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網膜全剝離を伴った硝子体網膜リンパ腫の1例

admin — Fri, 29 Sep 2017 15:26:11 +0000

《原著》あたらしい眼科34（9）：1323.1326，2017c網膜全.離を伴った硝子体網膜リンパ腫の1例中井浩子＊1,3永田健児＊1稲葉亨＊2関山有紀＊1出口英人＊1,4外園千恵＊1＊1京都府立医科大学眼科学教室＊2京都府立医科大学感染制御・検査医学＊3京都市立病院＊4バプテスト眼科クリニックCACaseofPrimaryVitreo-retinalLymphomawithTotalRetinalDetachmentHirokoNakai1,3）C,KenjiNagata1）,TohruInaba2）,YukiSekiyama1）,HidetoDeguchi1,4）CandChieSotozono1）1）DepartmentofOphthalmology,KyotoPrefecturalUniversityofMedicine,2）DepartmentofInfectionControlandLaboratoryMedicine,KyotoPrefecturalUniversityofMedicine,3）KyotoCityHospital,4）BaptistEyeInstitute背景：硝子体網膜リンパ腫（VRL）はぶどう膜炎との鑑別が難しく，他疾患を合併すると診断はさらに困難となる．今回，裂孔原性網膜.離を合併したCVRLのC1例を経験したので報告する．症例：76歳，男性．1カ月前からの右眼視力低下を主訴に京都府立医科大学附属病院眼科を紹介受診した．右眼に強い硝子体混濁を認め，超音波検査で網膜.離が疑われたため，右眼に硝子体手術を施行した．裂孔原性網膜.離を認め，手術により復位を得た．手術時に採取した硝子体液を解析したところCB細胞性リンパ腫（CD19＋,CCD20＋,k＋）と考えられた．左眼にも軽度の硝子体混濁を認め，硝子体生検による細胞診の結果CclassVであり，両眼性CVRLと診断した．メトトレキサート硝子体注射を施行したが，3カ月後に中枢神経病変を発症し，全身化学療法を行った．結論：原因不明の硝子体混濁を認める症例では，網膜.離などの他疾患を合併していても硝子体液の解析を行う必要があると考えられた．CPurpose：ToCreportCaCcaseCofCprimaryCvitreo-retinalClymphoma（VRL）withCrhegmatogenousCretinalCdetach-ment（RD）C.Case：A76-yearoldmanpresentedwithaone-monthhistoryofreducedvisioninhisrighteye.Slit-lampCexaminationCrevealedCsevereCvitreousCopacity.CUltrasonographyCrevealedCRD.CParsCplanaCvitrectomy（PPV）wasperformedontherighteyeandavitreoussamplewasobtained.Flowcytometryrevealedthat58.4％ofana-lyzedCcellsCwereCCD19＋andC24.6％CwereCCD20＋andCimmunoglobulinCkappaClightCchain＋.COnCtheCbasisCofCtheseresults,wediagnosedB-cellVRL.PPVwasperformedonthelefteye；avitreoussamplewasobtainedandcatego-rizedasclassVbasedoncytologicexamination.ThepatientwasdiagnosedashavingbinocularVRL,andtreatedwithCintravitrealCmethotrexateCinjection.CHowever,CcentralCnervousCsystemClymphomaCdevelopedCandCheCreceivedCsystemicchemotherapy.Conclusion：Vitreous.uidanalysisisimportantincasesinvolvingvitreousopacity,evenwhenRDisobserved.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）C34（9）：1323.1326,C2017〕Keywords：硝子体網膜リンパ腫，裂孔原性網膜.離，フローサイトメトリー解析，サイトカイン，インターロイキンC10．primaryvitreo-retinallymphoma,rhegmatogenousretinaldetachment,.owcytometricanalysis,cytokine,interleukin-10.Cはじめに硝子体網膜リンパ腫（vitreo-retinalClymphoma：VRL）は一見臨床所見がぶどう膜炎と類似していることがあるため，早期診断が容易ではなく，眼症状の出現からCVRLの診断まで平均C1年以上の時間を要しているとの報告がある1）．また，VRLのほとんどは，非CHodgkinリンパ腫のなかで中悪性度に分類されるびまん性大細胞型CB細胞性リンパ腫である．VRLはC60.90％に中枢神経病変を合併し2），その場合のC5年生存率はC30.60％と極めて生命予後不良であり1,3），見逃しに注意が必要な疾患である．以前は極めてまれな疾患とされてきたが，近年は世界的にも発症率の増加が報告されている．わが国においても大学病院を対象とした調査において全ぶどう膜炎のうちのC2.5％を占めることが判明しており4），原因不明の硝子体混濁を認めた際には鑑別疾患として常に注意する必要がある．