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小児細菌性外眼部感染症に対するトスフロキサシントシル酸塩水和物点眼液0.3％の臨床的評価および原因菌の薬剤感受性

admin — Tue, 30 Dec 2014 15:24:26 +0000

《原著》あたらしい眼科31（12）：1857.1866，2014c小児細菌性外眼部感染症に対するトスフロキサシントシル酸塩水和物点眼液0.3％の臨床的評価および原因菌の薬剤感受性大野重昭＊1田中知暁＊2久志本理＊3＊1医療法人社団愛心館愛心メモリアル病院眼科＊2富山化学工業株式会社綜合研究所製品企画部＊3富山化学工業株式会社開発管理部ClinicalEvaluationofTosufloxacinTosilateOphthalmicSolution0.3％fortheTreatmentofExternalBacterialOcularInfectioninChildrenandSusceptibilityofthePathogenicBacteriatoTosufloxacinShigeakiOhno1）,TomoakiTanaka2）andSatoruKushimoto3）1）DepartmentofOphthalmology,AishinMemorialHospital,2）ProductPlanningDepartment,ToyamaChemicalCo.,Ltd.,3）DataScienceandAdministrationDepartment,ToyamaChemicalCo.,Ltd.トスフロキサシン（tosufloxacin：TFLX）トシル酸塩水和物点眼液0.3％の特定使用成績調査より15歳未満の小児の症例を抜粋し，小児の細菌性外眼部感染症に対するTFLXトシル酸塩水和物点眼液0.3％の有効性と安全性を検証した．また，小児由来の原因菌の薬剤感受性を測定した．TFLXトシル酸塩水和物点眼液0.3％は，小児の外眼部感染症を認めた症例に対する有効率は96.4％（449/466例），細菌学的効果は86.7％（202/233例）であった．原因菌477株全株に対するTFLXのMIC50は≦0.06，MIC90は0.25μg/mLであった．主要な原因菌であるHaemophilusinfluenzae，StreptococcuspneumoniaeおよびStaphylococcusaureusに対してTFLXのMIC50はそれぞれ≦0.06，0.12および≦0.06μg/mLであり，moxifloxacin（MFLX）と同程度，levofloxacin（LVFX）より1.4倍，gatifloxacin（GFLX）より1.2倍，cefmenoxime（CMX）より1.32倍以上，gentamicin（GM）より8.32倍，erythromycin（EM）より32.2,048倍以上強い抗菌活性を示した．また，TFLXのMIC90はそれぞれ≦0.06，0.12および32μg/mLであり，LVFXより1.8倍，GFLXの1/4.2倍，MFLXの1/4.1倍，CMXより1.8倍以上，GMより4.64倍，EMより4.1024倍以上強い抗菌活性を示した．副作用発現率は0.2％（1/470）であった．Theefficacyandsafetyoftosufloxacin（TFLX）tosilateophthalmicsolution0.3％forthetreatmentofexternalbacterialocularinfectioninpediatricpatientswereevaluatedinaspecifiedpost-marketingsurveillance.Antibacterialactivitiesagainstpathogenicbacteriaisolatedfrompediatricpatientswerealsomeasured.Theclinicalefficacy（efficacyrate）andbacteriologicalefficacy（bacteriologicaleradicationrate）ofTFLXtosilateophthalmicsolution0.3％were96.4％（449/466patients）and86.7％（202/233patients）,respectively.TheMIC50andMIC90valuesofTFLX,anactiveformofTFLXtosilateophthalmicsolution,againstthetotalpathogenicbacteriawere≦0.06μg/mLand0.25μg/mL,respectively.TheMIC50valueofTFLXwas≦0.06,0.12,and≦0.06μg/mLagainstHaemophilusinfluenzae,Streptococcuspneumoniae,andStaphylococcusaureus,respectively,thepredominantpathogensinthissurveillance.TFLXexhibitedantibacterialactivityidenticaltomoxifloxacin（MFLX）,and1-4,1-2,1-32,8-32,and32-2,048foldmorepotentantibacterialactivitythanlevofloxacin（LVFX）,gatifloxacin（GFLX）,cefmenoxime（CMX）,gentamicin（GM）,anderythromycin（EM）,respectively.TheMIC90valueofTFLXwas≦0.06,0.12,and32μg/mLagainstH.influenzae,S.pneumoniaeandS.aureus,respectively,andTFLXexhibited1-8,1/4-2,1/4-1,1-8,4-64,and4-1024foldmorepotentantibacterialactivitythanLVFX,GFLX,MFLX,CMX,GM,andEM,respectively.Anadversedrugreactionwasobservedin1of470patients（0.2％）.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）31（12）：1857.1866,2014〕〔別刷請求先〕大野重昭：〒065-0027札幌市東区北27条東1丁目1-15医療法人社団愛心館愛心メモリアル病院眼科Reprintrequests：ShigeakiOhno,M.D.,Ph.D.,DepartmentofOphthalmology,AishinMemorialHospital,1-15North27East1,Higashi-ku,Sapporo065-0027,JAPAN0910-1810/14/\100/頁/JCOPY（119）1857Keywords：トスフロキサシントシル酸塩水和物点眼液，トスフロキサシン，小児，製造販売後調査，薬剤感受性，有効性，安全性．tosufloxacintosilateophthalmicsolution,tosufloxacin,pediatricpatient,post-marketingsurveillance,antibacterialactivities,clinicalefficacy,safety.はじめにトスフロキサシン（tosufloxacin：TFLX）トシル酸塩水和物点眼液0.3％（販売名：オゼックスR点眼液0.3％，トスフロR点眼液0.3％）は，2006年に上市されたニューキノロン系抗菌点眼薬であり，新生児を含む小児を対象とした臨床試験を行い，国内で初めて小児に対する用法・用量が認められた抗菌点眼薬である．今回，TFLXトシル酸塩水和物点眼液0.3％の特定使用成績調査より15歳未満の小児の症例を抜粋し，小児における細菌性外眼部感染症に対するTFLXトシル酸塩水和物点眼液0.3％の有効性と安全性，ならびに小児における外眼部感染症由来菌の各種抗菌薬に対する薬剤感受性を評価した．I材料および方法1.使用症例「オゼックス/トスフロ点眼液0.3％特定使用成績調査─低頻度臨床分離株の集積とオゼックス/トスフロ点眼液の有効性と安全性の確認─」1）1,269例および「オゼックス/トスフロ点眼液0.3％特定使用成績調査─新生児の細菌性外眼部感染症に対するオゼックス/トスフロ点眼液の有効性と安全性の検討─」2）57例のうち，15歳未満の小児の症例485例を抜粋した．なお，0歳児において，生後4週未満を新生児，生後4週.1歳未満を乳児に区分した．2.症例の組み入れ，有効性，安全性の基準a.症例の組み入れ基準眼瞼炎，涙.炎，麦粒腫，結膜炎，瞼板腺炎，角膜炎（角膜潰瘍を含む）と診断された以下の患者を対象とした．①細菌性外眼部感染症の症状が明らかに認められ，本剤投薬前に細菌学的検査の実施を予定している患者．②本剤投薬開始時に，他の抗菌薬の併用が必要ないと判断された患者．③再来院でき，経過観察が可能な患者．ただし，以下の患者は安全性解析の対象から除外した．①本剤の成分およびキノロン系抗菌薬に対し過敏症の既往歴のある患者．②本調査に一度組み入れられたことのある患者．③用法・用量を逸脱した患者．④その他，担当医師が対象として不適当と認めた患者．また，以下の患者は有効性解析の対象から除外し，これらの患者から検出された菌株は感受性測定の対象から除外した．1858あたらしい眼科Vol.31，No.12，2014①本剤投薬前に，他の抗菌薬が使用された患者．②投薬開始直前および投薬7日後までに所定の観察が実施されていない患者．③投薬開始直前および投薬7日後までに所定の検査が実施されていない患者．④投薬開始直前の細菌学的検査において細菌が陰性であった患者．また，対象眼重症度は担当医師判定で行った．b.有効性判定基準担当医師が，投薬開始直前，投薬期間中ならびに投薬終了時に下記の自覚症状，他覚的所見について観察を行い，症状および所見の程度を，3＋：強度または多量，2＋：中等度または中等量，1＋：軽度または少量，±：ごく軽度またはごく少量，.：なし，の5段階で評価した．ただし，1歳未満の乳児は自覚症状の訴えを確認できないため，他覚的所見のみで判定した．自覚症状：流涙，異物感，眼痛，羞明，霧視，そう痒感他覚的所見：眼脂，結膜充血，結膜浮腫，眼瞼発赤，眼瞼腫脹，流涙，角膜浮腫，角膜浸潤，涙.膿汁逆流担当医師が，投薬前後の症状の推移から総合的に判断し，臨床効果を1：有効，2：無効，で判定した．有効率の算出は，有効例数/（有効例数＋無効例数）×100（％）とし，判定不能の症例は有効率の母数から除いた．c.安全性判定基準本剤の投与中に生じたあらゆる好ましくない，あるいは意図しない徴候，症状，または病気のうち，本剤との因果関係が明確に否定できないものを副作用とした．3.使用菌株「オゼックス/トスフロ点眼液0.3％特定使用成績調査」1,2）において2006.2009年に分離された菌株のうち，小児からの分離菌株を用いた．試験菌株は試験実施までスキムミルクを用い.70℃以下に凍結保存したものを用いた．4.使用薬剤被験薬剤として，TFLX，levofloxacin（LVFX），gatifloxacin（GFLX），moxifloxacin（MFLX），cefmenoxime（CMX）gentamicin（GM），erythromycin（EM）の7薬剤を用いた．(，)また，Staphylococcusspp.にはoxacillin（MPIPC），Streptococcuspneumoniaeにはbenzylpenicillin（PCG），Haemophilusinfluenzaeにはampicillin（ABPC）を追加した．5.