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カルテオロール塩酸塩LA点眼液「わかもと」のヒト角膜上皮細胞への影響と保存効力の検討

admin — Mon, 29 Sep 2014 15:33:59 +0000

1374あたらしい眼科Vol.4109，21，No.3（00）1374（126）0910-1810/14/\100/頁/JCOPY《原著》あたらしい眼科31（9）：1374.1378，2014cはじめに長期にわたって点眼を余儀なくされる緑内障患者には，眼表面疾患を伴っている割合が高いことが報告されている1）．また，その重症度は点眼液の種類や点眼回数の増加により高まる傾向にあり1,2），これらの疾患には主薬の他にも点眼液中に含まれる防腐剤の種類や濃度が大きく関係していると考〔別刷請求先〕高嶋光代：〒103-8330東京都中央区日本橋本町2-2-2わかもと製薬株式会社Reprintrequests：MitsuyoTakashima,WakamotoPharmaceuticalCo.,Ltd.,2-2,Nihonbashi,Honcho2-Chome,Chuo-ku,Tokyo103-8330,JAPANカルテオロール塩酸塩LA点眼液「わかもと」のヒト角膜上皮細胞への影響と保存効力の検討高嶋光代＊1高橋佑次＊1中林夏子＊1山村雄＊1倉澤崇＊1伊藤雅起＊1内藤聡＊1富田剛司＊2＊1わかもと製薬株式会社＊2東邦大学医療センター大橋病院眼科InVitroEvaluationofGenericLong-ActingCarteololOphthalmicSolutionWAKAMOTORegardingHumanCornealDamagesandthePreservativeActivityMitsuyoTakashima1），YujiTakahashi1），NatsukoNakabayashi1），TakeruYamamura1），TakashiKurasawa1），MasakiIto1），AkiraNaito1）andGojiTomita2）1）WakamotoPharmaceuticalCo.,Ltd,2）DepartmentofOphthalmology,TohoUniversityOhashiMedicalCenter目的：カルテオロール塩酸塩LA点眼液「わかもと」（以下，LA-W）の角膜上皮細胞に対する安全性と保存効力を評価した．方法：SV40不死化ヒト由来角膜上皮細胞（HCE-T）を用い，HCE-Tに対するLA-Wおよびカルテオロール塩酸塩持続性点眼液（以下，MLA）の角膜上皮細胞に対する安全性を検討した．評価は50％細胞致死時間（CDT50），occludinの免疫染色および経上皮電気抵抗値（TER）を指標とした．LA-Wの保存効力については，指定菌株を用いて日本薬局方（第十六改正）を参考に実施した．結果：HCE-Tに対するCDT50は，LA-W処置群で1％および2％いずれも10.00分以上，MLA処置群では1％で2.62分，2％で4.14分を示した．Occludinの分布変化は，MLA処置群よりもLA-Wのほうが小さかった．また，TERはLA-WのほうがMLAよりも早期に回復した．さらに保存効力試験において，LA-Wはすべての菌株で日本薬局方の判定基準に適合した．結論：本評価系においてLA-Wはヒト角膜上皮細胞への影響が少なく，保存効力も十分に有していることが確認された．Purpose：Toevaluatethecornealepithelialcellcytotoxicityandpreservativeeffectofgenericlong-actingcarteololophthalmicsolution（LA-W）.Methods：SV40-immortalizedhumancornealepithelialcellline（HCE-T）wasusedforinves-tigatingcytotoxicity.AfterexposuretoLA-Worbland-namelong-actingcarteololophthalmicsolution（MLA）,50％cell-damagetime（CDT50）andtransepithelialelectricalresistance（TER）weremeasured.Inaddition,occludin,atightjunctionproteinwasimmunostainedafterexposuretothoseformulations.LA-Wwastestedforpreservativeeffectivenessinaccor-dancewiththeJapanesePharmacopoeia（JP16）.Result：CDT50forHCE-TwithLA-W1％and2％wasmorethan10min；withMLA1％and2％itwas2.62minand4.14min,respectively.TheTERofLA-WrecoveredearlierthandidthatofMLA.LA-WdidnotaffectoccludindistributioninHCE-T,whereasMLAaffectedaportionofit.Preservative-effectivenesstestresultsforLA-WconformedtoJPcriteria.Conclusion：LA-Wislessdamagingtoocularsurfacetissueandhassufficientpreservativeactivity.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）31（9）：1374.1378,2014〕Keywords：カルテオロール塩酸塩持続性点眼液，ベンザルコニウム塩化物（BAC），50％細胞致死時間，タイトジャンクション，保存効力．long-actingcarteololophthalmicsolution,benzalkoniumchloride,CDT50,tightjunction,preservative-effectiveness.（00）1374（126）0910-1810/14/\100/頁/JCOPY《原著》あたらしい眼科31（9）：1374.1378，2014cはじめに長期にわたって点眼を余儀なくされる緑内障患者には，眼表面疾患を伴っている割合が高いことが報告されている1）．