化各MAPK抗体と発色基質を用いてリン酸化各MAPKをそれぞれ検出し〔RayBioRCell-Basedp38（Thr180/Tyr182）ELISAkit，RayBioRCell-basedJNK（Thr183/Tyr185）ELISAkit，RayBioRCell-BasedERK（Thr180/Tyr182）ELISAkit（以上，RayBiotech,Inc.,GA,USA）〕を用いてマイクロプレートリーダーにて波長450nmでの吸光度を測定した．8.EGCG,EGCG3”Me添加による高浸透圧負荷24時間後のIL.6生成量の測定HCE細胞，HeLa細胞を3×105cells/mLに調整し6穴プレートに播種し，24時間培養後，EGCG（5,10,20μM），EGCG3”Me（5,10,20μM）およびp38i（1μM），JNKi（10μM），ERKi（10μM）を添加し，その1時間後，高浸透圧ストレス負荷を行い，24時間後のIL-6生成量をHumansIL-6InstantELISA（eBioscience,Inc.,CA,USA）を用いて，マイクロプレートリーダーにて波長450nmでの吸光度を測定した．9.67kDaLaminineReceptor（67LR）の免疫細胞染色HCE細胞を3×105cells/mLに調整し，ChamberSlideTMで24時間培養後，EGCG（10μM）,EGCG3”Me（10μM）を添加し，その1時間後に浸透圧負荷を行った．負荷後1時間で細胞をホルマリン固定し，ENVISION染色システムを用い，一次抗体〔Anti-67kDaLamininReceptor抗体MLuC5（ab3099）；Abcam,UK〕，を2時間反応させ，その後，二次抗体とパーオキシダーゼが結合しているデキストランポリマー試薬を反応させて，核や細胞質の染色を行った．10.統計処理実験結果は平均±標準偏差（n＝3.12）で示した．HCE細胞，HeLa細胞におけるHyper群でのパラメーターはt検定を用いてCont群と比較検討した．また，HCE細胞における高浸透圧ストレス負荷後のMAPKリン酸化能，IL-6生成量（109）に対するカテキン類の抑制効果についてはANOVA-Bonferroni多重比較検定を用いてHyper群と比較検討し，p＜0.05以下を有意とした．II結果1.高浸透圧ストレス負荷によるアポトーシス細胞の経時的変化図1AにHCE細胞に高浸透圧ストレス負荷を施した後の1,3,5,15,24時間後のアポトーシス細胞の経時的変化を，AnnexinVを用いてアポトーシス細胞の割合（％）で示した．Hyper群は高浸透圧ストレス負荷後，アポトーシス細胞の割合が経時的に上昇し，6時間以降，Cont群と比べ有意な増加を認めた（n＝6,p＜0.01）．図1BにHCE細胞とHeLa細胞の高浸透圧ストレス負荷24時間後のアポトーシス細胞の割合（％）を示した．HeLa細胞においても，高浸透圧ストレス負荷によりアポトーシス細胞の割合は有意に上昇した（n＝3,p＜0.01）．2.高浸透圧ストレス負荷によるIL.6生成量の経時的変化図2AにHCE細胞に高浸透圧ストレス負荷1,3,6,15,24時間後のIL-6生成量の経時的変化を示した．Hyper群は高浸透圧ストレス負荷により，IL-6生成量が経時的に上昇し，15時間以降，Cont群と比べ有意に上昇した（n＝6,p＜0.01）．図2BにHCE細胞とHeLa細胞の高浸透圧ストレス負荷24時間後のIL-6生成量を示した．HeLa細胞もHyper群はCont群に比べ有意な増加を認めたが，その生成量はHCE細胞に比べ明らかに低値を示した．3.HCE細胞における高浸透圧ストレス負荷によるERK，JNKおよびp38MAPKリン酸化能とカテキン類の抑制効果図3にHCE細胞における高浸透圧ストレス負荷1時間後のERK（A），JNK（B），p38MAPK（C）のリン酸化能を示した．高浸透圧ストレス負荷によるERKリン酸化能の変化は認められなかった（n＝6）．高浸透圧ストレス負荷後1時間での，JNKおよびp38MAPKのリン酸化能はCont群と比較し有意に上昇した．JNKリン酸化能の上昇に対し，EGCGはいずれの濃度においても有意な抑制を示した（n＝12,p＜0.01）．一方，p38MAPKリン酸化能の上昇に対しては，EGCG3”Meで濃度依存的に有意な抑制を示した（n＝6,p＜0.01,0.05）が，EGCGは5μMで有意な抑制効果を示した（n＝6,p＜0.05）が，10,20μMでは変化は認められなかった．