薬剤感受性測定本研究では生育が認められた菌について，病原性などを考（120）慮しグループ分類した採用基準（表1）から上位のグループに属する菌を原因菌とし，本剤の最小発育阻止濃度（MIC）を測定した．MICの測定は，ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute（CLSI）標準法に準じた微量液体希釈法3.6）で行った．測定にはフローズンプレート（栄研化学）を用いた．プレートは.70℃以下に保存した．測定濃度範囲は128.0.06μg/mLの2倍希釈系列，12段階とした．ただし，TFLXは16.0.06μg/mLの9段階とした．感性および耐性株の分類は，CLSIの規定4）を参考とし，StaphylococcusaureusはMPIPCのMIC値が2μg/mL以下のものを感性株（methicillin-susceptibleS.aureus：MSSA），4μg/mL以上のものを耐性株（methicillin-resistantS.aureus：MRSA）とした．S.pneumoniaeはPCGのMIC値が0.06μg/mL以下のものを感性株（penicillin-susceptibleS.pneumoniae：PSSP），0.12.1μg/mLのものを中程度耐性株（penicillin-intermediate-resistantS.pneumoniae：PISP），2μg/mL以上のものを耐性株（penicillin-resistant表1原因菌のGroup分類GroupIStaphylococcusaureusStreptococcuspyogenes（GroupA）StreptococcuspneumoniaeEnterococcussp.Citrobactersp.Enterobactersp.Escherichiasp.Proteussp.Morganellasp.SerratiamarcescensOtherEnterobacteriaceaeNeisseriagonorrhoeaeOtherNeisseriaOtherMoraxellaAcinetobactersp.Achromobactersp.Haemophilussp.PseudomonasaeruginosaOtherPseudomonassp.GroupIIStreptococcusagalactiae（GroupB）Streptococcus（GroupC）OtherStreptococcus（GroupD,G；nongrouped；viridans）Branhamella（Moraxella）catarrhalisGroupIIIStaphylococcusepidermidisOthercoagulasenegativeStaphylococcusMicrococcussp.Bacillussp.Corynebacteriumsp.（diphtheroids）PropionibacteriumacnesS.pneumoniae：PRSP）とした．H.influenzaeはCLSIに基準がないため，b-lactamase産生性が陰性で，ABPCのMIC値が1μg/mL以下のものを感性株（b-lactamase-nonproducingABPC-susceptibleH.influenzae：BLNAS），2μg/mL以上のものを耐性株（b-lactamase-negativeABPC-resistantH.influenzae：BLNAR）とした．b-lactamase定性試験はニトロセフィンスポットプレート法にて実施した．II結果1.症例構成症例構成を図1に示す．各試験から抜粋された小児の総症例数485例のうち470例を安全性解析対象症例および有効性解析対象症例とした．そこから投薬開始時に菌が陰性であったなどの理由で除外された75例を除いた395例を原因菌別臨床効果解析対象症例とした．さらに，これらから投与後の菌検査が実施されていないなどの理由で除外された162例を除いた233例を細菌図1症例構成原因菌別臨床効果集計対象症例395例安全性解析対象症例470例有効性解析対象症例470例調査完了症例485例細菌学的効果解析対象症例233例安全性解析集計対象除外症例目的外使用で1日1回のみ投薬された症例8例1日7回以上投薬された症例3例その他4例計15例有効性解析集計対象除外症例0例原因菌別臨床効果集計対象除外症例投薬開始時に菌陰性化30例臨床効果が判定不能23例その他22例計75例細菌学的効果解析対象除外症例後検査なし160例臨床効果が判定不能2例計162例（121）あたらしい眼科Vol.31，No.12，20141859学的効果解析対象症例とした．2.患者背景安全性解析対象症例および有効性解析対象症例470例における人口統計学的およびその他の基準値の特性を表2に示す．年齢別の患者数は0歳（乳児）が最も多く，全体の29.6％（139/470例）を占めた．ついで3.5歳が24.0％（113/470例），1.2歳が23.4％（110/470例），0歳（新生児）が15.5％（73/470例），6.14歳が7.4％（35/470例）の順であった．対象疾患別では結膜炎が83.8％（394/470例）と最も多く，ついで涙.炎が8.9％（42/470例），麦粒腫が4.7％（22/470例），眼瞼炎が2.3％（11/470例），角膜潰瘍が0.2％（1/470例）の順であった．対象眼重症度は重症が4.0％（19/470例），中等症が57.0％（268/470例），軽症が38.9％（183/470例）であった．3.分離材料原因菌別の分離頻度を図2Aに示す．小児眼感染症患者の有効性解析対象症例470例の原因菌477株のうち，H.influenzaeが196株（41.1％）で最も多く，ついでS.pneumoniaeが79株（16.6％），S.aureusが55株（11.5％），a-hemolyticStreptococcusが34株（7.1％），Corynebacteriumspp.が28株（5.9％），Staphylococcusepidermidisが26株（5.5％），Moraxellacatarrhalisが23株（4.8％）であった．年齢別の原因菌は，0歳（新生児）ではS.aureusが一番多かったが，その他の年齢ではいずれもH.influenzaeが一番多かった．また，原因菌をグラム陽性菌とグラム陰性菌に分けると，0歳（新生児），0歳（乳児）および6.14歳ではグラム陽性菌がそれぞれ89.6％，51.4％および70.0％と過半数を占めており，1.2歳および3.5歳ではグラム陰性菌がそれぞれ75.2％および62.2％と過半数を占めていた（図2B）．4.原因菌の薬剤感受性原因菌477株全株に対する各抗菌薬の抗菌活性（MICrange，MIC50およびMIC90）を表3に示す．TFLXのMIC50は≦0.06，MIC90は0.25μg/mLであった．その他の抗菌薬のMIC90をTFLXと比較すると，TFLXはMFLXと同程度，LVFXの4倍，GFLXの2倍，CMXの16倍，GMの64倍，EMの512倍以上の強い抗菌活性を示した．おもな菌種のMIC50およびMIC90を図3に示す．a.H.infl196株：うちBLNAS104株，BLNAR75株）BLNASに対するMIC50はTFLX，LVFX，GFLX，MFLXおよびCMXが≦0.06μg/mL，ついでGMが1μg/mL，EMが4μg/mLであった．MIC90はTFLX，LVFX，GFLXおよびMFLXが≦0.06μg/mL，ついでCMXが0.25μg/mL，表2人口統計学的およびその他の基準値の特性背景因子結膜炎n＝394（83.8）涙.炎n＝42（8.9）麦粒腫n＝22（4.7）眼瞼炎n＝11（2.3）角膜潰瘍n＝1（0.2）合計n＝4700歳（新生児）0歳（乳児）64（16.2）102（25.9）9（21.4）29（69.0）0（0）1（4.5）0（0）7（63.6）0（0）0（0）73（15.5）139（29.6）年齢（歳）1.2歳3.5歳100（25.4）102（25.9）3（7.1）1（2.4）4（18.2）9（40.9）3（27.3）1（9.1）0（0）0（0）110（23.4）113（24.0）6.14歳26（6.6）0（0）8（36.4）0（0）1（100）35（7.4）性別男女224（56.9）170（43.1）20（47.6）22（52.4）7（31.8）15（68.2）5（45.5）6（54.5）0（0）1（100）256（54.5）214（45.5）軽症159（40.4）7（16.7）8（36.4）9（81.8）0（0）183（38.9）対象眼重症度中等症223（56.6）31（73.8）12（54.5）2（18.2）0（0）268（57.0）重症12（3.0）4（9.5）2（9.1）0（0）1（100）19（4.0）眼の基礎疾患・なし368（93.4）30（71.4）21（95.5）10（90.9）1（100）430（91.5）合併症あり26（6.6）12（28.6）1（4.5）1（9.1）0（0）40（8.5）本剤投薬前6日以内の抗菌薬治療なしあり不明379（96.2）10（2.5）5（1.3）24（57.1）15（35.7）3（7.1）22（100）0（0）0（0）10（90.9）0（0）1（9.1）1（100）0（0）0（0）436（92.8）25（5.3）9（1.9）眼科領域のなし328（83.2）35（83.3）19（86.4）10（90.9）1（100）393（83.6）併用薬あり66（16.8）7（16.7）3（13.6）1（9.1）0（0）77（16.4）眼科領域以外の併用薬なしあり不明381（96.7）12（3.0）1（0.3）40（95.2）2（4.8）0（0）16（72.7）6（27.3）0（0）9（81.8）2（18.2）0（0）1（100）0（0）0（0）447（95.1）22（4.7）1（0.2）症例数（％）1860あたらしい眼科Vol.31，No.12，2014（122）AAcinetobacterspp.TheothersB小児原因菌n＝477H.influenzae196,41.1％S.pneumoniae79,16.6％S.aureus55,11.5％a-hemolyticStreptococcus34,7.1％Corynebacteriumspp.28,5.9％M.catarrhalis23,4.8％S.epidermidis26,5.5％25,5.2％11,2.3％0％20％40％60％80％100％6～14歳3～5歳1～2歳0歳（乳児）0歳（新生児）■Streptococcuspneumoniae■Staphylococcusaureus■a-hemolyticStreptococcus■Corynebacteriumspp.■Staphylococcusepidermidis■陽性菌その他■Haemophilusinfluenzae■Moraxellacatarrhalis■陰性菌その他図2原因菌別分離頻度および年齢別のグラム陽性菌とグラム陰性菌の比率表3原因菌に対する各抗菌薬の抗菌活性抗菌薬TFLXLVFXGFLXMFLXCMXGMEMMIC（μg/mL）RangeMIC50≦0.06.＞16≦0.06≦0.06.＞1280.12≦0.06.128≦0.06≦0.06.64≦0.06≦0.06.＞1280.25≦0.06.＞1281≦0.06.＞1284MIC900.2510.50.25416＞1280.010.1MIC501101001,0000.010.1MIC90110（μg/mL）1001,000S.pneumoniae（79）PSSP（47）PISP/PRSP（32）S.aureus（55）MSSA（44）MRSA（11）a-hemolyticStreptococcus（34）Corynebacteriumspp.（28）S.epidermidis（17）H.influenzae（196）BLNAS（104）BLNAR（75）M.catarrhalis（23）TFLXLVFXGFLXMFLXCMXGMEM図3各菌種のMIC50およびMIC90GMが2μg/mL，EMが8μg/mLであった．