VRLは，硝子体混濁を主徴とする症例，網膜下浸潤病巣〔別刷請求先〕中井浩子：〒602-8566京都府京都市上京区河原町通広小路上る梶井町C465京都府立医科大学眼科学教室Reprintrequests：HirokoNakai,M.D.,DepartmentofOphthalmology,KyotoPrefecturalUniversityofMedicine,465Kajii-cho,Kamigyo-Ku,KyotoCity,Kyoto602-8566,JAPAN0910-1810/17/\100/頁/JCOPY（111）C1323を形成する症例に大別され，両者が混在している場合も多い．硝子体混濁のみの場合はぶどう膜炎との鑑別が難しく，仮面症候群ともよばれる．VRLの診断には硝子体液の解析が重要であり，細胞診，polymeraseCchainCreaction（PCR）法による免疫グロブリン重鎖（IgH）遺伝子再構成，サイトカイン解析によるインターロイキン（IL）-10/IL-6の比，フローサイトメトリーによる浸潤細胞の解析などを行い，総合的に判断して診断する．特にサイトカイン解析においてCVRLではCIL-10/IL-6比がC1.0を超えるとされ，診断に有用であることが報告されている5）．また，筆者らは硝子体液のフローサイトメトリー解析がぶどう膜炎の診断や病態の把握において有用であることを報告しており6），硝子体混濁のある症例については常に解析を行っている．今回筆者らは，フローサイトメトリー解析をきっかけに診断できた網膜全.離を伴ったCVRLのC1例を経験したので報告する．CI症例患者：76歳，男性．主訴：右眼視力低下．既往歴：62歳時に両眼白内障手術，66歳時に右眼網膜裂孔に対して右網膜光凝固術の既往があった．家族歴：特記事項なし．現病歴：1カ月前から徐々に右眼の視力低下を自覚し，2012年C5月に近医を受診した．両眼，特に右眼に強いぶどう膜炎を認め，翌日京都府立医科大学附属病院眼科に紹介受診となった．初診時所見：視力は右眼手動弁（矯正不能），左眼C0.3（0.6C×sph.0.75D（cyl.0.5DAx90°）で，眼圧は右眼C3mmHg，図1右眼の超音波B.mode検査画像硝子体混濁と視神経乳頭につながるラインがみられ，網膜全.離が疑われる．左眼C10CmmHgであった．前眼部所見では，右眼に角膜後面沈着物と前房内細胞を認めたが，左眼には異常を認めなかった．眼底所見では，右眼は高度の硝子体混濁により眼底透見不良であり，左眼には前部硝子体中細胞と軽度の硝子体混濁を認めた．超音波CB-mode検査を施行したところ，右眼の網膜全.離が疑われた（図1）．経過：右眼は硝子体混濁が強く網膜の詳細な観察は不可能であったが，超音波所見および低眼圧であることから網膜.離が疑われ，初診の翌日に右眼経毛様体扁平部硝子体切除術を施行した．術中所見として，強い硝子体混濁と網膜裂孔を伴う網膜全.離，脈絡膜.離の所見を認めた．原因裂孔は，過去に光凝固を施行された部位とは別の部位にみられ，網膜周辺部には多数の変性部位を認めた．硝子体サンプルを採取のうえ，通常どおり網膜.離に対する処理を行い，初回手術により復位を得た．術中に採取した硝子体液中の浮遊細胞をフローサイトメトリーで解析したところ，CD45（白血球共通抗原）陽性細胞のうちC58.4％およびC24.6％が汎CBリンパ球抗原であるCCD19およびCCD20を発現し，さらに表面免疫グロブリンCk鎖の軽鎖制限を認め，B細胞性リンパ腫が強く疑われた（図2）．一方，サイトスピン標本では好塩基性の細胞質としばしば著明な核不整を示す大型異型細胞を認め，形質細胞も散見され（図3）（注：本症例の形態所見はすでに他誌に報告した7）），classCVであった．IgH遺伝子再構成は陰性であった．また，硝子体中のサイトカインを分析したところ，IL-6はC19,800Cpg/ml，IL-10はC2,750Cpg/mlで，IL-10/IL-6比はC1.0未満であった．左眼にも軽度の硝子体混濁を認めたため，6月に左眼経毛様体扁平部硝子体切除術を施行した．細胞診ではCclassVであり，サイトカイン解析ではCIL-6がC122Cpg/ml，IL-10がC295Cpg/mlとCIL-10/IL-6比がC1.0を超えていた．IgH遺伝子再構成は陰性であった．フローサイトメトリー解析は細胞数が少なく解析不能であった．右眼のフローサイトメトリー解析結果と硝子体液浮遊細胞の病理所見，IL-10の濃度，左眼の細胞診所見とサイトカイン解析結果を総合し，両眼性のCVRLと診断した．頭部magneticCresonanceCimaging（MRI），positronCemissiontomography-computedCtomography（PET-CT）では異常なく，髄液検査における細胞診でもCclassCIIであり，中枢神経系の病変を認めなかった．76歳と高齢であったため，全身化学療法を行わず，京都府立医科大学倫理審査員会承認のもと，両眼にメトトレキサート硝子体注射を開始した．しかし，同年C8月頃より歩行困難となり，9月初旬には起立できなくなり，尿閉や失禁も出現した．髄液検査における細胞診はCclassCIIであったが，頭部CMRIにて前頭蓋底に病巣の出現を認め，悪性リンパ腫の中枢神経病変と診断された．10月より全身化学療法が開始され，中枢神経病変はいったん消失したが，再発を繰り返し，その後転院となった．1324あたらしい眼科Vol.34，No.9，2017（112）図2右眼の硝子体液フローサイトメトリー解析結果SideCscatterCxCforwardCscatterの二次元サイトグラム上でCdebrisを除いたところ（Ca），浮遊細胞のC36.0％は白血球共通抗原であるCCD45陽性であった（Cb）．CD45陽性細胞のうちC58.4％およびC24.6％が汎CBリンパ球抗原であるCCD19およびCCD20を発現し（Cd,e），さらに表面免疫グロブリンCk鎖の軽鎖制限（kappa28.6％：lambda0.6％）を認めた（Cf）．CII考察VRLは，霧視や飛蚊症，硝子体混濁のみが症状の場合，ぶどう膜炎との鑑別が難しいため早期診断が容易ではない．