また，その重症度は点眼液の種類や点眼回数の増加により高まる傾向にあり1,2），これらの疾患には主薬の他にも点眼液中に含まれる防腐剤の種類や濃度が大きく関係していると考〔別刷請求先〕高嶋光代：〒103-8330東京都中央区日本橋本町2-2-2わかもと製薬株式会社Reprintrequests：MitsuyoTakashima,WakamotoPharmaceuticalCo.,Ltd.,2-2,Nihonbashi,Honcho2-Chome,Chuo-ku,Tokyo103-8330,JAPANカルテオロール塩酸塩LA点眼液「わかもと」のヒト角膜上皮細胞への影響と保存効力の検討高嶋光代＊1高橋佑次＊1中林夏子＊1山村雄＊1倉澤崇＊1伊藤雅起＊1内藤聡＊1富田剛司＊2＊1わかもと製薬株式会社＊2東邦大学医療センター大橋病院眼科InVitroEvaluationofGenericLong-ActingCarteololOphthalmicSolutionWAKAMOTORegardingHumanCornealDamagesandthePreservativeActivityMitsuyoTakashima1），YujiTakahashi1），NatsukoNakabayashi1），TakeruYamamura1），TakashiKurasawa1），MasakiIto1），AkiraNaito1）andGojiTomita2）1）WakamotoPharmaceuticalCo.,Ltd,2）DepartmentofOphthalmology,TohoUniversityOhashiMedicalCenter目的：カルテオロール塩酸塩LA点眼液「わかもと」（以下，LA-W）の角膜上皮細胞に対する安全性と保存効力を評価した．方法：SV40不死化ヒト由来角膜上皮細胞（HCE-T）を用い，HCE-Tに対するLA-Wおよびカルテオロール塩酸塩持続性点眼液（以下，MLA）の角膜上皮細胞に対する安全性を検討した．評価は50％細胞致死時間（CDT50），occludinの免疫染色および経上皮電気抵抗値（TER）を指標とした．LA-Wの保存効力については，指定菌株を用いて日本薬局方（第十六改正）を参考に実施した．結果：HCE-Tに対するCDT50は，LA-W処置群で1％および2％いずれも10.00分以上，MLA処置群では1％で2.62分，2％で4.14分を示した．Occludinの分布変化は，MLA処置群よりもLA-Wのほうが小さかった．また，TERはLA-WのほうがMLAよりも早期に回復した．さらに保存効力試験において，LA-Wはすべての菌株で日本薬局方の判定基準に適合した．結論：本評価系においてLA-Wはヒト角膜上皮細胞への影響が少なく，保存効力も十分に有していることが確認された．Purpose：Toevaluatethecornealepithelialcellcytotoxicityandpreservativeeffectofgenericlong-actingcarteololophthalmicsolution（LA-W）.Methods：SV40-immortalizedhumancornealepithelialcellline（HCE-T）wasusedforinves-tigatingcytotoxicity.AfterexposuretoLA-Worbland-namelong-actingcarteololophthalmicsolution（MLA）,50％cell-damagetime（CDT50）andtransepithelialelectricalresistance（TER）weremeasured.Inaddition,occludin,atightjunctionproteinwasimmunostainedafterexposuretothoseformulations.LA-Wwastestedforpreservativeeffectivenessinaccor-dancewiththeJapanesePharmacopoeia（JP16）.Result：CDT50forHCE-TwithLA-W1％and2％wasmorethan10min；withMLA1％and2％itwas2.62minand4.14min,respectively.TheTERofLA-WrecoveredearlierthandidthatofMLA.LA-WdidnotaffectoccludindistributioninHCE-T,whereasMLAaffectedaportionofit.Preservative-effectivenesstestresultsforLA-WconformedtoJPcriteria.Conclusion：LA-Wislessdamagingtoocularsurfacetissueandhassufficientpreservativeactivity.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）31（9）：1374.1378,2014〕Keywords：カルテオロール塩酸塩持続性点眼液，ベンザルコニウム塩化物（BAC），50％細胞致死時間，タイトジャンクション，保存効力．long-actingcarteololophthalmicsolution,benzalkoniumchloride,CDT50,tightjunction,preservative-effectiveness.察されている3）．ベンザルコニウム塩化物（以下，BAC）は高い保存効力を有し，水溶性で化学的にも安定なことから，マルチドーズ型点眼薬に頻用されている防腐剤である4）．その一方で，BACは角結膜上皮障害などの副作用を引き起こすことが多々報告されており3.5），点眼液中BAC濃度の設定には点眼液の保存効力に加えて眼表面への安全性も考慮する必要がある．カルテオロール塩酸塩LA点眼液「わかもと」（わかもと製薬㈱，以下，LA-W）は，カルテオロール塩酸塩を1％または2％含有する持続型緑内障・高眼圧症治療用点眼液であり，ミケランRLA点眼液（大塚製薬㈱，以下，MLA）の後発品として開発された．両者はともに防腐剤としてBACを含有しているが，LA-WはBAC濃度を0.001％まで抑え眼表面への影響を考慮しているのが特徴である．本研究においては，LA-Wの眼表面に対する安全性についてヒト角膜上皮細胞を用いて検討し，加えて，LA-Wの保存効力を日本薬局方の保存効力試験を参考に評価した．I材料および方法1.試験物質および試薬LA-W1％および2％，MLA1％および2％を使用した．ヒト角膜上皮細胞を用いた安全性評価試験には，陰性対照としてphosphatebufferedsaline（PBS）（Gibco,Lifetechnolo-gies），陽性対照としてベンザルコニウム塩化物（BAC，東京化成工業㈱）のPBS溶解液（BAC0.001％/0.002％/0.005％/0.02％）を適宜用いた．2.