BLNARに対およびMFLXが≦0.06μg/mL，ついでCMXが0.5μg/するMIC50はTFLX，LVFX，GFLXおよびMFLXが≦0.06mL，GMが2μg/mL，EMが8μg/mLであった．μg/mL，ついでCMXが0.25μg/mL，GMが1μg/mL，EMが4μg/mLであった．MIC90はTFLX，LVFX，GFLX（123）あたらしい眼科Vol.31，No.12，20141861表4疾患別および重症度別の臨床効果（有効率）臨床効果有効率（％）95％信頼区間（％）有効無効判定不能合計対象疾患結膜炎38110339497.495.3.98.8涙.炎35614285.470.8.94.4麦粒腫22002210084.6.100眼瞼炎11001110071.5.100角膜潰瘍010100.97.5重症度別軽症1802118398.996.1.99.9中等症25312326895.592.2.97.6重症16301984.260.4.96.6合計44917447096.494.2.97.9有効率，95％信頼区間の算出に関しては，分母から判定不能を除く．信頼区間は，F分布に基づく正確な信頼区間を算出した．b.S.pneumoniae（79株：うちPSSP47株，PISP/PRSP32株）PSSPに対するMIC50はTFLXが≦0.06μg/mL，ついでMFLXおよびCMXが0.12μg/mL，GFLXが0.25μg/mL，LVFXが0.5μg/mL，EMが2μg/mL，GMが4μg/mLであった．MIC90はTFLXおよびMFLXが0.12μg/mL，ついでGFLXおよびCMXが0.25μg/mL，LVFXが1μg/mL，GMが8μg/mL，EMが＞128μg/mLであった．PISP/PRSPに対するMIC50はTFLXおよびMFLXが≦0.06μg/mL，ついでGFLXが0.12μg/mL，LVFXおよびCMXが0.5μg/mL，GMおよびEMが8μg/mLであった．MIC90はTFLXおよびMFLXが0.12μg/mL，ついでGFLXが0.25μg/mL，LVFXおよびCMXが1μg/mL，GMが16μg/mL，EMが＞128μg/mLであった．c.S.aureus（55株：うちMSSA44株，MRSA11株）MSSAに対するMIC50はTFLX，GFLXおよびMFLXが≦0.06μg/mL，ついでLVFXが0.12μg/mL，GMおよびEMが0.5μg/mL，CMXが2μg/mLであった．MIC90はGFLXおよびMFLXが1μg/mL，ついでTFLX，LVFXおよびCMXが2μg/mL，GMが128μg/mL，EMが＞128μg/mLであった．MRSAに対するMIC50はGFLXおよびMFLXが8μg/mL，TFLXが＞16μg/mL，LVFXおよびCMXが32μg/mL，GMが64μg/mL，EMが＞128μg/mLであった．MIC90はMFLXが8μg/mL，ついでGFLXが16μg/mL，TFLXが＞16μg/mL，LVFXが64μg/mL，CMX，GMおよびEMが＞128μg/mLであった．5.臨床効果a.臨床効果有効性解析対象症例470例における疾患別および重症度別の臨床効果（有効率）とその95％信頼区間を表4に示す．有効性解析対象症例において全体の臨床効果は96.4％（449/466例）であった．各対象疾患に対する有効率は，結膜炎が97.4％（381/391例），涙.炎が85.4％（35/41例），麦粒腫が100％（22/22例），眼瞼炎が100％（11/11例）であり，角膜潰瘍（0/1例）を除き，85％を超えていた．また，重症度別の有効率は，軽症で98.9％（180/182例），中等症で95.5％（253/265例），重症で84.2％（16/19例）であった．b.原因菌別臨床効果原因菌別臨床効果解析対象症例395例における原因菌別の臨床効果（有効率）とその95％信頼区間を表5に示す．本試験において検出された原因菌に対する単独菌感染症例は335例（グラム陽性菌：145例，グラム陰性菌：190例）2菌種の複数菌感染症例は56例，3菌種の複数菌感染症例(，)は4例であった．単独菌感染症例でのトスフロキサシントシル酸塩水和物点眼液0.3％による臨床効果は，H.influenzaeで100％（160/160例）｛BLNASが100％（88/88例），BLNARが100％（58/58例）｝，S.pneumoniaeで95.9％（47/49例）｛PSSPが100％（31/31例），PISP/PRSPが88.9％（16/18例）｝，a-hemolyticStreptococcusで100％（29/29例），S.aureusで89.7％（26/29例）｛MSSAが90.0％（18/20例），MRSAが88.9％（8/9例）｝，M.catarrhalisで100％（20/20例）であった．また，複数菌に感染した症例の臨床効果は，2菌種では98.1％（53/54例），3菌種では100％（4/4例）であった．6.細菌学的効果細菌学的効果解析対象症例233例（グラム陽性菌：92例，グラム陰性菌：103例，複数菌感染：38例）における細菌学的効果（消失率）およびその95％信頼区間を表6に示す．全対象症例における細菌学的効果は86.7％（202/233例）1862あたらしい眼科Vol.31，No.12，2014（124）表5原因菌別臨床効果（有効率）原因菌臨床効果合計（例）有効率（％）95％信頼区間（％）有効無効判定不能単独菌感染グラム陽性菌S.pneumoniae47215095.986.0.99.5PSSP31013210088.8.100PISP/PRSP16201888.965.3.98.6a-hemolyticStreptococcus29013010088.1.100S.aureus26302989.772.6.97.8MSSA18202090.068.3.98.8MRSA810988.951.8.99.7S.epidermidis14101593.368.1.99.8S.capitis10011002.5.100CoagulasenegativeStaphylococcus110250.01.3.98.7Corynebacteriumspp.17101894.472.7.99.9小計1358214594.489.3.97.6グラム陰性菌H.influenzae1600016010097.7.100BLNAS88008810095.9.100BLNAR58005810093.8.100M.catarrhalis20002010083.2.100Acinetobacterspp.410580.028.4.99.5P.aeruginosa300310029.2.100K.pneumoniae10011002.5.100Moraxellaspp.010100.97.5小計1882019098.996.2.99.9複数菌感染2菌種53125698.190.1.1003菌種400410039.8.100合計38011439597.295.0.98.6有効率，95％信頼区間の算出に関しては，分母から判定不能を除く．信頼区間は，F分布に基づく正確な信頼区間を算出した．であった．また，グラム陽性菌に対しては84.8％（78/92例），グラム陰性菌に対しては89.3％（92/103例）であった．7.安全性および副作用発現症例安全性解析対象症例470例における副作用について表7に示す．全対象症例における副作用発現率は0.2％（1/470例）であり，眼瞼炎を発現した1件で投与日数1日，1日量1滴の結膜炎の6カ月女児であった．III考察今回，筆者らは，TFLXトシル酸塩水和物点眼液0.3％の特定使用成績調査より，小児の結果を抜粋し，新生児を含む小児に対する有効性および安全性を検証した．同時に，小児より分離された原因菌を用いて各種抗菌薬の薬剤感受性を測定した．本調査におけるTFLXトシル酸塩水和物点眼液0.3％の臨床効果（有効率）は全体で96.4％（449/466例）であり良好な成績であった．対象疾患別では，最も頻度の高かった結膜（125）あたらしい眼科Vol.31，No.12，20141863表6原因菌別細菌学的効果原因菌細菌学的効果合計（例）消失率（％）95％信頼区間（％）消失推定消失一部消失消失せず単独菌感染グラム陽性菌S.pneumoniae210072875.055.1.89.3PSSP110041573.344.9.92.2PISP/PRSP100031376.946.2.95.0a-hemolyticStreptococcus163012095.075.1.99.9S.aureus122051973.748.8.90.9MSSA91001010069.2.100MRSA3105944.413.7.78.8S.epidermidis111011392.364.0.99.8S.capitis100011002.5.100CoagulasenegativeStaphylococcus010011002.5.100Corynebacteriumspp.100001010069.2.100小計7170149284.875.8.91.4グラム陰性菌H.influenzae6910108087.578.2.93.8BLNAS430064987.875.2.95.4BLNAR181032286.465.1.97.1M.catarrhalis130001310075.3.100Acinetobacterspp.5000510047.8.100P.aeruginosa2001366.79.4.99.2K.pneumoniae100011002.5.100Moraxellaspp.100011002.5.100小計91101110389.381.7.94.5複数菌感染2菌種264513683.367.2.93.63菌種2000210015.8.100合計1901252623386.781.6.90.8消失率の算出に関しては，消失および推定消失を合わせて消失とした．信頼区間は，F分布に基づく正確な信頼区間を算出した．表7副作用発現率と内訳副作用発現件数/解析対象例数1/470発現率（％）0.295％信頼区間（％）0.0.1.2内訳眼瞼炎1件信頼区間は，F分布に基づく正確な信頼区間を算出した．炎は97.4％（381/391例）であった．本調査の臨床効果は，申請時の12歳以上の患者を対象としたオープン試験の成績7）（有効率：全体で93.7％，結膜炎に対して93.8％）よりもやや高かった．原因菌別の臨床効果では，単独菌感染症例に対して，97.0％（323/333例）の有効率であった．菌別では，BLNAR，PISP/PRSP，MRSAにそれぞれ100％，88.9％，88.9％と，耐性株を含む主要な菌種に対して高い臨床効果を示した．細菌学的効果（消失率）は全体で86.7％（202/233例）であった．これも申請時の結果〔消失率：79.2％（114/1441864あたらしい眼科Vol.31，No.12，2014（126）例）〕7）と比較してやや高かった．原因菌別の分離頻度では，H.influenzaeが最も高く40％程度を占めていた．ついでS.pneumoniae，S.aureus，a-hemolyticStreptococcusの順に分離頻度が高かった．秋葉らは4歳未満の乳幼児107例の細菌性結膜炎から検出された検出菌82株において，H.influenzaeが52.4％と最も多く，ついでS.pneumoniaeの20.7％，S.aureusの7.3％であったと報告しており8），今回の結果は既報と同じ傾向を示していた．さらに，月齢別でのグラム陽性菌とグラム陰性菌の比率において，生後1.6カ月ではS.pneumoniaeやS.aureusなどのグラム陽性菌が過半数を占めていたが，それ以降グラム陰性菌の比率が増え，生後25.48カ月ではグラム陰性菌が100％になったことを報告している8）．