一方，HeLa細胞においては，高浸透圧ストレス負荷による，ERK，JNK，p38MAPKのリン酸化能に有意差は認めなかった．（ERK：Cont群1.525±0.058,Hyper群1.590±0.055；n＝6.JNK：Cont群1.472±0.075,Hyper群1.556±あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016869ABA2（％）1.8（％）#$1001001.690＊＊＊＊901.4Phosphop38/totalp38ratioPhosphoJNK/totalJNKratioPhosphoERK/totalERKratio＊＊80RateofApoptoticcells1.210.80.60.40.270605040303020200（μM）1010001361524Incubationtime（hours）HCEcellsHeLacellsBContHyper21.81.61.4図1高浸透圧ストレス負荷後のアポトーシス細胞の割合HCE細胞またはHeLa細胞における高浸透圧ストレス負荷後のアポトーシス細胞の割合を，MuseTMCellAnalyzerにてAnnexinVを用いて測定した．A：HCE細胞に対する高浸透圧ストレス負荷後1,3,6,15,24時間後のアポトーシス細胞の経時的変化．平均±標準偏差，n＝6，＊p＜0.05，＊＊p＜0.01vsCont（t検定）．B：高浸透圧ストレス負荷24時間後のHCE細胞とHeLa細胞におけるアポトーシス細胞の比較．平均±標準偏差，n＝3，#p＜0.01，＄p＜0.01vsCont（t検定）．AB＊＊1.2＊＊＊＊＊＊1＊＊0.80.60.40.20（μM）（pg/mL）（pg/mL）C24504501.81.61.41.2＊＊1＊＊0.8＊＊＊＊0.60.40.2400（24h）（24h）（24h）（24h）400$#350＊＊＊＊350300300IL-6levels2502502002001501501001005050000（1361524μM）Incubationtime（hours）HyperContHCEcellsHeLacells図2高浸透圧ストレス負荷後のIL.6生成量HCE細胞またはHeLa細胞における高浸透圧ストレス負荷後のIL-6生成量を，ELISA法を用いて測定した．A：HCE細胞に対する高浸透圧ストレス負荷後のIL-6生成量の1,3,6,15,24時間後の経時的変化．平均±標準偏差，n＝6．＊p＜0.05，＊＊p＜0.01vsCont（t検定）．B：高浸透圧ストレス負荷後24時間のHCE細胞とHeLa細胞におけるIL-6生成量の比較．平均±標準偏差，n＝3，#p＜0.01，＄p＜0.01vsCont（t検定）870あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016図3高浸透圧負荷1時間後のMAPK（ERK，JNK，p38MAPK）リン酸化能とカテキン類による抑制効果HCE細胞にMAPKi，EGCG（5,10,20μM），EGCG3Me（5,10,20μM）を添加し，1時間後に高浸透圧ストレスを負荷した．その後1時間インキュベートし，各MAPKのリン酸化能をELISA法にて測定した．結果は，全MAPKに対するリン酸化されたMAPKの割合で示した．A：ERKリン酸化能，B：JNKリン酸化能，C：p38MAPKリン酸化能．平均±標準偏差，n＝6.12，＊p＜0.05，＊＊p＜0.01vsHyper（ANOVA-Bonferroni多重比較検定）．（110）0350400450（pg/mL）＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊（ContHyperp38i（1）（10）EGCG（5）（10）（20）（5）（10）（20）0350400450（pg/mL）＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊（ContHyperp38i（1）（10）EGCG（5）（10）（20）（5）（10）（20）IL-6levels300250200150図4高浸透圧負荷後24時間後のIL.6生成量に対するカテキン類の抑制効果100HCE細胞にJNKi，p38MAPKi，EGCG（5,10,20μM），50EGCG3Me（5,10,20μM）を添加し，1時間後に高浸透圧ストレスを負荷した．