ヒト由来角膜上皮細胞による安全性評価SV40不死化ヒト由来角膜上皮細胞（以下HCE-T，RCBNo.2280：理化学研究所）は，Supplementedhormonalepithelialmedium（SHEM）改変培養培地〔5％ウシ胎児血清（FBS），10ng/mLEGF，5μg/mLインスリン，0.5％DMSOを含むDMEM/F-12〕にて37°C，5％CO2下で培養した．a.細胞障害性試験HCE-Tは96wellプレートに2×104cells/wellとなるように播種し，CO2インキュベーター内で24時間培養した．つぎに，培養培地からLA-WおよびMLAの1％または2％，PBS，BAC溶液（0.001,0.005％）50μLへそれぞれ置換し，1，2，5または10分間接触させた．その後，PBSによる洗浄を経て培養培地100μLに置換し，CO2インキュベーター内で再び24時間培養した．各wellにCellCountingKit-8（同仁化学研究所）を10μLずつ添加しCO2インキュベーター内で2時間培養後，マイクロプレートリーダー（InfiniteM200FLABS，テカンジャパン㈱）により吸光度（450/630nm）を測定した．PBS処置群の吸光度を100として，細胞生存率（％）を算出した後，各種点眼薬の50％細胞致死時間（以下，CDT50）を算出した．（127）b.Occludinの免疫染色HCE-Tは24wellプレートに5×104cells/wellとなるように播種し，CO2インキュベーター内で3日間培養した．次に培養培地をLA-WおよびMLAの2％，PBSおよびBAC溶液（0.002％）300μLに置換し，10分間接触させた．その後，PBSにより試験物質を洗浄除去し，.20°Cに冷却した100％メタノールで約15分間固定した．1％BSA/PBSを1時間室温処置でブロッキング後，1次抗体の抗occludin抗体（1：100，Invitrogen）を，続いて2次抗体としてAlexaFlour-488-conjugatedanti-mouseIgG（1：1000，Invitrogen）を室温で順に1時間ずつ反応させた．VECTASHIELDMountingMediumwithDAPIを滴下，封入して評価標本とし，蛍光顕微鏡（IX70，オリンパス㈱））により観察した．c.経上皮電気抵抗値による評価経上皮電気抵抗値（以下，TER）の測定にはMillicellERS-2抵抗値測定システム（メルク㈱）を用いた．HCE-Tは24wellトランズウェルプレートのトップ・チャンバーに5×104cells/wellとなるように播種し，CO2インキュベーター内で5日間培養した．トップ・チャンバーの培養培地をLA-WおよびMLAの2％およびBAC溶液（0.001,0.005,0.02％）100μLでそれぞれ置換し，1分間接触させた後に培養培地により試験物質を洗浄除去，培養培地200μLで置換した．培養培地置換直後を0分として試験物質接触前（Pre），0，30，60，90，120分後のTERをそれぞれ測定し，Pre値に対するTERの変化率（％）を算出した．3.保存効力試験日本薬局方（第十六改正）の保存効力試験法を参考に，LA-Wの保存効力試験を塗抹法にて実施し，点眼液に適応されるカテゴリーIAの基準に従って評価した．細菌として，Staphylococcusaureus（菌株：ATCC6538），Pseudomonasaeruginosa（菌株：ATCC9027），Escherichiacoli（菌株：ATCC8739），真菌として，Candidaalbicans（菌株：ATCC10231）およびAspergillusbrasiliensis（菌株：ATCC16404）を使用した．4.統計解析統計解析はSPSSStatisticsを用い，各点眼液処置後のTER変化率の推移について2元配置分散分析を実施した．なお，有意水準は5％とした．II結果1.角膜上皮細胞に対する安全性a.HCE.Tへの障害性BAC0.001％および0.005％のCDT50はそれぞれ4.00分および1.00分未満であり，濃度依存的な細胞障害性があることを確認した（図1，表1）．LA-W処置群は1％，2％ともに，接触時間10分においても60％以上の細胞生存率を維あたらしい眼科Vol.31，No.9，201413751376あたらしい眼科Vol.31，No.9，2014（128）持し，CDT50は10.00分以上であった．一方，MLA処置群のCDT50は，1％，2％でそれぞれ2.62分，4.14分であった．b.Occludinの局在分布への影響LA-W処置群におけるoccludinの分布は，陰性対照であるPBS処置群と同様に細胞接着面で連続した線状をおおむね維持しており，局在特性に大きな変化は観察されなかった（図2C）．一方，BAC0.002％およびMLA処置群は，PBSおよびLA-W処置群と比べてoccludinの分布が破線状に変化している部分が多く観察された（図2B，D）．c.TERによる評価全群で処置に由来すると考えられる一過性のTERの低下が認められた．カルテオロール濃度2％の点眼液同士で比較した場合，LA-W処置群はMLA処置群よりもTERが早期に回復した（図3A，p＝0.015）．また，BACは濃度依存的にTERを減少させ，TERの回復はBAC0.001％処置群では認められたものの，BAC0.005％以上の処置群では認めら表1CDT50一覧群名CDT50LA-W1％＞10.00分LA-W2％＞10.00分MLA1％2.62分MLA2％4.14分BAC0.001％4.00分BAC0.005％＜1.00分020406080100024681012細胞生存率（％）薬剤接触時間（分）図1薬剤接触後のHCE.Tの細胞生存率（％）値は平均値を示す（n＝6）．○：LA-W1％，●：LA-W2％，◇：MLA1％，◆：MLA2％，△：BAC0.001％，▲：BAC0.005％．ADCB図2薬剤接触後のHCE.Tのoccludin分布（緑：occludin，青：核）A：PBS，B：BAC0.002％，C：LA-W，D：MLA．一部の薬剤により，occludinの局在が大きく阻害された（矢印）．Bar＝20μm.（128）持し，CDT50は10.00分以上であった．一方，MLA処置群のCDT50は，1％，2％でそれぞれ2.62分，4.14分であった．b.Occludinの局在分布への影響LA-W処置群におけるoccludinの分布は，陰性対照であるPBS処置群と同様に細胞接着面で連続した線状をおおむね維持しており，局在特性に大きな変化は観察されなかった（図2C）．一方，BAC0.002％およびMLA処置群は，PBSおよびLA-W処置群と比べてoccludinの分布が破線状に変化している部分が多く観察された（図2B，D）．c.TERによる評価全群で処置に由来すると考えられる一過性のTERの低下が認められた．