今回も同様の傾向がみられ，新生児ではグラム陽性菌が89.6％と過半数を占めていたが，徐々にその比率が下がり，1.2歳ではグラム陽性菌が24.8％を占めていた．また，3.5歳，6.14歳と年齢が上がるにつれて再びグラム陽性菌の比率が増え，6.14歳ではグラム陽性菌が70.0％を占めていた．松本らは，全症例中73.3％が40歳以上を占める集団の解析において，グラム陽性菌が全体の67.4％を占めていたことを報告しており9），年齢の上昇に伴い再びグラム陽性菌が主要な原因菌となることが示唆された．今回分離された原因菌において，S.pneumoniaeでは，79株のうち40.5％がPISPまたはPRSPであった．PISPまたはPRSPに対するLVFXのMIC90は1μg/mLであったが，その他のキノロン系抗菌薬のMIC90は0.12または0.25μg/mLであり，強い抗菌活性を示した．一方で，EMはMIC90が＞128μg/mLであり，耐性化が認められた．S.aureusでは，20.0％がMRSAであった．2004年から2007年に細菌性結膜炎患者から分離された検出菌において，S.aureus97株中19.6％（19株）がMRSAであったことを松本らが報告している9）が，今回のMRSAの分離頻度と類似していた．MRSAは今回感受性測定を実施したいずれの抗菌薬に対しても感受性の低下が認められた．H.influenzaeでは，196株のうち38.3％の75株がBLNARであった．堀らは市中病院における外眼部感染症から分離されたH.influenzae412株のうち，BLNARは46.6％の192株であったと報告しているが10），今回の結果でも40％近くの分離頻度であった．BLNARに対して，キノロン系抗菌薬のMIC90はいずれも≦0.06μg/mLであり，強い抗菌活性を示した．H.influenzaeは小児の細菌性結膜炎の主要な起炎菌であるが，今回の結果からはキノロン系抗菌薬はBLNARに対して強い抗菌活性を示した．副作用は，安全性解析対象症例470例中，6カ月の結膜炎女児に発現した眼瞼炎1件であった．本結果からは安全であると考えられるが，今後も情報収集に努める必要がある．（127）近年，成人領域ではキノロン耐性のH.influenzaeも分離され11），S.pneumoniaeもキノロン耐性化率の上昇が懸念される．小児では，生後6カ月から5歳くらいまでは自己の免疫能が未熟なため，S.pneumoniaeやH.influenzaeの鼻咽頭の健常保菌率が50.60％程度と非常に高い12,13）．このように普段から病原菌を保菌している小児に対し，広くキノロン系抗菌点眼薬を使用すれば，キノロン耐性H.influenzaeやS.pneumoniaeが生じやすくなることは容易に想像できる．眼科医の小児に対するキノロン系抗菌薬の処方については今後さらに十分検討していくことが重要である．しかしながら，病状の経過を自分で表現できない子供の場合，小児眼感染症が重症化する前に短期間でしっかりと病原菌をたたき，治療を行うことは重要であると考える．また，TFLXトシル酸塩水和物点眼液の「用法用量に関連する使用上の注意」には，「小児においては，成人に比べて短期間で治療効果が認められる場合があることから，経過を十分観察し，漫然と使用しないよう注意すること」と注意喚起もされ，短期治療を念頭に処方されていることから，TFLXトシル酸塩水和物点眼液により耐性菌を生じやすくする恐れは必ずしも高くないと考える．一方，CMXなどのb-ラクタム系薬も治療の選択肢として有効ではあるが，TFLXに比し主要な眼感染症起因菌に対し抗菌活性が劣る．また，近年，眼感染症起因菌においても，バイオフィルム形成が臨床的に問題となっており，バイオフィルム形成菌に対してはb-ラクタム系薬よりもキノロン系薬を，また，キノロン系薬のなかでも目標とする菌に対して，より強い抗菌活性を示す薬剤を選択すべきである14）といわれている．小児の眼感染症は早期に十分治療しなければ，将来のある幼小児の視機能を損ないかねないこともある．キノロン系薬は耐性菌の出現にも十分注意を払う必要があることも念頭におきながら，キノロン系薬での治療が有効であると思われる症例では，短期間で集中的に治療を行うことも重要である．以上，本調査で分離された原因菌の分離頻度ならびに耐性化率は，これまでの報告と同様の傾向が認められた．また，臨床効果ならびに細菌学的効果ともに申請時の試験と比べて低下は認められなかった．耐性菌の動向に注意を払う必要はあるが，小児の細菌性外眼部感染症においてTFLXトシル酸塩水和物点眼液0.3％は高い有効性と安全性を有する薬剤であると考えられた．文献1）西田輝夫，宮永嘉隆，大野重昭：トスフロキサシントシル酸塩水和物点眼液の有効性・安全性および低頻度分離株に対する有効性の確認．臨眼68：1509-1519,20142）宮永嘉隆，東範行，大野重昭：新生児の外眼部細菌感染あたらしい眼科Vol.31，No.12，20141865症に対するトスフロキサシントシル酸塩水和物点眼液の有効性と安全性の検討．臨眼65：1043-1049,20113）ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute.Methodsfordilutionantimicrobialsusceptibilitytestsforbacteriathatgrowaerobically；Approvedstandard-seventhedition.M7-A7.CLSI,Wayne,PA,20064）ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute.Performancestandardsforantimicrobialsusceptibilitytesting；seventeenthinformationalsupplement.M100-S17.CLSI,Wayne,PA,20075）ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute.Methodsforantimicrobialdilutionanddisksusceptibilitytestingofinfrequentlyisolatedorfastidiousbacteria；Approvedguideline.M45-A.CLSI,Wayne,PA,20066）ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute.Methodsforantimicrobialsusceptibilitytestingofanaerobicbacteria；Approvedstandard-seventhedition.M11-A7.CLSI,Wayne,PA,20077）北野周作，宮永嘉隆，大野重昭ほか：新規ニューキノロン系抗菌点眼薬トシル酸トスフロキサシン点眼液の細菌性外眼部感染症を対象とするオープン試験．あたらしい眼科23：68-80,20068）秋葉真理子，秋葉純：乳幼児細菌性結膜炎の検出菌と薬剤感受性の検討．あたらしい眼科18：929-931,20019）松本治恵，井上幸次，大橋裕一ほか：多施設共同による細菌性結膜炎における検出菌動向調査．あたらしい眼科24：647-654,200710）堀武志，秦野寛：急性細菌性結膜炎の疫学．あたらしい眼科6：81-84,198911）YokotaS,OhkoshiY,SatoKetal：Emergenceoffluoroquinolone-resistantHaemophilusinfluenzaestrainsamongelderlypatientsbutnotamongchildren.JClinMicrobiol46：361-365,200812）HashidaK,ShiomoriT,HohchiNetal：NasopharyngealHaemophilusinfluenzaecarriageinJapanesechildrenattendingday-carecenters.JClinMicrobiol46：876-881,200813）HashidaK,ShiomoriT,HohchiNetal：NasopharyngealStreptococcuspneumoniaecarriageinJapanesechildrenattendingday-carecenters.IntJPediatrOtorhinolaryngol75：664-669,201114）井上幸次，池田欣史，藤原弘光ほか：眼感染症由来Staphylococcusepidermidisが形成したInVitroバイオフィルムに対するトスフロキサシン点眼液の殺菌効果．あたらしい眼科29：91-98,2012＊＊＊1866あたらしい眼科Vol.31，No.12，2014（128）

眼感染症由来Staphylococcus aureusの In Viroバイオフィルム形成に及ぼすグルコースの影響と抗菌点眼薬の殺菌効果

admin — Tue, 29 Apr 2014 15:27:31 +0000

《第50回日本眼感染症学会原著》あたらしい眼科31（4）：571.580，2014c眼感染症由来StaphylococcusaureusのInVitroバイオフィルム形成に及ぼすグルコースの影響と抗菌点眼薬の殺菌効果神鳥美智子＊1井上幸次＊1池田欣史＊1藤原弘光＊2高畑正裕＊3髙倉真理子＊3＊1鳥取大学医学部視覚病態学＊2鳥取大学医学部附属病院検査部＊3富山化学工業株式会社綜合研究所InfluenceofGlucoseonInVitroBiofilmFormationbyStaphylococcusaureusIsolatedfromOcularInfection；BactericidalActivityofAntibacterialOphthalmicSolutionMichikoKandori1）,YoshitsuguInoue1）,YoshifumiIkeda1）,HiromitsuFujiwara2）,MasahiroTakahata3）andMarikoTakakura3）1）DivisionofOphthalmologyandVisualScience,FacultyofMedicine,TottoriUniversity,2）3）ResearchLaboratoriesToyamaChemicalCo.,Ltd.TottoriUniversityHospital,目的：糖尿病患者の涙液中グルコース濃度は健常人に比べ高く，結膜.常在菌に影響している可能性がある．そこで，眼感染症由来Staphylococcusaureus（S.aureus）のinvitroバイオフィルム形成に及ぼすグルコースの影響を調べるとともに，バイオフィルム形成菌に対する抗菌点眼薬の殺菌効果を検討した．方法：鳥取大学医学部附属病院の眼感染症患者から分離されたキノロン感受性S.aureus3株を用い，メンブレンフィルター（MF）上のバイオフィルム形成に及ぼすグルコースの影響をMF静置寒天平板培地にこれを添加することで検討した．また，トスフロキサシン，レボフロキサシン，セフメノキシムの各点眼液を最小発育阻止濃度（minimuminhibitoryconcentration：MIC）の30倍濃度（30MIC）でバイオフィルム形成菌に24時間作用させ，生菌数変化，さらに走査型電子顕微鏡による形態観察で殺菌効果を評価した．結果：S.aureusバイオフィルムの成熟度はグルコース濃度（0％，0.01％，0.1％および1.0％）に比例し増大した．0.1％グルコース存在下，バイオフィルム形成菌に対するトスフロキサシン点眼液30MIC作用時の殺菌効果は，いずれの場合も比較点眼液より有意に強かった．結論：S.aureusによるバイオフィルムの成熟度はグルコース濃度の影響を受けることから，糖尿病患者に対する抗菌点眼薬の選択においては，バイオフィルムにより効果のある薬剤を考慮する必要があると考えられた．