しかし，VRLは高率に中枢神経病変を合併し生命予後に関わるため，見逃しに注意すべき疾患の一つであり，適切に診断することが求められる．今回筆者らは裂孔原性網膜.離を合併したCVRLのC1例を経験したが，網膜裂孔による硝子体内の細胞浮遊があり，さらに硝子体混濁が非常に高度であったため術前に原因疾患を特定することが困難であった．網膜.離出現から時間が経過した場合，硝子体内の炎症が強くなることも考えられる．本症例では視力低下はC1カ月前から出現しており，すでに低眼圧となっていたことから，術前には網膜.離に伴う炎症の可能性も考えられた．このような症例においては，硝子体解析を行わずに網膜.離の手術を施行される可能性がある．原因不明のぶどう膜炎に対する硝子体手術において，筆者らは京都府立医科大学倫理審査委員会の承認のもとに常に硝子体液のフローサイトメトリー解析を行っており，本症例でもフローサイトメトリー解析と硝子体浮遊細胞の病理所見をきっかけにCVRLの診断に至った．VRLの診断においてフローサイトメトリーによる浸潤細胞の表面マーカー解析は高い感度と特異度を持っている8）．網膜.離の合併によって眼所見がマ図3右眼の硝子体液浮遊細胞のサイトスピン塗抹標本（May.Giemsa染色）好塩基性の細胞質としばしば著明な核不整を示す大型異型細胞を多数認め，形質細胞も散見された．スクされていても，ルーチンとして硝子体液の解析を行うことでCVRLの見逃しを減らすことができると考えられる．VRLにおいてはC82.92％の症例で硝子体液中のCIL-10/IL-6比がC1.0を超えることが報告されており，サイトカイン解析は診断において有用性が高い3,9,10）．本症例では網膜全（113）Cあたらしい眼科Vol.34，No.9，2017C1325.離を伴っていた右眼の硝子体液中のCIL-10/IL-6比はC1.0未満であったが，VRLの存在を示唆するCIL-10はC2,750Cpg/mlと非常に高値であった．VRLではCIL-10/IL-6比以外にもCIL-10の濃度がC100Cpg/ml以上であることも重要な所見であることが報告されており9），本症例もこれには合致する．網膜.離では硝子体液中のCIL-6が増加するという報告があるが11,12），今回は網膜全.離による眼内炎症が高度であったため，炎症性サイトカインが修飾され，IL-6が異常高値となったことがCIL-10/IL-6比がC1.0未満となった原因と考えられる．このように網膜.離を伴ったCVRLではCIL-10/IL-6比がC1.0未満となることがあるため，診断に注意が必要である．本症例においてCVRLと網膜.離の関連は明らかではないが，裂孔を伴っていたことから，VRLによる滲出性網膜.離ではなく，裂孔原性網膜.離を合併したと考えられた．本症例では以前に右眼網膜裂孔に対して網膜光凝固術の既往があったが，今回の原因裂孔は以前治療された裂孔とは別のものであり，術中所見として網膜周辺部変性を多数認めた．VRLによって硝子体の収縮が生じ，周辺の変性部の網膜を牽引することで裂孔が形成され，網膜.離に至った可能性は考えられる．また，VRLに伴う強い硝子体混濁によって網膜.離の症状が不明瞭となり，網膜全.離に至るまで発見が遅れた可能性がある．漿液性網膜.離を認めたCVRLの報告はあるが13,14），筆者らの知る限りCVRLと裂孔原性網膜.離の合併例の報告はない．VRLを疑って硝子体液の解析を行わなかった場合，網膜.離として治療されている症例のなかにCVRLが見逃されてしまっている症例が含まれる可能性は考えられる．VRLにおいて致命的となるのは中枢神経病変の出現であるが，いまだ中枢神経病変の予防可能な治療方法は確立されておらず，現時点ではメトトレキサートの眼局所投与あるいは全身投与が行われていることが多く，施設によっては放射線療法も行われている．しかし，患者が高齢の場合，メトトレキサートの全身投与や放射線療法は副作用が多く，合併症である白質脳症の出現頻度も高まるため，VRLの診断がついた時点で中枢神経に病変を認めなければ眼局所の治療のみとなる場合が多い．本症例においても，VRLを認めた時点で中枢神経病変の所見はなく，76歳と高齢であったために，患者やその家族と相談のうえでメトトレキサートの眼局所投与のみの治療選択となったが，そのC3カ月後には中枢神経病変の出現を認めた．VRLの症例では，常に中枢神経病変の合併に注意して慎重な経過観察を行う必要がある．以上のように，網膜.離などの他疾患との合併によって眼所見が修飾されている場合であっても，原因不明の硝子体混濁を伴う症例においては硝子体液の解析を積極的に行うことで，VRLの見逃しを減らすことができると考えられる．特1326あたらしい眼科Vol.34，No.9，2017にフローサイトメトリー解析は硝子体中のリンパ球の種類や細胞表面マーカーの発現における偏りも解析することが可能であり，VRLを含めた硝子体混濁の原因を検討するうえで有用である．文献1）ChanCC,RubensteinJL,CouplandSEetal：Primaryvit-reoretinalClymphoma：aCreportCfromCanCinternationalCpri-maryCcentralCnervousCsystemClymphomaCcollaborativeCgroupsymposium.OncologistC16：1589-1599,C20112）BaehringCJM,CAndroudiCS,CLongtineCJJCetCal：AnalysisCofCclonalimmuneheavychainrearrangementsinocularlym-phoma.CancerC104：591-597,C20053）KimuraCK,CUsuiCY,CGotoCHCetCal：ClinicalCfeaturesCandCdiagnosticCsigni.canceCofCtheCintraocularC.uidCofC217CpatientsCwithCintraocularClymphoma.CJpnCJCOphthalmolC56