カルテオロール濃度2％の点眼液同士で比較した場合，LA-W処置群はMLA処置群よりもTERが早期に回復した（図3A，p＝0.015）．また，BACは濃度依存的にTERを減少させ，TERの回復はBAC0.001％処置群では認められたものの，BAC0.005％以上の処置群では認めら表1CDT50一覧群名CDT50LA-W1％＞10.00分LA-W2％＞10.00分MLA1％2.62分MLA2％4.14分BAC0.001％4.00分BAC0.005％＜1.00分020406080100024681012細胞生存率（％）薬剤接触時間（分）図1薬剤接触後のHCE.Tの細胞生存率（％）値は平均値を示す（n＝6）．○：LA-W1％，●：LA-W2％，◇：MLA1％，◆：MLA2％，△：BAC0.001％，▲：BAC0.005％．ADCB図2薬剤接触後のHCE.Tのoccludin分布（緑：occludin，青：核）A：PBS，B：BAC0.002％，C：LA-W，D：MLA．一部の薬剤により，occludinの局在が大きく阻害された（矢印）．Bar＝20μm.APre値表2保存効力試験の結果：各菌株の菌数（Log10CFU/mL）Pre値表2保存効力試験の結果：各菌株の菌数（Log10CFU/mL）A：LA-W1％TER相対変化率（％）－20＊p＝0.015菌株※1－40Sa－60PaEcCa－80－100Ab洗浄後時間（分）接種菌数5.85.65.85.65.0B：LA-W2％保存期間（日）保存期間（日）接種14NDNDNDNDND菌株※1菌数281428NDSa5.8NDNDNDPa5.6NDNDNDEc5.8NDNDNDCa5.6NDNDNDAb5.0NDND0306090120ND：0.8Log10CFU/mL未満（接種菌数の0.001％未満）．BPre値※1菌株Sa：Staphylococcusaureus，Pa：Pseudomonasaeruginosa，Ec：Escherichiacoli，Ca：Candidaalbicans，Ab：0Aspergillusbrasiliensis－20加されているため，単に添加濃度を下げれば良いというもの－40ではない．マルチドーズ型点眼液中の防腐剤濃度を設定する－60に当たっては，角膜表面に対する安全性と保存効力のバランスを考慮することが重要となる．LA-Wは，添加剤を工夫することによって低粘度ながらもMLAと同等の眼圧下降作－80TER相対変化率（％）0306090120洗浄後時間（分）図3薬剤接触後のHCE.TにおけるTER変化率の推移（％）値は平均値±標準誤差を示す（n＝4）．A：LA-WおよびMLA，B：BAC．●：LA-W2％，◆：MLA2％，△：BAC0.001％，▲：BAC0.005％，▲：BAC0.02％，＊p：vsMLA［2元配置分散分析］．れなかった（図3B）．2.保存効力試験LA-Wにおける生菌数（Log10CFU/mL）の推移を表2に示す．開始時の生菌数は，5.0.5.8Log10CFU/mLであった．菌接種後14および28日の生菌数は，LA-W1％，2％ともにすべての菌株で検出限界以下（0.8Log10CFU/mL未満）となり，LA-Wは日本薬局方の判定基準に適合した．III考按国内で上市されている点眼液中の防腐剤としてのBAC添加濃度は0.005.0.01％である場合が多く，国内使用実績としては0.02％が最大濃度である4）．BACによる角膜障害は濃度依存的に引き起こされることが報告されており4.6），近年では各点眼液中防腐剤の種類および濃度，角膜上皮障害との関係も種々検討され始めている4,6,7）．このような背景には，点眼液の眼表面に対する安全性への配慮がこれまで以上に求められていることが考えられる．しかしながら，点眼液中の防腐剤は本来，使用に伴う二次的な汚染防止を目的として添（129）用をもち，さらにBACを最小限（0.001％）まで抑えた処方を採用している．本研究ではLA-Wの角膜上皮細胞に対する安全性および保存効力を評価することを目的として種々の検討を行った．角膜上皮細胞は点眼時に点眼液が最初に接触する組織の一つであり，同時に外因性物質の侵入を防ぐバリア機能を担っている．これまでに，BACとの接触によりoccludinの消失がみられるとの報告や8），タイトジャンクションの構成蛋白であるoccludinやZO-1の発現減少に伴ってTERが低下するとの報告9.11）があることから，点眼液由来のBACが角膜上皮のタイトジャンクションに対して影響を及ぼすことが考えられる．そこで，安全性評価にはヒト由来角膜上皮細胞を用いて，細胞障害性試験およびバリア機能の一端を担うタイトジャンクションの形態およびその機能を検討した．細胞障害性試験において，LA-W1％，2％ともにMLAよりも高い細胞生存率を推移した（1％；LA-W：10.00分以上，MLA：2.62分，2％；LA-W：10.00分以上，MLA：4.14分）．また，LA-WおよびMLA，どちらの点眼液においてもカルテオロール濃度2％処置群のほうが1％処置群よりも高い細胞生存率で推移したことから，主薬であるカルテオロールには細胞保護効果があることが示唆された．BAC0.001％処置群よりもそれと同量のBACを含むLA-W処置群で細胞生存率が高かったのは，カルテオロール自身による細胞保護効果に起因した可能性が考えられた．Occludinの局在変化はLA-W処置群のほうがMLA処置群よりも小さく，さらにTER変化率の推移においても，LA-W処置群はMLA処置群よりも速やかな回復性を示した．以上より，あたらしい眼科Vol.31，No.9，20141377LA-Wは細胞障害性および角膜上皮細胞のタイトジャンクションに対する影響は小さく，安全性が高いことが示された．各点眼液に添加されている特記すべき添加物は，LA-Wはホウ酸，マンニトールおよびBAC，MLAはアルギン酸およびBACである．これらのなかから角膜上皮細胞の安全性に影響する添加物について考察した．角膜上皮細胞に対してマイナス要因となりうる添加物は，LA-Wに含まれるホウ酸12），両点眼液に含まれるBACである．LA-Wに含まれるホウ酸の安全性を調べるため，BACを含有しないLA-Wの基剤について細胞障害性試験を実施したところ，細胞生存率はPBS群と同様の推移を示した（データ非掲載）．ゆえに，LA-W中に含有するホウ酸の角膜上皮細胞に対する影響は非常に低いことが示唆された．一方BACは，細胞障害性と添加濃度が大きく関係していることが知られている3,4）．各点眼液のBAC添加濃度は，MLAが0.005％13），対してLA-Wは0.001％であり，LA-WはMLAと比べてBAC濃度が5分の1に抑えられている．以上より，LA-Wの角膜上皮への高い安全性には点眼液中BAC含量の減量に由来していることが推察された．プラス要因としてはLA-Wに含まれるマンニトールが考えられる．