Purpose：Tearglucoseconcentrationishigherindiabeticpatientsthaninhealthysubjectsandmayinfluenceconjunctivalflora.TheinfluenceofglucoseoninvitrobiofilmformationwasexaminedusingStaphylococcusaureusisolatedfrompatientswithocularinfection.Alsoinvestigatedwerethebactericidaleffectsofantibacterialophthalmicsolutionsagainstbiofilmbacteria.MaterialsandMethods：Usingthreequinolone-susceptibleS.aureusisolatesfrompatientswithocularinfectionatTottoriUniversityHospital,weexaminedtheinfluenceofglucoseonbiofilmformationonmembranefilter（MF）byaddingglucosetotheagarplateontheMF.Bactericidalactivitiesoftosufloxacin（TFLX）,levofloxacin（LVFX）andcefmenoxime（CMX）ophthalmicsolutionswereexaminedbycountingviablecellsremainingafterexposureofS.aureusbiofilmtothoseagentsatconcentrations30-foldtheirrespectiveminimuminhibitoryconcentrations（MIC）,andbyobservationunderascanningelectronmicroscope（SEM）Results：ThedegreeofS.aureusbiofilmmaturationincreasewasdependentontheglucoseconcentration（0％,(.)0.01％,0.1％and1.0％）.With0.1％glucose,thebactericidaleffectofthetosufloxacinophthalmicsolutionwassignificantlymorepotentthantheotherophthalmicsolutions.Conclusion：SincethedegreeofS.aureusbiofilmmaturationwasaffectedbyglucoseconcentration,itissuggestedthattheantibacterialophthalmicsolutionmostpotentagainstbiofilmbeselectedfordiabeticpatients.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）31（4）：571.580,2014〕〔別刷請求先〕井上幸次：〒683-8504米子市西町36-1鳥取大学医学部視覚病態学教室Reprintrequests：YoshitsuguInoue,M.D.,Ph.D.,DivisionofOphthalmologyandVisualScience,FacultyofMedicine,TottoriUniversity,36-1Nishi-cho,Yonago,Tottori683-8504,JAPAN0910-1810/14/\100/頁/JCOPY（93）571Keywords：黄色ブドウ球菌，グルコース，バイオフィルム，トスフロキサシン，点眼薬，殺菌効果．Staphylococcusaureus,glucose,biofilm,tosufloxacin,ophthalmicsolution,bactericidaleffect.はじめにグラム陽性菌のStaphylococcusaureus（S.aureus）は眼感染症の代表的な疾患である結膜炎や角膜炎の主要な起因菌である1）．また，発症頻度は低いものの，急性術後眼内炎の起因菌としてもStaphylococcusepidermidis（S.epidermidis）を含むコアグラーゼ陰性ブドウ球菌やS.aureusの割合が高い2,3）．S.epidermidisやS.aureusはヒトの結膜.内細菌叢に常在しており，このことが多くの眼感染症の起因菌になる理由と考えられる．分離比率はS.epidermidisが常に最も高いが，糖尿病患者ではS.epidermidisに次ぐS.aureusの比率が健常人より高いとの報告がある4）．眼感染症では周術期創部などから常在菌が侵入し，縫合糸などへの菌の定着の後，バイオフィルムを形成するケースや，治療に用いられる眼内レンズなどのバイオマテリアルに形成されたバイオフィルム菌などが発症に関与している場合がある5.7）．バイオフィルム形成後の菌の生育はslow-growingあるいはnondividinggrowthの状態にあると同時に，菌体を覆うexopolysaccharidematrixの薬剤低透過性などにより，抗菌薬の殺菌作用を回避すること，また，その成熟度が増した場合，抗菌薬の殺菌作用はさらに減弱されるので，治療の難渋化を招いていることが報告されている5,8,9）．筆者らは先に，メチシリンおよびキノロン感受性S.epidermidisを用いてinvitroで作製したバイオフィルム形成菌に対するフルオロキノロン系点眼薬とb-ラクタム系点眼薬の殺菌効果を検討した．その結果，いずれの薬剤もバイオフィルム形成菌に対する殺菌効果は浮遊菌（planktonic菌）の場合より減弱すること，また，バイオフィルム形成菌に対する殺菌効果はb-ラクタム系点眼薬よりフルオロキノロン系点眼薬が強いが，その作用はフルオロキノロン系点眼薬間でも差異が認められるとの成績を得た10）．眼感染症起因菌においてS.epidermidisと並び分離頻度の高いS.aureusでは，バイオフィルム形成時，生育環境に存在するグルコースによりバイオフィルム成熟度が変化することが報告されている11,12）．ヒト涙液にはグルコース（tearglucose）が正常人で0.004.0.008％含まれているが，糖尿病患者ではこれより高く13.15），眼表面や眼内におけるS.aureusのバイオフィルム形成は正常人の場合と異なるものと考えられる．このため，定着したS.aureusが形成したバイオフィルムに対する抗菌点眼薬の殺菌作用も何らかの影響を受けている可能性が推察される．現在，眼感染症におけるバイオフィルム形成菌について，涙液中のグルコースの影響や生理的なグルコース濃度存在下での，抗菌点眼薬の殺菌効果についての報告は見当たらない．そこで，今回，眼感染症由来S.aureusのinvitroバイオフィルム形成に及ぼすグルコースの影響を調べるとともに，先回報告10）したS.epidermidisに引き続き，S.aureusバイオフィルム形成菌に対する抗菌点眼薬の殺菌効果を検討した．すなわち，2011年から2012年に鳥取大学医学部附属病院の眼感染症患者から分離されたS.aureusのうち，icaA,D遺伝子，薬剤感受性などを検討した3株を用いてinvitroバイオフィルム形成に及ぼすグルコースの影響を調べるとともに，トスフロキサシン，レボフロキサシンおよびセフメノキシム各点眼液の殺菌効果を検討した．I実験材料および方法1.使用菌株鳥取大学医学部附属病院の眼感染症患者から2011.2012年に分離されたS.aureus31株を用いた．これら分離株すべてについて，各種薬剤に対する感受性，キノロン薬耐性決定領域（quinoloneresistant-determiningregion：QRDR）遺伝子の変異およびicaA,D遺伝子の有無を調べた．2.QRDR遺伝子およびicaA，icaD遺伝子の解析DNAジャイレースおよびトポイソメラーゼIV蛋白のそれぞれのsubunitA蛋白，GyrAならびにGrlAのQRDR部位をcodeするgyrA，grlA遺伝子の主要な変異部位の解析（GyrA：Ser84,Ser85,Glu88.GrlA：Ser80,Glu84）をSreedharanら16），Ferreroら17）の報告に基づいたPCR（polymerasechainreaction）法で行った．また，バイオフィルム形成に関連するslimeの主要成分，polysaccharideintercellularadhesin（PIA）の生合成に関わるicaA，icaD遺伝子の有無をArciolaら18）の方法に基づき検討した．3.使用薬剤薬剤感受性の測定にはトスフロキサシン（富山化学工業株式会社），レボフロキサシン（LKTLaboratories,Inc），セフメノキシム（ベストコールR静注用，武田薬品工業株式会社）を用いた．また，S.aureusのメチシリン耐性の判別のため，オキサシリン（シグマアルドリッチジャパン株式会社）を使用した．Invitroバイオフィルム形成菌およびplanktonic菌に対する殺菌効果の検討には市販のトスフロキサシン点眼液（オゼックスR点眼液0.3％，大塚製薬株式会社），レボフロキサシン点眼液（クラビットR点眼液0.5％，参天製薬株式会社），セフメノキシム点眼液（ベストロンR点眼用0.5％，千寿製薬株式会社）を目的の作用濃度になるよう25％cation-572あたらしい眼科Vol.31，No.4，2014（94）adjustedMueller-Hintonbroth（CAMHB；日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）で適宜希釈し用いた．いずれの薬剤も純度あるいは含量が明らかなものを使用し，濃度は活性本体の値として示した．4.薬剤感受性の測定抗菌薬に対する感受性の測定にはCAMHBを用い，ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute（CLSI）の微量液体希釈法に基づき行った19）．メチシリンに対する感受性/耐性はCLSIの判定基準に基づき，オキサシリンに対する最小発育阻止濃度（MIC）（≦2μg/ml：感受性，≧4μg/ml：耐性）によって分類した20）．また，キノロン薬に対する感受性/耐性は同判定基準に基づき，レボフロキサシンに対するMIC（≦1μg/ml：感受性，≧4μg/ml：耐性）によって分類した．5.Planktonic菌に対する抗菌点眼薬の殺菌効果今回使用の臨床分離S.aureus31株のうち，キノロン感受性でicaA,icaD遺伝子を保有するメチシリン感受性S.aureus（methicillin-susceptibleS.aureus：MSSA）のF5820およびF-5829株，メチシリン耐性S.aureus（methicillin-resistantS.aureus：MRSA）のF-5809株を用いた（表1）．CAMHBにて37℃で一夜培養した菌を新鮮なCAMHBに接種し，さらに4時間前培養した菌液0.5mlに，リン酸緩衝液（PB：1/15mol/l,pH7.0）で5倍濃度に調整した各薬液1ml（終濃度，30MIC），10％グルコース溶液5μlまたは50μl（グルコース終濃度，0.01％または0.1％）を加え，PBで全量5mlにした培養液（CAMHB濃度：通常の10％濃度）を作製した．37℃で振盪培養し，24時間後に生菌数測定を行った（n＝1）．対照として薬剤不含の同様な10％CAMHB5mlを用い，生菌数を測定した．6.Invitroバイオフィルムの作製とグルコースの影響Planktonic菌に対する殺菌効果の試験に用いたMSSAのF-5820およびF-5829とMRSAのF-5809株の3株で検討した．