その後24時間インキュベートし，培養液の上清を用い，ELISA法にてIL-6生成量を測定した．平均±標準偏差，n＝6．＊p＜0.05，＊＊p＜0.01vsHyper（ANOVA-Bonferroni多重比較検定）．μM）ContHyperEGCGEGCG3”Me図5高浸透圧ストレス負荷後1時間の67LRに対する免疫細胞染色HCE細胞に，EGCG（10μM）またはEGCG3Me（10μM）を添加し，1時間後に高浸透圧ストレスを負荷した．その後1時間インキュベートし，細胞をホルマリン固定後，ENVISION染色システムを用い，一次抗体として抗67LR抗体を2時間反応させた後，二次抗体とペルオキシダーゼが結合しているデキストランポリマー試薬を1時間反応させて，核や細胞質の染色を行った（×200）．（111）あたらしい眼科Vol.33，No.6，20168710.080；n＝6.p38MAPK：Cont群0.529±0.060,Hyper群0.529±0.014；n＝6）．4.HCE細胞における高浸透圧ストレス負荷24時間後のIL.6生成に対するカテキン類の抑制効果図4にHCE細胞における高浸透圧ストレス負荷24時間後のIL-6生成量に対するEGCG,EGCG3”Meの抑制効果を示した．高浸透圧ストレス負荷後24時間で，Cont群と比べIL-6生成量は有意に上昇した（n＝12,p＜0.01）．これに対しEGCG3”MeでIL-6生成量は濃度依存的に抑制され，20μMで有意な抑制効果を認めた（n＝6,p＜0.01）．一方，EGCGでは抑制効果は認められなかった．5.高浸透圧ストレス負荷による67LR発現誘導の免疫細胞染色図5にEGCGまたはEGCG3”Meを添加したHCE細胞における高浸透圧ストレス負荷1時間後の67LRの免疫細胞染色を示す．67LRは，カテキンの受容体として見出されている膜蛋白で6），EGCGで67LRの明らかな発現誘導が確認された．一方，EGCG3”Meではcontrolと比べ変化は認められなかった．III考按ドライアイ患者においては，涙液浸透圧とドライアイの重症度が相関するといわれている．米国でのドライアイ診断基準にあたるDryEyeWorkShop（DEWS）Reportによると，涙液浸透圧の正常カットオフ値は316mOsm/Lとされている2,7）．ドライアイ患者における涙液浸透圧は平均326.9±22.1mOsm/Lであり，健常人の平均302±9.7mOsm/Lに比べかなり高く7），涙液中に炎症性サイトカインが増加するという報告がある8,9）．角膜細胞を用いて塩化ナトリウムまたはスクロースを添加した培養液（350.600mOsm/L）を用いて高浸透圧ストレス負荷を施した報告が散見され，とくに450mOsm/L以上の高浸透圧負荷により，炎症性サイトカインの著明な上昇を認めたなどの報告10,11）がある．そこで今回，HCE細胞に高浸透ストレス負荷（423mOsm/L）を行った結果，アポトーシスの割合と，炎症性サイトカイン（IL-6）の生成量の経時的増加が確認され，炎症が惹起されていることが確認された．今回，データは示していないが，TNF-a，IL-1bも同様に測定した結果，TNF-a生成量は有意差はなく，IL-1bは検出限界以下であった．細胞外からの種々刺激により活性化され，核へのシグナル伝達を媒介するMAPKリン酸化能を測定した結果，高浸透圧ストレス負荷1時間でJNKとp38MAPKリン酸化能の有意な上昇が確認されたが，ERKでは変化が認められなかった．MAPKのなかでもとくに，JNK,p38MAPKは，UV，ROS（reactiveoxygenspecies），高浸透圧，熱ショックなどの物理化学的ストレスなどによって活性化されるストレス応答キナーゼで，アポト872あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016ーシス誘導などに深く関与している．今回の高浸透圧ストレス負荷により，HCE細胞ではJNK，p38MAPKの活性化およびIL-6生成量の明らかな増加が確認されたが，HeLa細胞においてはいずれも認めなかった．このことから，このストレスはHCE細胞に由来するものと判断し，カテキン類による抑制効果を検討した．近年，カテキン類を代表とする茶葉成分に関する研究報告が散見される．