長井らは，点眼液中のマンニトールがBAC自身の毒性を軽減している可能性を示唆しており14），LA-Wに含まれるマンニトールもLA-Wの角膜上皮の安全性に寄与しうると考えられた．保存効力試験では，LA-WはBAC濃度が低く抑えられているにもかかわらず日本薬局方の判定基準を満たす保存効力を示した．その要因としてLA-Wにホウ酸が添加されていることが挙げられる．筆者らは，過去にカルテオロールを含むb遮断薬とホウ酸を組み合わせた処方が保存効力を有することを見出し，特許を取得している15）．LA-Wはこの条件を満たした処方となっているため，BAC濃度を抑えても保存効力を維持することが可能となったと推察している．本研究からLA-Wはヒト角膜上皮細胞への影響が少なく，保存効力も十分に有していることを確認した．患者の良好なアドヒアランスを保つためには，服薬を妨げる因子をできるだけ排除することも大切であると考えられる．ゆえに，角膜上皮に対して影響が少なく保存効力も十分に有する点眼液は，患者の長期服薬をサポートすることにも繋がると考えている．今後は，患者の眼表面に対する安全性と点眼液の保存効力，この双方に対して十分配慮した製剤設計が緑内障治療薬に対してもますます求められていくと考える．文献1）LeungEW,MedeirosFA,WeinrebRN：Prevalenceofocularsurfacediseaseinglaucomapatients.JGlaucoma17：350-355,20082）FukuchiT,WakaiK,SudaKetal：Incidence,severityandfactorsrelatedtodrug-inducedkeratoepitheliopathywithglaucomamedications.ClinOphthalmol4：203-209,20103）川瀬和秀：シンポジウムII：緑内障に関する最近のトピックス緑内障点眼薬の毒性．眼薬理27：56-60,20134）浅田博之，七篠（高岡）優子，中村雅胤ほか：0.0015％タフルプロスト点眼液のベンザルコニウム塩化物濃度の最適化検討─眼表面安全性と保存効力の視点から─．薬学雑誌130：867-871,20105）BursteinNL：Preservativecytotoxicthresholdforbenzalkoniumchlorideandchlorhexidinedigluconateincatandrabbitcorneas.InvestOphthalmolVisSci19：308-313,19806）福田正道，稲垣伸亮，萩原健太ほか：ラタノプロスト後発品点眼薬の角膜上皮細胞に対する安全性の検討．あたらしい眼科28：849-854,20117）NakagawaS,UsuiT,YokooSetal：Toxicityevaluationofantiglaucomadrugsusingstratifieldhumancultivatedcornealepithelialsheets.InvestOphthalmolVisSci53：5154-5160,20128）PaulyA,MeloniM,Brignole-BaudouinFetal：Multipleendpointanalysisofthe3D-reconstitutedcornealepitheliumaftertreatmentwithbenzalkoniumchloride：Earlydetectionoftoxicdamage.InvestOphthalmolVisSci50：1644-1652,20099）BamforthS.D,KnieselU,WolburgHetal：Adominantmutantofoccludindisruptstightjunctionstructureandfunction.JCellSci112：1879-1888,199910）YiX,WangY,YuFS：Cornealepithelialtightjunctionsandtheirresponsetolipopolysaccharidechallenge.InvestOphthalmolVisSci41：4093-4100,200011）KimuraK,TeranishiS,NishidaT：Interleukin-1b-induceddisruptionofbarrierfunctioninculturedhumancornealepithelialcells.InvestOphthalmolVisSci50：597603,200912）ImayasuM,ShiraishiA,OhashiYetal：Effectsofmultipurposesolutionsoncornealepithelialtightjunctions.EyeContactLens34：50-55,200813）望月英毅，木内良明：b遮断薬．あたらしい眼科29：451455,201214）長井紀章，村尾卓俊，大江恭平ほか：不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T）を用いた緑内障治療配合剤のinvitro角膜細胞傷害性評価．薬学雑誌131：985-991,201115）中谷清吾，大山祐賀子，鈴木秀一：点眼用水性組成物．特許国際公開番号：WO2011013794A1＊＊＊（130）

酸化ストレスによる角膜上皮バリアの障害に対するレバミピドの効果

admin — Sat, 29 Sep 2012 15:23:36 +0000

《原著》あたらしい眼科29（9）：1265.1269，2012c酸化ストレスによる角膜上皮バリアの障害に対するレバミピドの効果竹治康広田中直美篠原久司大塚製薬株式会社赤穂研究所ProtectiveEffectofRebamipideonOxidativeStress-inducedDisruptionofBarrierFunctioninHumanCornealEpithelialCellsYasuhiroTakeji,NaomiTanakaandHisashiShinoharaAkoResearchInstitute,OtsukaPharmaceuticalCo.,Ltd.酸化ストレスは，さまざまな前眼部疾患の発症・増悪に関与しており，ドライアイもその一つであると考えられている．レバミピドは，角膜および結膜においてムチン産生促進作用を有するドライアイに対する治療薬であり，またフリーラジカル消去作用をもつことが報告されている．今回，酸化ストレスによる角膜バリアの障害に対するレバミピドの効果について，培養ヒト角膜上皮細胞を用いて検討した．バリアの機能について経上皮電気抵抗（TER）を，バリアの構造についてタイトジャンクションの構成蛋白を指標とし，酸化ストレスの負荷方法として過酸化水素を用いた．