Websterら21）の方法に基づき，CAMHBで一夜培養したS.aureusの菌液100μlを新鮮なCAMHB10mlに接種し，さらに3.5時間培養した．本菌液100μlを0.01％または0.1％グルコースを含み，通常の10％培地成分濃度になるよう作製したCAMHB10mlに懸濁した．その25μlを0.01％および0.1％のグルコースを含んだ10％培地成分濃度のMueller-Hintonagar（MHA,日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）を平板上に置いたmembranefilter（MF,DuraporeRMembraneFilter0.45μmHV；Millipore）に滴下した（n＝3）．グルコース濃度0.01％は健常人涙液中濃度，0.1％は糖尿病患者涙液中に含まれるグルコース濃度に近似すると考え検討した13.15）．なお，別にバイオフィルム形成に及ぼす詳細なグルコース濃度（0，0.01，0.1および1％）の影響はMSSAF-5820株を用い調べた．（95）37℃，48時間培養後，走査型電子顕微鏡（SEM：HITACHIS-3400）を用いてバイオフィルム像を観察した．SEM像の観察に当たっては，試料を1.5％glutaraldehyde（和光純薬工業株式会社）にて1時間，さらに1％osmiumtetroxide（TAABLaboratories）に18時間浸漬し固定した．アルコール脱水-酢酸イソアミル（和光純薬工業株式会社）置換を経た後，臨界点乾燥を行った試料を白金-パナジウム蒸着した．7.Invitroバイオフィルム形成菌に対する抗菌点眼薬の殺菌効果0.01％あるいは0.1％グルコースを含む10％培地成分濃度のMHA上に静置したMFに菌液を滴下し，37℃，24時間培養した後，MFを各薬剤30MICを含む新しいMHA上に移した．さらに37℃，24時間培養した後，生菌数を測定した．作用濃度（30MIC）はトスフロキサシン頻回反復点眼時の結膜.内濃度などを参考にした22）．なお，MRSAF-5809株の場合はセフメノキシム点眼液の溶解必要濃度が高すぎることから薬剤含有MHAが作製できず，トスフロキサシン点眼液とレボフロキサシン点眼液のみで殺菌効果を検討した．生菌数の測定に当たっては上述のMFをMulti-BeadsShockerR（安井器械株式会社）で破砕，ホモジナイズした試料を適宜希釈し，MHA平板に塗布し，生育コロニー数を計測した．得られた生菌数は各比較群間でパラメトリックDunnett型多重比較による有意差検定を行った．また，SEMでバイオフィルムに対する薬剤作用像を観察した．II結果1.使用菌株の各種抗菌薬に対する感受性，GyrAおよびGrlA蛋白におけるQRDR部位のアミノ酸変異，icaA，icaD遺伝子の解析S.aureus31株に対するトスフロキサシンとレボフロキサシン，またはセフメノキシムとのMIC相関図を図1に示す．トスフロキサシンは試験株すべてに対し，レボフロキサシンおよびセフメノキシムと同等か，2.512倍以上強い抗菌活性を示した．31株中，MRSAは22株（71.0％），キノロン耐性S.aureusは18株（58.1％）であった．また，キノロン耐性S.aureus18株のQRDR部位における最も頻度の高い変異株はGyrAのSer84Leu,Glu88Gly変異およびGrlAのSer80Tyr,Glu84Lys変異を同時に保有する株であった（7株/18株，38.9％）．icaA,icaD遺伝子については今回使用した眼由来臨床分離株は31株すべて両遺伝子を保有していた．バイオフィルム形成菌に対する殺菌効果の検討に使用した3菌株の各遺伝子の解析および薬剤感受性の結果を表1に示す．GyrA，GrlAのQRDR主要部位に変異は認められず，キノロン薬に感受性で，MICはトスフロキサシンが0.0313あたらしい眼科Vol.31，No.4，2014573トスフロキサシMIC（μg/ml）≧1684210.50.250.1250.06≦0.03111136311114315533≦0.030.1250.528≦0.030.1250.5280.060.2514≧160.060.2514≧16レボフロキサシンMIC（μg/ml）セフメノキシムMIC（μg/ml）図1Staphylococcusaureus31株に対するトスフロキサシンとレボフロキサシン，またはセフメノキシムとのMIC相関図相関図中の数値は株数．いずれの株もトスフロキサシンのMICはレボフロキサシン，セフメノキシムのMICと同等か，低かった．表1使用菌株の各種抗菌薬に対する感受性，icaA，icaD遺伝子の有無，およびGyrA，GrlAのアミノ酸変異菌株トスフロキサシンMIC（μg/ml）レボフロキサシンセフメノキシムオキサシリンicaA，icaD遺伝子の有無icaAicaDQRDRアミノ酸変異GyrASer84,Ser85,Glu88GrlASer80,Glu84F-58200.06250.2520.5＋＋──F-58290.03130.12521＋＋──F-58090.06250.25832＋＋──＋/─：検出/非検出．μg/mlあるいは0.0625μg/ml，レボフロキサシンは0.125μg/mlあるいは0.25μg/mlであった．また，F-5820およびF-5829株はMSSA，F-5809株はMRSAであり，セフメノキシムのMICは前2株が2μg/ml，F-5809株は8μg/mlであった（表1）．2.Planktonic菌に対する抗菌点眼薬の殺菌効果Planktonic菌に対する薬剤30MIC，24時間作用後の生菌数を図2に示す．いずれの薬剤も30MIC作用後の生菌数は薬剤無添加の場合に比べ，10.6以上減少し，検出限界以下（LogCFU/ml：≦1.30）であった（図2）．3.Invitroバイオフィルム形成に及ぼすグルコースの影響MSSAF-5820株において，培地にグルコースを0.01％，0.1％，1％濃度になるよう添加し，バイオフィルム形成能をグルコース無添加の場合と比較した結果，培養48時間後の成熟度は濃度依存的に増大した．バイオフィルム形成能は0.01％添加から影響がみられたが，0.1％，1％添加時にはMF構造に沿って多くのslime様物質が付着し，これらに覆われた球菌の数も多かった（図3）．4.Invitroバイオフィルム形成菌に対する抗菌点眼薬の殺菌効果バイオフィルムを形成した各株に対する抗菌点眼薬30MIC，24時間作用後の生菌数を図4に示す．グルコース0.01％存在下，MSSAF-5820株におけるトスフロキサシン点眼液30MICの24時間作用時の殺菌効果は，同MIC濃度のレボフロキサシン点眼液と同等，セフメノキシム点眼液より有意（p＜0.001）に強かった．グルコース0.1％存在下での24時間作用時の殺菌効果は，同MIC濃度のレボフロキサシンおよびセフメノキシム点眼液より有意（p＜0.001）に強かった．また，グルコース0.01％と0.1％存在下での殺菌効果を比較すると，トスフロキサシンおよびセフメノキシム点眼液では差異がみられなかったが，レボフロキサシン点眼液では，0.1％存在下の殺菌効果は0.01％の場合より有意（p＜0.001）に弱かった．グルコース0.01％存在下，MSSAF-5829株におけるトスフロキサシン点眼液30MICの24時間作用時の殺菌効果は，同MIC濃度のレボフロキサシン点眼液およびセフメノキシム点眼液より有意（p＜0.001）に強かった．また，グルコース0.1％存在下での24時間作用時の殺菌効果は，同MIC濃574あたらしい眼科Vol.31，No.4，2014（96）Glucose0.01％Glucose0.1％Viablecellscount（LogofCFU/ml）108642010864201086420F-5820MSSAF-5829MSSAF-5809MRSANT108642010864201086420F-5820MSSAF-5829MSSAF-5809MRSANT検出限界（≦1.30）ControlトスフロキサシンレボフロキシサンセフメノキシムControlトスフロキサシンレボフロキシサン点眼液点眼液点眼液点眼液点眼液図2Staphylococcusaureusのplanktonic菌に対する各種抗菌点眼薬の殺菌効果NT：試験せず．Planktonic菌に対してはいずれの点眼液も強い殺菌効果を示した．セフメノキシム点眼液度のレボフロキサシンおよびセフメノキシム点眼液より有意（p＜0.001）に強かった．また，グルコース0.01％あるいは0.1％存在下での殺菌効果はセフメノキシム点眼液では差異がなかったが，トスフロキサシンおよびレボフロキサシン点眼液では，0.1％存在下のほうが0.01％の場合より有意（p＜0.01，p＜0.001）に弱かった．グルコース0.01％および0.1％存在下，MRSAF-5809株におけるトスフロキサシン点眼液30MICの24時間作用時の殺菌効果は，同MIC濃度のレボフロキサシン点眼液より有意（p＜0.01）に強かった．また，トスフロキサシンおよびレボフロキサシン点眼液ともに，グルコース0.1％での殺菌効果は0.01％の場合より有意（p＜0.01，p＜0.001）に弱かった．5.MSSAF.5820株が形成したinvitroバイオフィルムに対する抗菌点眼薬の作用像0.1％グルコース存在下，invitroでMSSAF-5820株が形成したバイオフィルムに対する各点眼液30MIC作用時のSEM像を図5に示す．セフメノキシム点眼液作用後のバイオフィルム像（図5G，図5H）は薬剤無添加群（図5A，図5B）とほぼ同様であった．トスフロキサシン点眼液作用時（図5C，図5D）では，バイオフィルム構造の消失や，これを構成する菌塊構造の軽度化が観察された．レボフロキサシ（97）ン点眼液の場合は薬剤無添加群に比べ，低倍でバイオフィルム構造が若干消失した像が観察されたが，バイオフィルム上部の菌塊構造の厚みの変化はトスフロキサシン点眼液作用時より小さかった（図5E，図5F）．なお，今回の試験では，他の2株でもMSSAF-5820株と同様なバイオフィルム形成像，また各抗菌点眼薬作用像がSEMで観察された（データ示さず）．III考按結膜.における検出菌の分離比率はS.epidermidisが最も高いが，糖尿病患者では本菌種に次いでS.aureusの比率が健常人より高いとの報告がある4）．眼感染症ではバイオフィルム形成菌がその発症に関与することが報告されており，S.aureusやS.epidermidisもコンタクトレンズ，眼内レンズ，手術時縫合糸，涙道形成用チューブ等の医療材料に付着してバイオフィルムを形成することが知られている5,6）．近年，眼感染症においては，Staphylococcus属以外にも，Pseudomonasaeruginosa（P.aeruginosa）などによるバイオフィルム形成が臨床的に問題となっているが，さまざまな菌種でバイオフィルム形成菌はその成熟度によって抗菌薬の殺菌作用が影響を受けることが報告されている8,9）．S.aureusではバイオフィルムの成熟度は生育環境に存在するグルコーあたらしい眼科Vol.31，No.4，2014575ABCDEFGHIJKLIJKABCDEFGHIJKLIJK図3StaphylococcusaureusF.5820株のバイオフィルム形成に及ぼすグルコースの影響培養時間：48時間，A,E,I：glucose0％，×100,×3,000,×10,000，B,F,J：glucose0.01％，×100,×3,000,×10,000，C,G,K：glucose0.1％，×100,×3,000,×10,000，D,H,L：glucose1％，×100,×3,000,×10,000．グルコース0.1％，1％添加時には多くのslime様物質が産生され，これに覆われた球菌の数も多かった．スの影響を受け，濃度依存的にその成熟度が増大するとの報告がある11,12）．