緑茶に含まれるEGCGは茶特有のポリフェノール成分で，他の植物には見出されていない4）．最近，新規カテキンのEGCG3”Meが見出された．日本緑茶の「べにふうき」「べにふじ」といった品種に多く含まれており，いわゆる代表的な品種である「やぶきた」にはまったく含まれていない．先にも述べたが，緑茶カテキンには多彩な生理機能が解明されており，なかでも，抗腫瘍作用や抗アレルギー作用は，EGCGが多種の細胞の細胞膜表面に局在している67kDalamininereceptor（67LR）に結合することで活性を示すことが報告されている6）．EGCGは67LRを介した癌細胞における細胞増殖抑制作用のほか，ヒト好塩基球細胞株におけるヒスタミン放出抑制作用やIgE受容体発現低下作用などが報告されている12）．今回のHCE細胞に対する高浸透圧ストレス負荷では，JNK，p38MAPKを介してIL-6を生成することで，炎症が惹起されていることが示唆された．この炎症に対する，EGCGまたはEGCG3”Meの抑制効果について検討した結果，JNKリン酸化能はEGCGで，p38MAPKリン酸化能はEGCG3”Meで抑制されることが示唆された．また，IL-6生成量はEGCG3”Meで濃度依存的に抑制されたのに対し，EGCGでは変化がないか高濃度では逆に増加する結果となった．これまでに，腫瘍細胞に対するEGCGの抗腫瘍効果なども報告されており12,13），高濃度のEGCGによる細胞障害作用が現れたものと考えられる．EGCGおよびEGCG3”Meを添加し，高浸透圧ストレス負荷1時間後，67LRの免疫細胞化学染色を行った結果，EGCG3”MeよりもEGCGで強い発現誘導が確認された．このことから，EGCGはおもに67LRへの結合を介してシグナル伝達されているのに対し，EGCG3”Meには67LRとは別の経路が関与していることが示唆された．すなわち，EGCG3”MeはEGCGに比べ脂溶性が高いことから，膜を直接透過する可能性が考えられる．以上のことから，それぞれ異なった細胞内シグナル伝達経路を介して抗炎症作用を示し，その作用はEGCGよりもEGCG3”Meのほうがより効果的である可能性が示唆された．Leeら14）は，0.1％EGCG溶液の点眼により角膜上皮障害が改善したと報告している．さらに，EGCGやEGCG3”Meは飲用後，血中への移行も確認されている．すなわち，毛細血管が豊富である結膜に移行し，眼表面の抗炎症作用を示す（112）可能性は高い．市販のペットボトル入りべにふうき緑茶を，約200ml飲用したときの摂取量とAUC（areaunderthebloodconcentration-timecurve）の割合で比較すると，移行の割合はEGCG3”MeのほうがEGCGに比べて6.5倍高いことが示されている15）．また，アレルギー性鼻炎患者を対象としたヒト介入試験において，EGCG3”Me摂取により眼の痒みや流涙を含む花粉症症状の明らかな軽減作用がみられたと報告されており，その際のEGCG3”Me摂取量は34mg/dayとされている16）．これは市販のペットボトル1.5本分（約750ml）の飲用に相当する．涙液浸透圧と血漿浸透圧に強い相関があり，飲水自体に涙液浸透圧を下げるとの報告17,18）があることから，日常的に茶を飲用する習慣がある日本人にはドライアイによる高浸透圧ストレス誘発炎症に対しても，抗炎症効果が期待できるかもしれない．以上のことから，べにふうき緑茶飲用がドライアイ治療に有用である可能性が示唆された．利益相反：利益相反公表基準に該当なし文献1）UchinoM,YokoiN,UchinoYetal：Prevalenceofdryeyediseaseanditsriskfactorsinvisualdisplayterminalusers：theOsakastudy.AmJOphthalmol156：759-766,20132）MichaelAL,GaryNF：Thedefinitionandclassificationofdryeyedisease.OculSurf5：75-92,20073）SternME,PflugfelderSC：Inflammationindryeye.OculSurf2：124-130,20044）山本（前田）万里：抗アレルギー効果のある茶葉成分．