：383-389,C20124）OhguroN,SonodaKH,TakeuchiMetal：The2009pro-spectiveCmulti-centerCepidemiologicCsurveyCofCuveitisCinCJapan.JpnJOphthalmolC56：432-435,C20125）FissonS,OuakrimH,TouitouVetal：Cytokinepro.leinhumaneyes：ContributionofanewcytokinecombinationforCdi.erentialCdiagnosisCbetweenCintraocularClymphomaCoruveitis.PLoSOneC8：e52385,C20136）KojimaCK,CMaruyamaCK,CInabaCTCetCal：TheCCD4/CD8CratioCinCvitreousC.uidCisCofChighCdiagnosticCvalueCinCsar-coidosis.OphthalmologyC119：2386-2392,C20127）InabaCT,CNagataCT,CMaruyamaCK：PrimaryCintraocularClargeCBCcellClymphomaCwithCplasmacyticCdi.erentiation.CIntJHematolC96：399-400,C20128）ZaldivarRA,MartinDF,HoldenJTetal：Primaryintra-ocularClymphoma：clinical,Ccytologic,CandC.owCcytometricCanalysis.OphthalmologyC111：1762-1767,C20149）SugitaS,TakaseH,SugamotoYetal：Diagnosisofintra-ocularClymphomaCbyCpolymeraseCchainCreactionCanalysisCandcytokinepro.lingofthevitreous.uid.JpnJOphthal-molC53：209-214,C200910）WangY,ShenD,WangVMetal：Molecularbiomarkersforthediagnosisofprimaryvitreoretinallymphoma.IntJMolCSciC12：5684-5697,C201111）KenarovaB,VoinovL,ApostolovCetal：Levelsofsomecytokinesinsubretinal.uidinproliferativevitreoretinopa-thyCandCrhegmatogenousCretinalCdetachment.CEurCJCOph-thalmol7：64-67,C199712）YoshimuraT,SonodaKH,SugaharaMetal：Comprehen-siveanalysisofin.ammatoryimmunemediatorsinvitreo-retinaldisease.PLoSOne4：e8158,C200913）曽我拓嗣，稲用和也，戸塚清人ほか：漿液性網膜.離を主症状とした眼内悪性リンパ腫のC1例．あたらしい眼科C33：C427-431,C201614）山本紗也香，杉田直，岩永洋一ほか：メトトレキセート硝子体注射が著効した滲出性網膜.離を伴う網膜下増殖型のびまん性大細胞型CB細胞リンパ腫の1例．臨眼C62：C1495-1500,C2008C（114）

培養角膜上皮細胞のサイトカイン遺伝子発現に対するマルチパーパスソリューションの影響

admin — Sun, 30 Nov 2008 09:04:40 +0000

———————————————————————-Page1（97）15670910-1810/08/\100/頁/JCLSあたらしい眼科25（11）：15671572，2008cはじめに最近，ソフトコンタクトレンズ（SCL）ユーザーでの細菌性角膜炎の発症が問題になっており1），マルチパーパスソリューション（MPS）の使用との関連性が議論されている2）．細菌性角膜炎の原因としては，MPSの不十分な殺菌効力3）やユーザーのコンプライアンスの低さ4）などが想定されるが，MPSの細胞毒性が角膜上皮細胞に及ぼす影響も考慮に入れる必要がある．柳井ら5）は14種類の市販MPSを比較し，主成分が同じポリヘキサメチルビグアニド（PHMB）であっても，添加剤の種類によって細胞毒性や殺菌効力が大きく異なることを報告した．一方，角膜上皮細胞は外傷を受けるなどのストレス状態にさらされると炎症性細胞を誘導するためにサイトカインを分泌することが知られている6）．毒性の強いMPSの使用は角膜にストレスを与えると考えられる〔別刷請求先〕今安正樹：〒487-0032愛知県春日井市高森台5-1-10（株）メニコン総合研究所Reprintrequests：MasakiImayasu,Ph.D.,CentralR&DLab.,MeniconCo.,Ltd.,5-1-10Takamoridai,Kasugai-shi,Aichi-ken487-0032,JAPAN培養角膜上皮細胞のサイトカイン遺伝子発現に対するマルチパーパスソリューションの影響今安正樹＊1,3白石敦＊2大橋裕一＊2島田昌一＊3＊1（株）メニコン総合研究所＊2愛媛大学医学部眼科学教室＊3名古屋市立大学医学部第2解剖学講座EectsofMultipurposeSolutionsonCytokineGeneExpressionofCornealEpithelialCellsMasakiImayasu1,3）,AtsushiShiraishi2）,YuichiOhashi2）andShoichiShimada3）1）CentralR&DLab.,MeniconCo.,Ltd.,2）DepartmentofOphthalmology,SchoolofMedicine,EhimeUniversity,3）DepartmentofAnatomy,NagoyaCityUniversityMedicalSchool目的：コンタクトレンズ用マルチパーパスソリューション（MPS）の角膜への影響を明確にするため，角膜上皮細胞を市販MPSまたは配合成分で処理したときのサイトカイン遺伝子発現量および産生量を解析する．