糖尿病患者の涙液中グルコース（tearglucose）濃度は健常人に比べ高く，正常人では0.004.0.008％であるのに対し，糖尿病患者ではこれより5.10倍以上高く，0.03.0.13％以上含まれると報告されている13.15）．また，糖尿病患者では急性結膜炎を含む各種細菌感染症のリスクが高いこと，網膜症，白内障など，さまざまな眼の組織における病態に高血糖が悪影響を与えるとの報告がある23,24）．これらのことから，糖尿病患者では眼表面や眼内に定着したS.aureusがバイオフィルムを形成する場合，その成熟度が増し，抗菌点眼薬の殺菌作用が何らかの影響を受ける可能性が考えられ，今回の検討を行った．眼感染症由来S.aureusのバイオフィルム形成に及ぼすグルコースの影響をSEMで形態観察した報告や，バイオフィルム形成菌に対する抗菌点眼薬の殺菌効果などを検討した報告はこれまでなかった．今回，眼感染症由来S.aureusのinvitroバイオフィルム形成に及ぼすグルコースの影響を調べた結果，これまでの報告11,12）に記述されているようにその成熟度はグルコース濃度の影響を受けており，糖尿病患者の涙576あたらしい眼科Vol.31，No.4，2014液中グルコース濃度に想定した0.1％添加時では，無添加時に比べ，slime様物質が多く産生され，これらがMF構造や菌体表面に付着したバイオフィルム像が観察された．S.epidermidisではPIAの生合成はica遺伝子locusが関連し，icaA,DはN-acetylgulcosaminetransferase，icaBはPIAdeacetylase，icaCはPIAのexporter遺伝子とされ25），ソフトコンタクトレンズ装用者における急性結膜炎患者から分離されたブドウ球菌ではicaA，D遺伝子保有率が高いとの報告がある26）．しかしながら，S.aureusではicaA，D遺伝子はほとんどすべての株が保有しており，本遺伝子のバイオフィルム形成時における意義は両菌種で異なる可能性が考えられた．Izanoら27）はブドウ球菌属のバイオフィルムにおける主要な2つの構成ポリマーはPIAとextracellularDNA（ecDNA）であり，S.aureusではPIAがバイオフィルムの主要な構成成分ではなく，ecDNAがその主成分としている．また，別の報告でS.aureusの臨床株ではグルコースが調節するバイオフィルム形成はicaADBC遺伝子の発現に関係しないとされ，同じブドウ球菌属ながら，バイオフィルム形成，発現様式について違いが存在する可能（98）Glucose0.01％Glucose0.1％Viablecellscount（LogofCFU/MF）109876510987651098765F-5820MSSA10＊＊＊98765＊＊＊NS†††＊＊＊F-5820MSSA＊＊＊＊＊＊F-5829MSSA†††††＊＊＊1098765F-5829MSSA＊＊＊F-5809MRSAF-5809MRSA10＊＊＊＊98†††††76NTNT5ControlトスフロキサシンレボフロキシサンセフメノキシムControlトスフロキサシンレボフロキシサンセフメノキシム点眼液点眼液点眼液点眼液点眼液点眼液図4Staphylococcusaureusのinvitroバイオフィルム形成菌に対する各種抗菌点眼薬の殺菌効果薬剤作用時間：24時間，n＝3,有意差：＊＊＊：p＜0.001，＊＊：p＜0.01vs.トスフロキサシン点眼液，†††：p＜0.001，††：p＜0.01vs.0.1％glucose,NS：notsignificant,（Dunnetttest），NT：試験せず，MF：membranefilter0.1％グルコース存在下では，いずれの場合もトスフロキサシン点眼液は同じ30MIC濃度で比較したレボフロキサシンあるいはセフメノキシム点眼液より有意に強い殺菌効果を示した．性があり，現在，詳細は明らかでない28）．眼感染症由来S.aureusはレボフロキサシン，セフメノキシムに対する感受性が高い1）．今回の使用菌株に対する抗菌活性はトスフロキサシンがレボフロキサシン，セフメノキシムと同等か，2.512倍以上強く，2009年分離の外眼部感染症由来S.aureusの成績とほぼ同様であった29）．現在S.aureusのバイオフィルム形成菌に対するこれら抗菌点眼薬の殺菌効果に関する成績は見当たらない．そこでinvitroバイオフィルムを作製し，汎用されている市販抗菌点眼薬，トスフロキサシン，レボフロキサシンおよびセフメノキシム各点眼液の殺菌効果を検討した．トスフロキサシンについては健康成人男子を対象に1回1滴，1日8回14日間点眼し，結膜.内濃度を測定した成績があり，点眼14日目の初回点眼24時間後の濃度は2.0±2.69μg/mlであったとの報告がある22）．この24時間値（約2.0μg/ml）は今回invitroでバイオフィルムを作製したS.aureus3株に対するトスフロキサシンのMIC値（0.0313μg/mlおよび0.0625μg/ml）の約32あるいは64倍に相当する．このことから，作用濃度および作用時間はいずれの点眼液も30MIC，24時間とした．その結果，0.01％グルコース存在下では，invitroでバイ（99）オフィルムを形成したS.aureusに対し，トスフロキサシン点眼液はMSSAF-5820株では，レボフロキサシン点眼液と同等，MSSAF-5829株，MRSAF-5809株ではレボフロキサシンあるいはセフメノキシム点眼液より有意に強い殺菌効果を示した．0.1％グルコース存在下では，いずれの場合もトスフロキサシン点眼液は同MIC濃度で比較したレボフロキサシンあるいはセフメノキシム点眼液より有意に強い殺菌効果を示し，SEMによる形態観察でも，MSSAF-5820株のバイオフィルム形成菌に対し，トスフロキサシン点眼液作用時，強い殺菌像が観察された．また，フルオロキノロン系抗菌点眼薬の殺菌効果はMSSAF-5820株バイオフィルムに対するトスフロキサシン点眼液の場合を除き，いずれも糖尿病患者の涙液中グルコース濃度を想定した0.1％グルコース存在下のほうが0.01％グルコース存在下より弱く，バイオフィルムの成熟度がフルオロキノロン系抗菌点眼薬の殺菌効果に影響を及ぼす可能性が考えられた．バイオフィルムを形成した細菌がplanktonic菌に比べ抗菌薬抵抗性を示すこと，また，その抵抗性には薬剤系統差があることが知られている8）．S.aureusにおいてフルオロキノロン系抗菌薬レボフロキサシンはplanktonic菌よりバイあたらしい眼科Vol.31，No.4，2014577ABCDEFGHABCDEFGHABCDEFGHABCDEFGH図5StaphylococcusaureusF.5820株が形成したinvitroバイオフィルム形成菌に対する各種抗菌点眼薬作用時の走査型電子顕微鏡像A,B：control,×100,×3,000，C,D：トスフロキサシン点眼液，×100,×3,000，E,F：レボフロキサシン点眼液，×100,×3,000，G,H：セフメノキシム点眼液，×100,×3,000．低倍率でもトスフロキサシン点眼液の作用により，バイオフィルム構造の大部分が消失している像が観察された．オフィルム形成菌に対する殺菌効果が弱いとの報告があム形成菌に対する殺菌作用では，フルオロキノロン系抗菌る30）．今回の試験でもplanktonic菌に比べ，バイオフィル薬，アミノ配糖体系抗菌薬，b-ラクタム系抗菌薬の順に強ムを形成した菌に対する殺菌作用はいずれの薬剤も弱かっいことも報告されている8）．さらに，S.aureusのバイオフィた．薬剤系統差については，P.aeruginosaのバイオフィルルムにおける薬剤透過性はb-ラクタム系抗菌薬のオキサシ578あたらしい眼科Vol.31，No.4，2014（100）リン，セフォタキシム，またグリコペプチド薬であるバンコマイシンより，アミノ配糖体のアミカシンやフルオロキノロン系抗菌薬のシプロフロキサシンのほうが良好との報告がある31）．これらのことから，S.aureusのバイオフィルム形成菌に対しては，b-ラクタム系抗菌薬よりもフルオロキノロン系抗菌薬を，また，そのなかでも目標とする菌種に対して，より強い抗菌活性を示すフルオロキノロン系抗菌薬を選択すべきと考えられた．今回の成績は，先に報告10）したS.epidermidisのバイオフィルム形成菌における結果と近似しており，殺菌効果はb-ラクタム系点眼薬よりフルオロキノロン系点眼薬が強いが，その効果はフルオロキノロン系点眼薬間でも差異が認められる点では同様の成績が得られた．術後感染症としての眼内炎の起因菌は60％以上をStaphylococcus属が占める．S.epidermidisの比率が最も高いものの，MRSAを含むS.aureusが起因菌の場合も多い3）．眼内炎は重篤な感染症であり，手術前後に眼瞼および結膜.内を十分殺菌することが重要である．フルオロキノロン系点眼薬の周術期における無菌化率は高く，トスフロキサシン点眼液の場合も手術14日後に判定した術後感染症の発症は全例（108例）において認めず，また，術後無菌化率は95.1％で，類薬と同程度であった32,33）．これらの成績におけるバイオフィルム形成菌関与の程度は不明であるが，そのような場合にも殺菌効果が十分期待できる抗菌点眼薬の使用が望ましいことから，その選択には十分な配慮が必要と考えられた．以上，トスフロキサシン点眼液はレボフロキサシン点眼液およびb-ラクタム系のセフメノキシム点眼液より，バイオフィルムを形成したS.aureusに強い殺菌効果を示した．トスフロキサシン点眼液はバイオフィルムを形成したキノロン感受性S.aureusによる眼感染症の治療，予防において有用と考えられた．利益相反：高畑正裕（カテゴリーE：富山化学工業株式会社社員），髙倉真理子（カテゴリーE：富山化学工業株式会社社員）文献1）小早川信一郎，井上幸次，大橋裕一ほか：細菌性結膜炎における検出菌・薬剤感受性に関する5年間の動向調査（多施設共同研究）．あたらしい眼科28：679-687,20112）DurandML：Endophthalmitis.ClinMicrobiolInfect19：227-234,20133）薄井紀夫，宇野敏彦，大木孝太郎ほか：白内障に関連する術後眼内炎全国症例調査．眼科手術19：73-79,20064）BilenH,AtesO,AstamNetal：Conjunctivalflorainpatientswithtype1ortype2diabetesmellitus.AdvTher24：1028-1035,20075）亀井裕子：眼感染症とバイオフィルム．臨床と微生物36：439-444,20096）BehlauI,GilmoreMS：Microbialbiofilmsinophthalmologyandinfectiousdisease.ArchOphthalmol126：15721581,20087）KodjikianL,BurillonC,LinaGetal：Biofilmformationonintraocularlensesbyaclinicalstrainencodingtheicalocus：ascanningelectronmicroscopystudy.InvestOphthalmolVisSci44：4382-4387,20038）SpoeringAL,LewisK：BiofilmsandplanktoniccellsofPseudomonasaeruginosahavesimilarresistancetokillingbyantimicrobials.JBacteriol183：6746-6751,20019）AmorenaB,GraciaE,MonzonMetal：AntibioticsusceptibilityassayforStaphylococcusaureusinbiofilmsdevelopedinvitro.JAntimicrobChemother44：43-55,199910）井上幸次，池田欣史，藤原弘光ほか：眼感染症由来Staphylococcusepidermidisが形成したInVitroバイオフィルムに対するトスフロキサシン点眼液の殺菌効果．