その結果，過酸化水素を角膜上皮細胞に処理すると，TERは用量依存的に低下するが，そのTERの低下はレバミピドの前処置により抑制された．さらに，レバミピドは過酸化水素によるタイトジャンクションの構成蛋白であるZonulaoccludens-1の障害に対して保護作用を示した．以上より，レバミピドは，培養角膜上皮細胞において，酸化ストレスによるバリア機能およびタイトジャンクションの障害に対して保護作用を示すことが明らかになった．Oxidativestressisthoughttobeinvolvedintheonsetandexacerbationofvariousanterioreyediseases,suchasdryeye.Rebamipide,atherapeuticagentfordryeyethatpromotestheproductionofmucinincorneaandconjunctiva,reportedlyhasafreeradicalscavengingaction.Inthepresentstudy,weinvestigatedtheeffectivenessofrebamipideagainstcornealbarrierdisruptioncausedbyoxidativestress,usingculturedhumancornealepithelialcells.Transepithelialelectricalresistance（TER）wasevaluatedasanindicatorofbarrierfunction,andtightjunctionproteinsasanindicatorofbarrierstructure.Hydrogenperoxidewasusedforoxidativestresschallenge.TreatmentwithhydrogenperoxideinducedTERdecreaseinadose-dependentmanner,butthedecreasewassuppressedbypretreatmentwithrebamipide.Inaddition,rebamipideexhibitedaprotectiveactionagainsthydrogenperoxideimpairmentofZonulaoccludens-1,atightjunctionprotein.Rebamipidewasthusshowntohaveaprotectiveactionagainstoxidativestress-inducedbarrierfunctionandtightjunctionimpairmentinthecornealepithelialcell.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）29（9）：1265.1269,2012〕Keywords：レバミピド，ヒト角膜上皮細胞，酸化ストレス，バリア機能，タイトジャンクション．rebamipide,humancornealepithelialcell,oxidativestress,barrierfunction,tightjunction.はじめに眼領域において，ドライアイ，白内障，ぶどう膜炎など多くの疾患の発症・増悪に酸化ストレスは関与している．酸化ストレスは，眼表面における活性酸素の産生亢進と，生体内の活性酸素に対する防御機構とのバランスにより調節されている1）．涙液中にはスーパーオキシドジスムターゼやラクトフェリンなどの抗酸化作用を含む物質が含まれており，防御機構の役割を果たしている．正常な状態であれば紫外線などさまざまな要因により発生した活性酸素は速やかに消去されるが，〔別刷請求先〕竹治康広：〒678-0207兵庫県赤穂市西浜北町1122-73大塚製薬株式会社赤穂研究所Reprintrequests：YasuhiroTakeji,AkoResearchInstitute,OtsukaPharmaceuticalCo.,Ltd.,1122-73Nishihamakita-cho,Ako-shi,Hyogo678-0207,JAPAN0910-1810/12/\100/頁/JCOPY（89）1265涙液量が低下しているドライアイでは，発生した活性酸素を十分に消去できなくなる．増加した活性酸素は，角膜に障害を与えドライアイの増悪の原因の一つになっているのではないかと考えられている2）．角膜上皮は，病原微生物の感染，粉塵，外傷など外界からの直接的な侵襲から角膜を保護しており，隣接する角膜上皮細胞間に存在する接着構造がバリアとして重要な働きを担っている．数種の接着構造が角膜上皮には存在し，そのなかでも最も表層に存在するタイトジャンクションが外界からの刺激を受けやすい．培養角膜上皮細胞に炎症性サイトカインや低酸素などの刺激を与えると，タイトジャンクションが障害を受ける3）．さらに，タイトジャンクションは，活性酸素による酸化ストレスによっても障害を受けることが報告されている4）．レバミピドは，角膜および結膜においてムチン産生促進作用を有するドライアイに対する治療薬である一方，ヒドロキシラジカル消去作用を有する抗酸化物質の一面をもつことが報告されている5）．今回，培養角膜上皮細胞における酸化ストレスによるバリア障害に対するレバミピドの作用を，バリア機能および，タイトジャンクション蛋白の両面から検討した．I実験方法1.細胞培養ヒト角膜上皮細胞（SV40不死化ヒト角膜上皮細胞，RCBNo.2280：理化学研究所）を10％FBS（fetalbovineserum）（ATCC：AmericanTypeCultureCollection）を含むDulbecco’sModifiedEagleMedium/F-12（DMEM/F-12）（Invitrogen）を用いて37℃，5％CO2インキュベーター内で培養し継代維持した．経上皮電気抵抗（transepithelialelectricresistance：TER）測定の試験において，細胞懸濁液を24穴のトランスウェルプレート（ミリポア）に5×104cells/wellで添加し，blankwellには細胞を含まない培地を添加した．細胞播種4日後，FBSを含まないDMEM/F-12に交換した．免疫染色およびWesternblottingの試験において，細胞懸濁液を24ウェルプレートに5×104cells/wellで播種した．細胞がコンフレントになった後，10％FBSを含まないDMEM/F-12に交換した．2.薬物の投与レバミピド（大塚製薬）およびジクアホソルナトリウム（大塚製薬）ともFBSを含まないDMEM/F-12に溶解させて使用した．TERに対する過酸化水素の用量反応性の検討について，FBSを含まないDMEM/F-12に交換した翌日，新たな培地に交換した．