日本補完代替医療学雑誌3：53-60,20065）CavetME,HarringtonKL,VollmerTRetal：Antiinflammatoryandanti-oxidativeeffectsofthegreenteapolyphenolepigallocatechingallateinhumancornealepithelialcells.MolVis17：533-542,20116）TachibanaH,KogaK,FujimuraYetal：AreceptorforgreenteapolyphenolEGCG.NatStructMolBiol11：380381,20047）TomlinsonA,KhanalS,DiaperCetal：Tearfilmosmolarity-determinationofareferentfordryeyediagnosis.InvestOphthalmolVisSci47：4309-4315,20068）NaKS,MokJW,KimJYetal：Correlationsbetweentearcytokines,chemokines,andsolublereceptorsandclinicalseverityofdryeyedisease.InvestOphthalmolVisSci53：5443-5450,20129）BoehmN,RiechardtAI,WiegandMetal：Proinflammatorycytokineprofilingoftearsfromdryeyepatientsbymeansofantibodymicroarrays.InvestOphthalmolVisSci52：7725-7730,201110）LuoL,LiDQ,CorralesRMetal：Hyperosmolarsalineisaproinflammatorystressonthemouseocularsurface.EyeContactLens31：186-193,200511）LiDQ,ChenZ,SongXJetal：StimulationofmatrixmetalloproteinasesbyhyperosmolarityviaaJNKpathwayinhumancornealepithelialcells.InvestOphthalmolVisSci45：4302-4311,200412）立花宏文：緑茶カテキンの受容体とシグナリング．生化学81：290-294,200913）SuzukiY,MiyoshiN,IsemuraM：Health-promotingeffectsofgreentea.ProcJpnAcadSerBPhysBiolSci88：88-101,201214）LeeHS,ChauhanSK,OkanoboAetal：Therapeuticefficacyoftopicalepigallocatechingallate（EGCG）inmurinedryeye.Cornea30：1465-1472,201115）Maeda-YamamotoM,EmaK,ShibuichiI：Invitroandinvivoanti-allergiceffectsof‘benifuuki’greenteacontainingO-methylatedcatechinandgingerextractenhancement.Cytotechnology55：135-142,200716）安江正明，大竹康之，永井寛ほか：「べにふうき」緑茶の抗アレルギー作用並びに安全性評価：軽症から中等症の通年性アレルギー性鼻炎患者，並びに健常者を対象として．日本食品新素材研究会誌8：65-80,200517）WalshNP,FortesMB,Raymond-BarkerPetal：Iswhole-bodyhydrationanimportantconsiderationindryeye?InvestOphthalmolVisSci53：6622-6627,201218）FortesMB,DimentBC,DiFeliceUetal：Tearfluidosmolarityasapotentialmarkerofhydrationstatus.MedSciSportsExerc43：1590-1597,2011＊＊＊（113）あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016873

あたらしい眼科オンラインジャーナル » カテキン

培養ヒト結膜上皮細胞における高浸透圧ストレス負荷に対するカテキンの抑制効果