方法：培養ヒト角膜上皮細胞を用い，7種のMPSまたは配合成分を添加した培養液で3，6，24時間培養した．RNAを抽出し，サイトカイン遺伝子〔インターロイキン（IL）-8，トランスフォーミング増殖因子（TGF）-b2，IL-18，IL-1b，IL-6〕発現量をreal-timepolymerasechainreaction（PCR）法で，培養上清中のサイトカイン産生量を抗体アレイで定量した．結果：ホウ酸を含むMPSではIL-8，TGF-b2，IL-18，IL-6の発現量が36時間後に増加し，その後減少した．これらのMPSでは24時間後のIL-8産生量も増加した．配合成分のなかでは，ホウ酸のみがサイトカイン遺伝子発現量を増加させた．結論：MPSの配合成分であるホウ酸が炎症性サイトカインの産生に関与している可能性が示された．Inordertoclarifytheeectsofmultipurposesolutions（MPS）onthecornea,weanalyzedthecytokinegeneexpressionandproteinlevelofcornealepithelialcellstreatedwithMPSoringredients.Humancornealepithelialcellswereculturedfor3,6or24hoursinmediumcontainingcommerciallyavailableMPSoringredients.AfterRNAextraction,geneexpressionsofinterleukin（IL）-8,transforminggrowthfactor（TGF）-b2,IL-18,IL-1bandIL-6wereanalyzedbyreal-timepolymerasechainreaction（PCR）.Proteinlevelsweredeterminedbyantibodyarray.MPScontainingboricacidcausedup-regulationofIL-8,TGF-b2,IL-18andIL-6after3and6hours,whichthendecreasedat24hours.TheMPSalsopromotedIL-8productionduring24hour-incubation.Oftheingredientstested,onlyboricacidhadsignicanteectsongeneandproteinexpressionsofinammatorycyto-kines.Theseresultsdemonstratethatboricacidmayhavesignicanteectoninammatorycytokineproductionincornealepithelialcells.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）25（11）：15671572,2008〕Keywords：角膜上皮細胞，サイトカイン，マルチパーパスソリューション，コンタクトレンズ．cornealepithelialcells,cytokine,multipurposesolution,contactlens.———————————————————————-Page21568あたらしい眼科Vol.25，No.11，2008（98）ため，サイトカイン遺伝子の発現量が増加する可能性が想定される．角膜上皮細胞のサイトカイン遺伝子発現を解析することにより，角膜へのストレスを高感度で定量的に評価できる方法が構築できると思われる．そこで本論文では，ヒト角膜上皮細胞を，種々のMPS製品または配合成分を添加した培養液で培養し，MPSまたは配合成分を添加しない培養液で培養した場合とのサイトカイン遺伝子の発現量の差をreal-timepolymerasechainreac-tion（PCR）法により定量的に解析した．また，蛋白質レベルでの評価のため，培養液中のサイトカイン産生量を抗体アレイで定量した．I実験材料および方法1.実験材料実験に使用したMPSとおもな配合成分を表1に示す．MPS-AからMPS-Gまでの7種類の市販MPSを用いた．主成分の殺菌剤にはPHMB，AlexidineまたはPolyquadが使用されている．このなかでMPS-AとMPS-B以外は緩衝剤としてホウ酸を含む．配合成分単独での実験に使用した成分名，濃度などを表2に示す．MPSに一般的に使用されている界面活性剤，殺菌剤，緩衝剤を実際の配合濃度に近い濃度で使用した．2.実験方法a.培養細胞の準備培養細胞として，SV40ウイルス感染により不死化したヒト角膜上皮細胞（以下，HCET細胞）7）を理化学研究所細胞バンクより購入して使用した．HCET細胞を6cm組織培養用ディシュにコンフルエントになるまで培養した．培養液はDMEM/F12（GIBCO）＋5％ウシ胎仔血清（FBS）（GIBCO）を用いた．血清無添加の培養液に各種MPSまたは配合成分を10％添加した試験液を準備し，組織培養用ディシュに4ml添加して37℃，5％CO2で3，6，24時間培養した．b.培養細胞からのRNAの抽出および定量組織培養用ディシュの培養液を捨て，冷PBS（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄後，1mlのTRIZOLR試薬（invitrogen）を添加した（氷冷下）．セルスクレーパーを用いてディシュ表面に付着している細胞を離させた（氷冷下）．20ゲージの注射針を取り付けた2.5mlのシリンジで，TRIZOLR試薬の吸引を20回程度くり返した後，1.5mlのマイクロチューブに回収した．以下，TRIZOLR試薬の取扱説明書に従ってtotalRNAを精製し，30μlのDEPC（diethylpyrocarbonate）処理水に溶解させた．