その1時間後，過酸化水素（和光純薬）を添加1266あたらしい眼科Vol.29，No.9，2012し，37℃，5％CO2インキュベーター内で静置した．TER測定，免疫染色およびWesternblottingの各試験でのドライアイ治療薬の検討について，FBSを含まないDMEM/F-12に交換した翌日，コントロール（培地のみ），レバミピドおよびジクアホソルナトリウムを溶解させた培地に交換した．薬物添加1時間後，過酸化水素を添加し，37℃，5％CO2インキュベーター内で静置した．正常群には，過酸化水素ではなく培地を添加した．3.経上皮電気抵抗（TER）の測定過酸化水素添加24時間後に，電気抵抗値測定システム（ミリセルERS-2,ミリポア）を用いて各wellのTERを測定した．TERは以下の式により算出した．TER（W・cm2）＝（薬物添加wellの電気抵抗.blankwellの電気抵抗）×培養面積（cm2）4.Zonulaoccludens.1（ZO.1）の免疫染色過酸化水素添加24時間後にZO-1の免疫染色を実施した．細胞を100％メタノールで20分間固定した後，0.1％Triton-Xを含むPBS（phosphatebufferedsaline）で30分間透過処理した．1％BSA（bovineserumalbumin）/PBSを1時間室温処置でブロッキングを実施した後，一次抗体のZO-1抗体（1：100,Invitrogen）で1時間室温インキュベートした．PBSで洗浄後，AlexaFluor488-conjugate二次抗体（1：1,000,Invitrogen）で室温1時間，さらに0.5μMDAPI（4￠,6-diamidino-2-phenylindol）（Polyscience）を室温30分間インキュベートし，核染色を行った．洗浄後，蛍光顕微鏡（BZ-9000,Keyence）を用いて観察した．5．ZO.1蛋白の発現過酸化水素添加24時間後にZO-1蛋白の発現をWesternblottingにて実施した．Proteaseinhibitorcocktail含有RIPAbufferにて蛋白を抽出し，BCAProteinAssayKit（ThermoSCIENTIFIC）を用いて蛋白濃度測定を行った．蛋白抽出液を電気泳動し，メンブレンに転写した後，ブロッキング処理を施した．一次抗体であるantiZO-1ポリクローナル抗体（1：300,Invitrogen）およびantib-actin抗体（AC-15）（1：10,000,Abcam）で4℃オーバーナイト，およびhorseradishperoxidase-conjugated二次抗体（GEHealthcare）で室温1時間処理し，標的蛋白を検出した．検出したバンドはImageQuantTL（GEHealthcare）を用いて，シグナル強度を数値化した．ZO-1蛋白のシグナル強度をb-actinシグナル強度で補正し，ZO-1蛋白の発現量を算出した．6.統計解析統計解析をSAS（Release9.1,SASInstituteJapan,Ltd）を用いて実施した．（90）TERに対する過酸化水素の用量反応性について，0μMと500各濃度（250,500および750μM）の過酸化水素でDunnett500各濃度（250,500および750μM）の過酸化水素でDunnett400検定（両側）を行った．TERに対するドライアイ治療薬の効果の検討については，正常とコントロールで対応のないt-検定（両側）を行った．レバミピドの用量反応性については，直線回帰分析による単調増加性が確認されたため，コントロールとレバミピドの各群でWilliams検定（上側）を行った．ジクアホソルナトリウムの効果については，コントロールとの間で対応のないt検定（両側）を実施した．ZO-1発現の検討については，正常とコントロールで対応のないt-検定（両側）を行い，コントロールとレバミピドおよびジクアホソルナトリウムの各群でDunnett検定（両側）を行った．いずれの検定も5％を有意水準として解析した．II結果＊＊＊＊TER（W・cm2）3002001000過酸化水素（μM）図1角膜上皮細胞におけるバリア機能に及ぼす過酸化水素の影響値は平均値±標準誤差を示す（n＝4）．TERは過酸化水素添加24時間後に測定．＊＊：p＜0.01vs0mM〔Dunnetttest（両側）〕．02505007501.TERに対する過酸化水素の用量反応性500角膜上皮細胞に過酸化水素を添加し，24時間後のTERの結果を図1に示す．過酸化水素の用量に依存して，TERは400＃＃＃＊＊低下した．250μM過酸化水素添加時のTER（420±18W・cm2；平均値±標準誤差）は，0μM（382±20W・cm2）に対してほとんど変化を示さないのに対し，500μMでは279±13W・cm2に，750μMでは127±4W・cm2に有意に低下した．TER（W・cm2）3002001002.TERに対するドライアイ治療薬の効果角膜上皮細胞におけるTERに対するドライアイ治療薬（レバミピドおよびジクアホソルナトリウム）の効果を検討した（図2）．過酸化水素の濃度は，TERが約7割に低下する500μMを用いた．その結果，レバミピドの前処置により，過酸化水素によるTERの低下は用量依存性に抑制された．300μMおよび1,000μMでレバミピドは，コントロールに対して有意な差を示した．一方，ジクアホソルナトリウムはコントロールに対して変化を示さなかった．3.タイトジャンクション蛋白に対するドライアイ治療薬の効果タイトジャンクションの構成蛋白の一つであり，角膜を含めさまざまな組織でタイトジャンクションのマーカーとして利用されているZO-1に対するレバミピドの作用を免疫染色およびWesternblottingにより検討した．免疫染色の結果（図3），正常群では，ZO-1は，細胞-細胞間つまりタイトジャンクションに局在していることが観察された．500μM過酸化水素を添加すると，部分的にZO-1のタイトジャンクションへの局在が阻害されていることが観察された．1,000μMレバミピドを前処置しておくと，過酸化水素により生じたZO-1の変化は抑制されたが，1,000μMジクアホソルナトリウムはZO-1の変化に対して作用を示さ（91）0正常ジクアホソルレバミピド（μM）ナトリウム500μM過酸化水素図2酸化ストレスによるバリア機能の低下に対するドライアイ治療薬の効果値は平均値±標準誤差を示す（n＝4）．TERは過酸化水素添加24時間後に測定．＊＊：p＜0.01vs正常〔対応のないt-検定（両側）〕．＃：p＜0.05，＃＃：p＜0.01vsコントロール〔Williams検定（上側）〕．なかった．ZO-1蛋白発現に対するレバミピドの作用をWesternblottingにより検討した（図4）．正常群に比べ500μM過酸化水素を添加すると，ZO-1蛋白発現の低下が観察された．1,000μMレバミピドを前処置しておくと，過酸化水素により生じたZO-1蛋白発現低下は抑制された．III考按ドライアイの発症・増悪には，涙液の異常以外にも多くの要因が関与しており，外的もしくは内的要因により生じた活性酸素の増加がその一つとして報告されている2）．角膜上皮あたらしい眼科Vol.29，No.9，20121267コントロール1003001,0001,000μM正常過酸化水素（コントロール）過酸化水素（レバミピド処置）過酸化水素（ジクアホソルナトリウム処置）図3酸化ストレスによるZO.1の変化に対するドライアイ治療薬の効果培地（コントロール），レバミピドおよびジクアホソルナトリウムを添加し，1時間後に500μMの過酸化水素を添加した．免疫染色は，過酸化水素添加24時間後に実施した．過酸化水素により，ZO-1のタイトジャンクションへの局在が阻害された（矢印）．その阻害は，レバミピドの前処置により抑制された．ZO-1b-actinジクアホソル正常コントロールレバミピドナトリウム500μM過酸化水素0.10＊＊0.080.060.040.020.00正常コントロールレバミピドジクアホソルナトリウム＃ZO-1/b-actin500μM過酸化水素図4酸化ストレスによるZO.1の変化に対するドライアイ治療薬の効果値は平均値±標準誤差を示す（n＝6）．＊＊：p＜0.01vs正常〔対応のないt-検定（両側）〕．＃：p＜0.05vsコントロール〔Dunnett検定（両側）〕．および涙液中には，活性酸素を消去する物質が存在しているため，眼表面で発生した活性酸素は速やかに消去されるが，涙液分泌の異常に伴う抗酸化物質の減少，炎症を伴う病態および紫外線などの影響を受けた場合，活性酸素が上昇する．増加した活性酸素は，直接的に角膜障害を起こしたり，また炎症反応を介してドライアイの発症・増悪をひき起こしていると考えられている．ドライアイ患者の涙液において，過酸化脂質が高いことからも，ドライアイの発症・増悪には酸化ストレスが関与していることが示唆されている6）．角膜上皮において，バリア機能が障害された所見の一つとして点状表層角膜症がある．この所見は，ドライアイ，アトピー性角膜炎，春季カタル，薬剤性角膜上皮障害などでみられ，上皮の表層細胞が欠損しており，その部位でタイトジャンクションの障害が生じている7）．レバミピドは，培養胃上皮細胞において酸化ストレスによるバリア機能低下を抑制し，その効果はタイトジャンクションの障害に対する保護作用によることが報告されている8）．今回，角膜上皮細胞における酸化ストレスによるバリア障害に対するレバミピドの効果を検討した．酸化ストレスを負荷する方法として，活性酸素の一つであるヒドロキシラジカルを生じる過酸化水素を用いた．生体内で過酸化水素より産生されるヒドロキシラジカルは，分解する酵素がないうえに，非常に高い細胞障害性をもつ物質である．1268あたらしい眼科Vol.29，No.9，2012（92）角膜バリア機能の指標となるTERにおいて，レバミピドは過酸化水素によるTER低下に対して保護作用を示した．また，角膜バリアの役割を担うタイトジャンクションの構成蛋白の一つであるZO-1の障害に対しても保護作用を示した．以前の報告で，レバミピドはelectronspinresponse法を用いた検討において，ヒドロキシラジカルを消去する作用を有することが確認されており5），またラットのUVB（ultraviolet-B）誘導による角膜障害および酸化ストレスマーカーである8-OHdG（8-hydroxydeoxyguanosine）の増加に対して抑制作用を示し，その作用はヒドロキシラジカルを消去したためであることが報告されている9）．そこで今回のレバミピドの過酸化水素に対する保護作用は，この活性酸素をトラップしたためであると推測される．以上より，レバミピドは，培養角膜上皮細胞において，酸化ストレスによるバリア機能およびタイトジャンクションの障害に対して保護作用を示すことが明らかになった．文献1）WakamatsuTH,DogruM,TsubotaK：Tearfulrelations：oxidativestress,inflammationandeyediseases.ArqBrasOftalmol71：72-79,20082）樋口明弘，坪田一男：ドライアイ活性酸素仮説．あたらしい眼科25：1639-1645,20083）木村和博：炎症性サイトカインtumornecrosisfactor-aによる培養角膜上皮バリアー破綻の機序．日眼会誌114：935-943,20104）BasuroyS,SethA,EliasBetal：MAPKinteractswithoccludinandmediatesEGF-inducedpreventionoftightjunctiondisruptionbyhydrogenperoxide.BiochemJ393：69-77,20065）YoshikawaT,NaitoY,TanigawaTetal：Freeradicalscavengingactivityofthenovelanti-ulceragentrebamipidestudiedbyelectronspinresonance.Arzneimittelforschung43：363-366,19936）AugustinAJ,SpitznasM,KavianiNetal：Oxidativereactionsinthetearfluidofpatientssufferingfromdryeyes.GraefesArchClinExpOphthalmol233：694-698,19957）横井則彦：眼表面上皮のバリアー機能と疾患への応用．眼科NewInsight10：14-29,19978）HashimotoK,OshimaT,TomitaTetal：Oxidativestressinducesgastricepithelialpermeabilitythroughclaudin-3.BiochemBiophysResCommun376：154-157,20089）TanitoM,TakanashiT,KaidzuSetal：CytoprotectiveeffectsofrebamipideandcarteololhydrochlorideagainstultravioletB-inducedcornealdamageinmice.InvestOphthalmolVisSci44：2980-2985,2003＊＊＊（93）あたらしい眼科Vol.29，No.9，20121269

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カルテオロール塩酸塩LA点眼液「わかもと」のヒト角膜 上皮細胞への影響と保存効力の検討

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