c.逆転写反応およびrealtimereversetranscription（RT）PCRパーソナルスペクトルモニター（AmershamBiosciences，GeneQuantpro）で260nmの吸光度を測定することによりRNA濃度を定量し，サンプル濃度を800ng/μlに調整した．PrimeScriptTMRTreagentsKit（TaKaRa）の取扱説明書に従い，50μlの反応系にてcDNAに変換した．つぎに，SYBRRPremixExTaqTM（TaKaRa）の取扱説明書に従い，25μlの反応系にてreal-timePCRを行った（TaKaRa，表2実験に使用したMPS配合成分配合成分種類濃度製造元HCO界面活性剤1.0％日光ケミカルズTetronic1107界面活性剤1.0％BASFJapanPoloxamer407界面活性剤1.0％BASFJapanAlexidine殺菌剤1ppmTrontoResearchPHMB殺菌剤1ppmアーチケミカルズホウ酸（Boricacid）緩衝剤0.5％日興製薬1.0％表1実験に使用した市販MPSMPS殺菌剤界面活性剤ホウ酸の有無MPS-APHMB＊HCO＊＊MPS-BPHMBPoloxamerMPS-CPHMBTetronic＋MPS-DAlexidinePoloxamer/Tetronic＋MPS-EPolyquadTetronic＋MPS-FPolyquadTetronic＋MPS-GPHMB不明＋＊PHMB：polyhexamethylbiguanid.＊＊HCO：PEGhydrogenatedcastoroil.表3RealtimeRTPCRに使用したプライマーペアの塩基配列ヒト遺伝子F/Rプライマー塩基配列b-actinFATTGCCGACAGGATGCAGARGAGTACTTGCGCTCAGGAGGAIL-8FAAGGAACCATCTCACTGTGTGTAAACRATCAGGAAGGCTGCCAAGAGTGF-b2FGGATGCGGCCTATTGCTTTARCATTTCCACCCTAGATCCCTCTTIL-18FGCCACCTGCTGCAGTCTACARATCTGGAAGGTCTGAGGTTCCTTIL-1bFCCTCTGGATGGCGGCARTGCCTGAAGCCCTTGCTGIL-6FAAAAAGGCAAAGAATCTAGATGCAARGTCAGCAGGCTGGCATTTGTFはセンス，Rはアンチセンスを示す．———————————————————————-Page3あたらしい眼科Vol.25，No.11，20081569（99）TP800）．サイトカインとしてIL-8，TGF-b2，IL-18，IL-1b，IL-6の5種類の遺伝子の発現量を解析した．ハウスキーピング遺伝子としては，角膜上皮細胞での発現量が安定なb-actinを選択し（予備実験で確認），b-actin発現量に対する各遺伝子の相対発現量を求めた．さらに，各遺伝子について，MPS（または配合成分）処理群に対するPBS（＋）処理群の相対発現量の比を求め，これを指標とした．なお，各サイトカイン遺伝子およびb-actinのreal-timePCR用プライマーはNCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation）の遺伝子データベースよりmRNAの塩基配列を検索し，PrimerExpress（AppliedBio）でプライマーペア候補を検索し，イントロンをはさんだ配列を選択して，SigmaGenosys社に合成を依頼した．プライマーペアの塩基配列を表3に示す．なお，実験は独立して3回くり返し，平均値と標準偏差を求めた．d.抗体アレイによる培養上清のサイトカイン産生量の定量24時間培養した細胞については培養液を回収し，そのままサイトカイン産生量定量に供試した．アレイ基板としてBS-X1324（住友ベークライト）を使用し，抗ヒトIL-8マウスモノクローナル抗体（BIOSORCE），抗ヒトIL-6マウスモノクローナル抗体（ENDOGEN），抗ヒトTGF-b2マウスモノクローナル抗体（RDS）のプロットを住友ベークライトに依頼した．抗体アレイチャンバー（GenTel，12well）に抗体アレイを固定し，培養液を50μl添加して室温で1時間振盪した．PBSで洗浄後，3種類のサイトカインに対するビオチン化抗体混合液〔抗ヒトIL-8ビオチン化抗体（BIO-SOURCE），抗ヒトIL-6ビオチン化抗体（ENDOGEN），抗ヒトTGF-b2ビオチン化抗体（RDS）〕を調整し，50μl添加して室温で1時間振盪した．PBSで洗浄後，Cy5標識ストレプトアビジン（JacksonImmunoResearch）50μlを添加し，室温で1時間振盪した．PBSで洗浄後，乾燥させ，アレイスキャナー（GSILuminocs，ScanArray5000）でCy5蛍光画像を取得した．各プロットの蛍光強度をアレイ用画像処理ソフト（ScanAlyze）で数値化した．各サイトカインの標準液としてヒトIL-8（Acris），ヒトIL-6（Acris），ヒトTGF-b2（Acris）を5，10，20，40，80pg/mlに調整して用いた．なお，実験は独立して3回くり返し，平均値と標準偏差を求めた．II結果a.サイトカイン遺伝子発現に対するMPSの影響MPSで3，6および24時間処理したときの対照〔PBS（＋）〕に対するサイトカイン遺伝子発現比を図1a，bおよびcに示す．MPS処理3時間後ではMPS-CGでIL-8が35.030.025.020.015.010.05.00.0MPS-AMPS-BMPS-CMPS-DMPS-EMPS-FMPS-GExpressionratio：IL-8：TGF-b2：IL-18：IL-1b：IL-6図1aMPSで3時間処理したHCET細胞のサイトカイン遺伝子発現比対照〔PBS（＋）〕に対する発現比を示す．25.020.015.010.05.00.0MPS-AMPS-BMPS-CMPS-DMPS-EMPS-FMPS-GExpressionratio：IL-8：TGF-b2：IL-18：IL-1b：IL-6図1cMPSで24時間処理したHCET細胞のサイトカイン遺伝子発現比対照〔PBS（＋）〕に対する発現比を示す．45.040.035.030.025.020.015.010.05.00.0MPS-AMPS-BMPS-CMPS-DMPS-EMPS-FMPS-GExpressionratio：IL-8：TGF-b2：IL-18：IL-1b：IL-6図1bMPSで6時間処理したHCET細胞のサイトカイン遺伝子発現比対照〔PBS（＋）〕に対する発現比を示す．———————————————————————-Page41570あたらしい眼科Vol.25，No.11，2008（100）約1025倍に増加した．TGF-b2およびIL-6も増加した．一方，MPS処理6時間後においても，MPS-CGではIL-8が高いレベルを維持したが，特にMPS-EGが約20倍高い発現量を示した．MPS-EおよびMPS-FではIL-6が約2030倍に増加した．MPS処理24時間後においては，全体的にサイトカイン発現比はかなり回復し，特にMPS-Cではほぼ正常レベルになった．MPS-DGではIL-8は回復したが，IL-18とIL-6が約510倍高いレベルを維持していた．すべての処理時間において，MPS-AおよびBではすべてのサイトカイン遺伝子に関し，発現量の増加は認められなかった．すべてのMPS処理において，IL-1bの発現量増加は認められず，IL-8の発現量増加をもたらしたMPS-CGではむしろ発現量が減少する傾向を示した．b.サイトカイン産生量に対するMPSの影響培養24時間で産生されたサイトカイン（IL-8，TGF-b2およびIL-6）を抗体アレイで定量した結果を図2に示す．対照のPBS（＋）でのサイトカイン産生量はIL-8が0.5±0.2pg/ml，TGF-b2が4.3±1.3pg/ml，IL-6が0.3±0.2pg/mlであった．対照と比較してMPS-Aではサイトカイン産生量の増加は認められなかったが，MPS-BおよびCではTGF-b2の増加が認められた．MPS-D，EおよびGでは3種のサイトカインすべてが増加した．MPS-FではIL-8が増加した．全体的にサイトカイン産生量が最も大きく増加したのはMPS-Eであった．c.サイトカイン遺伝子発現に対する配合成分の影響図1で示されたMPSによるサイトカイン遺伝子発現量の増加がMPSのどの配合成分によるかを明確にするため，配合成分単独での遺伝子発現に対する影響を検討した．配合成分処理3時間および24時間後の結果を図3aおよび3bに示す．3時間処理では，配合成分のなかでホウ酸のみがIL-8，TGF-b2，IL-6発現量を増加させ，1％濃度ではそれぞれ約45倍，5倍，15倍となった．24時間後では1％ホウ酸の効果は3時間と比較してかなり回復したが，IL-8およびIL-6はまだ高いレベルを維持しており，IL-18発現量への影響もみられた．1％HCOは0.5％ホウ酸と同程度の効果を示した．d.サイトカイン産生量に対する配合成分の影響配合成分単独で24時間作用させたときのサイトカイン産生量への影響を検討した結果を図4に示す．界面活性剤60.050.040.030.020.010.00.0：IL-8：TGF-b2：IL-6pg/m?MPS-APBS（＋）MPS-BMPS-CMPS-DMPS-EMPS-FMPS-G図2MPSで24時間処理したHCET細胞のサイトカイン産生量b2：IL-18：IL-1b：IL-6図3a配合成分で3時間処理したHCET細胞のサイトカイン遺伝子発現比対照〔PBS（＋）〕に対する発現比を示す．20.015.010.05.00.0Expressionratio1％HCO1％Tetronic1％Poloxamer1ppmAlexidine1ppmPHMB0.5％Boricacid1.0％Boricacid：IL-8：TGF-b2：IL-18：IL-1b：IL-6図3b配合成分で24時間処理したHCET細胞のサイトカイン遺伝子発現比対照〔PBS（＋）〕に対する発現比を示す．———————————————————————-Page5あたらしい眼科Vol.25，No.11，20081571（101）（HCO，TetronicおよびPoloxamer）および殺菌剤（Alexi-dineおよびPHMB）はTGF-b2産生量を有意に増加させた．ホウ酸は濃度依存的にIL-8産生量を増加させ，1％濃度では約70pg/mlにも達した．TGF-b2産生量への影響も認められた．III考按今回，ヒト角膜上皮細胞へのMPS投与で変化する可能性のあるサイトカイン遺伝子としてIL-8，TGF-b2，IL-18，IL-1b，IL-6を採択した．予備実験においてはその他のサイトカインとしてIL-1a，IFN-g，TNF-aなども検討したが，変化が少なかったため対象から除外した．MPSの影響としては，3時間後にIL-8が，6時間後にIL-8に加えてIL-6が，24時間後にはIL-6とTGF-b2の発現量増加が目立った．IL-8およびIL-6が増加したMPSでは，IL-1bの発現量が減少していた．Xueら8）が報告しているように，IL-1はIL-6やIL-8などの炎症性サイトカインの産生を促進する急性的サイトカインであるため，IL-6・IL-8の増加によるフィードバック制御によって，経時的に発現量が下がったと考えられる．TGF-b2は角膜上皮細胞の増殖，遊走，分化，接着制御など多くの生理作用をもつサイトカインであり，角膜上皮創傷治癒過程において発現量が増加することが知られている9）．また，IL-18はマウス角膜に緑膿菌を感染させたときに，24時間後以降に発現量が増加することが知られている10）．今回の実験においては，TGF-b2とIL-18は624時間と長時間作用させた場合に発現量が増加しており，外傷や細菌感染などの重篤な障害で初めて発現するサイトカインと考えられる．7種類のMPSを比較すると，MPS-AおよびMPS-Bではサイトカイン遺伝子の変化が認められなかったが，MPS-C，MPS-D，MPS-E，MPS-FおよびMPS-GではIL-8，TGF-b2，IL-6において顕著な発現量増加を示した．前2者のMPSがホウ酸を含まないのに対し，後5者がホウ酸を含むことより，ホウ酸がサイトカイン遺伝子発現に関与した可能性が考えられる．そこで，代表的なMPS配合成分7種類を選択してサイトカインへの影響を検討したところ，ホウ酸のみが顕著な影響を示し，IL-8，IL-6遺伝子発現量を増加させた．また，抗体アレイによるサイトカイン産生量の測定実験においても，ホウ酸を含むMPSおよび0.51.0％のホウ酸が24時間後のサイトカイン産生量を増加させることを確認した．ホウ酸が実使用濃度よりも低い0.1％で細胞毒性を有することは，Santodomingoら11）のV79細胞を用いたコロニー形成阻害試験により報告されている．今回の実験ではサイトカイン遺伝子発現および産生量の増加として細胞毒性が検出されたと考えられる．一方，筆者らは角膜上皮細胞のタイトジャンクション（特にZO-1）に対するMPSの影響を細胞生物学的および電気生理学的手法で検討し，配合成分にホウ酸を含むMPSのみがタイトジャンクションの構造を破壊することを報告している12）．サイトカイン遺伝子発現の増加がタイトジャンクションの構造破壊をひき起こすメカニズムの詳細は不明であるが，IL-1やIL-8などの炎症性サイトカインはストレス応答性のMAPK（mitogen-activatedproteinkinase）の活性化をひき起こすことが知られており，MAPKカスケードなどの細胞内シグナル伝達系の活性化を通してタイトジャンクションが破壊されたと考えられる13）．角膜上皮最表層細胞のタイトジャンクションは角膜のバリア機能においてきわめて重要な役割を担っているため，その構造破壊は緑膿菌などの病原菌の角膜への侵入を容易にし，細菌性角膜炎感染のリスクを増大させると考えられる1）．すなわち，コンタクトレンズ装用とケア用品（特にMPS）使用による細菌性角膜炎発症のリスクをなるべく低くするには，角膜上皮細胞のサイトカイン遺伝子発現への影響の少ないMPSを選択し，角膜バリア機能をなるべく健全に保つことが重要と考えられる．文献1）大橋裕一，鈴木崇，原祐子ほか：コンタクトレンズ関連細菌性角膜炎の発症メカニズム．日コレ誌48：60-67,20062）InoueN,ToshidaH,MamadaNetal：Contactlens-inducedkeratitisinJapan.EyeContactLens33：65-69,20073）LevyB,HeilerD,NortonS：ReportontestingfromaninvestigationofFusariumkeratitisincontactlenswear-90.080.070.060.050.040.030.020.010.00.0：IL-8：TGF-b2：IL-6pg/m?1％HCOPBS（＋）1％Tetronic1％Poloxamer1ppmAlexidine1ppmPHMB0.5％Boricacid1.0％Boricacid図4配合成分で24時間処理したHCET細胞のサイトカイン産生量———————————————————————-Page61572あたらしい眼科Vol.25，No.11，2008（102）ers,EyeContactLens32：256-261,20064）星合竜太郎，濱田いずみ：レンズケアに対するコンタクトレンズ使用者の意識．日コレ誌49：119-123,20075）柳井亮二，植田喜一，西田輝夫ほか：市販多目的剤の消毒効果と細胞毒性の比較．日コレ誌49（補遺）：S13-S18,20076）外園千恵，今西二郎：サイトカイン．眼科NewInsight5（木下茂編），p154-165,メジカルビュー社，19957）Araki-SasakiK,OhashiY,SasabeTetal：AnSV40-immortalizedhumancornealepithelialcelllineanditscharacterization.InvestOphthalmolVisSci36：614-621,19958）XueML,ZhuH,WillcoxMDP：TheroleofIL-1betaintheregulationofIL-8andIL-6inhumancornealepitheli-alcellsduringPseudomonasaeruginosacolonization.CurrEyeRes23：406-414,20019）山下英俊：トランスフォーミング増殖因子ベータ（TGF-b）スーパーファミリーの眼組織における作用．日眼会誌101：927-947,199710）HuangX,McClellanSA,BarrettRPetal：IL-18contrib-utestohostresistanceagainstinfectionwithPseudomo-nasaeruginosathroughinductionofIFN-gammaproduc-tion.JImmunol168：5756-5763,200211）Santodomingo-RubidoJ,MoriO,KawaminamiS：Cyto-toxicityandantimicrobialactivityofsixmultipurposesoftcontactlensdisinfectingsolutions.OphthalPhysiolOpt26：476-482,200612）ImayasuM,ShiraishiA,OhashiYetal：Eectsofmulti-purposesolutionsoncornealepithelialtightjunctions.EyeContactLens34：50-55,200813）WangY,ZhangJ,YiXetal：ActivationofERK1/2MAPkinasepathwayinducestightjunctiondisruptioninhumancornealepithelialcells.ExpEyeRes78：125-136,2004＊＊＊