あたらしい眼科29：1681-1688,201211）LimY,JanaM,LuongTTetal：Controlofglucose-andNaCl-inducedbiofilmformationbyrbfinStaphylococcusaureus.JBacteriol186：722-729,200412）CroesS,DeurenbergRH,BoumansMLetal：StaphylococcusaureusbiofilmformationatthephysiologicglucoseconcentrationdependsontheS.aureuslineage.BMCMicrobiol9：229,200913）SenDK,SarinGS：Tearglucoselevelsinnormalpeopleandindiabeticpatients.BrJOphthalmol64：693-695,198014）DaumKM,HillRM：Humantearglucose.InvestOphthalmolVisSci22：509-514,198215）ChatterjeePR,DeS,DattaHetal：Estimationoftearglucoselevelanditsroleasapromptindicatorofbloodsugarlevel.JIndianMedAssoc101：481-483,200316）SreedharanS,OramM,JensenBetal：DNAgyrasegyrAmutationsinciprofloxacin-resistantstrainsofStaphylococcusaureus：closesimilaritywithquinoloneresistancemutationsinEscherichiacoli.JBacteriol72：72607262,199017）FerreroL,CameronB,ManseBetal：CloningandprimarystructureofStaphylococcusaureusDNAtopoisomeraseIV：aprimarytargetoffluoroquinolones.MolMicrobiol13：641-653,199418）ArciolaCR,BaldassarriL,MontanaroL：PresenceoficaAandicaDgenesandslimeproductioninacollectionofstaphylococcalstrainsfromcatheter-associatedinfections.JClinMicrobiol39：2151-2156,200119）ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute：MethodsforDilutionAntimicrobialSusceptibilityTestsforBacteriaThatGrowAerobically；ApprovedStandard-EighthEditionM07-A8,ClincalandLaboratoryStandardsInstitutes,Wayne,PA,200920）ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute：PerformanceStandardsforAntimicrobialSusceptibilityTesting；NineteenthInformationalSupplementM100-S22,201221）WebsterP,WuS,GomezGetal：Distributionofbacterialproteinsinbiofilmsformedbynon-typeableHaemophilusinfluenzae.JHistochemCytochem54：829-842,2006（101）あたらしい眼科Vol.31，No.4，201457922）北野周作，宮永嘉隆，東純一：新規ニューキノロン系抗菌点眼薬トシル酸トスフロキサシン点眼液の臨床薬理試験（単回・反復および頻回反復点眼試験）．あたらしい眼科23（別巻）：47-54,200623）KruseA,ThomsenRW,HundborgHHetal：Diabetesandriskofacuteinfectiousconjunctivitis─apopulation-basedcase-controlstudy.DiabetMed23：393-397,200624）SkarbezK,PriestleyY,HoepfMetal：Comprehensivereviewoftheeffectsofdiabetesonocularhealth.ExpertRevOphthalmol5：557-577,201025）OttoM：Staphylococcalbiofilms.CurrTopMicrobiolImmunol322：207-228,200826）CatalanottiP,LanzaM,DelPreteAetal：Slime-producingStaphylococcusepidermidisandS.aureusinacutebacterialconjunctivitisinsoftcontactlenswearers.NewMicrobiol28：345-354,200527）IzanoEA,AmaranteMA,KherWBetal：Differentialrolesofpoly-N-acetylglucosaminesurfacepolysaccharideandextracellularDNAinStaphylococcusaureusandStaphylococcusepidermidisbiofilms.ApplEnvironMicrobiol74：470-476,200828）FitzpatrickF,HumphreysH,O’GaraJP：EvidenceforicaADBC-independentbiofilmdevelopmentmechanisminmethicillin-resistantStaphylococcusaureusclinicalisolates.JClinMicrobiol43：1973-1976,200529）末信敏秀，石黒美香，松崎薫ほか：細菌性外眼部感染症分離菌株のGatifloxacinに対する感受性調査．あたらしい眼科28：1321-1329,201130）MurilloO,DomenechA,GarciaAetal：Efficacyofhighdosesoflevofloxacininexperimentalforeign-bodyinfectionbymethicillin-susceptibleStaphylococcusaureus.AntimicrobAgentsChemother50：4011-4017,200631）SinghR,RayP,DasAetal：PenetrationofantibioticsthroughStaphylococcusaureusandStaphylococcusepidermidisbiofilms.JAntimicrobChemother65：1955-1958,201032）秦野寛，大野重昭，北野周作：トスフロキサシン点眼液による眼科周術期の無菌化療法．眼科手術23：314-320,201033）大橋裕一，秦野寛，張野正誉ほか：ガチフロキサシン点眼液の眼科周術期の無菌化療法．あたらしい眼科22：267-271,2005＊＊＊580あたらしい眼科Vol.31，No.4，2014（102）

眼感染症由来Staphylococcus epidermidis が形成したIn Vitro バイオフィルムに対するトスフロキサシン点眼液の殺菌効果

admin — Sun, 30 Dec 2012 15:24:54 +0000

《原著》あたらしい眼科29（12）：1681.1688，2012c眼感染症由来Staphylococcusepidermidisが形成したInVitroバイオフィルムに対するトスフロキサシン点眼液の殺菌効果井上幸次＊1池田欣史＊1藤原弘光＊2高畑正裕＊3高倉真理子＊3＊1鳥取大学医学部視覚病態学＊2鳥取大学医学部附属病院検査部＊3富山化学工業株式会社綜合研究所BactericidalActivityofTosufloxacinOphthalmicSolutionagainstInVitroBiofilmFormedbyStaphylococcusepidermidisIsolatedfromOcularInfectionYoshitsuguInoue1）,YoshifumiIkeda1）,HiromitsuFujiwara2）,MasahiroTakahata3）andMarikoTakakura3）1）DivisionofOphthalmologyandVisualScience,FacultyofMedicine,TottoriUniversity,2）DivisionofClinicalLaboratory,ClinicalFacilities,TottoriUniversityHospital,3）ResearchLaboratories,ToyamaChemicalCo.,Ltd.目的：Staphylococcusepidermidisが形成したinvitroバイオフィルムに対する抗菌点眼薬の殺菌効果を検討する．対象および方法：鳥取大学医学部附属病院の眼感染症患者から分離されたS.epidermidisを用い，invitroバイオフィルムを作製し，市販点眼液の殺菌効果を検討した．トスフロキサシン，レボフロキサシン，セフメノキシムの各点眼液を最小発育阻止濃度（minimuminhibitoryconcentration：MIC）の10倍および30倍濃度（10MIC,30MIC）で24時間作用後の殺菌効果を，生菌数の変化，ならびに走査型電子顕微鏡（scanningelectronmicroscope：SEM）による観察で評価した．結果：バイオフィルムを形成したメチシリンおよびキノロン感受性S.epidermidis3株に対するキノロン系薬のトスフロキサシン点眼液10MICおよび30MIC作用時の殺菌効果はb-ラクタム系のセフメノキシム点眼液より有意に強かった．試験3株中2株におけるトスフロキサシン点眼液10MIC作用時の殺菌効果は同濃度のレボフロキサシン点眼液より有意に強かった．SEMによる形態観察においてもトスフロキサシン点眼液のバイオフィルム形成菌に対する強い殺菌効果が観察された．結論：トスフロキサシン点眼液はバイオフィルムを形成したメチシリンおよびキノロン感受性S.epidermidisによる眼感染症に対し，有用と考えられた．Purpose：TostudythebactericidaleffectofantibacterialophthalmicsolutiononinvitrobiofilmformedbyStaphylococcusepidermidis.MaterialsandMethods：Invitrobiofilmwasformedby3strainsofmethicillin-andquinolone-susceptibleS.epidermidis（quinolone-susceptibleMSSE）isolatedfrompatientswithocularinfectionatTottoriUniversityHospital.Bactericidalactivitiesoftosufloxacin（TFLX）,levofloxacin（LVFX）andcefmenoxime（CMX）ophthalmicsolutionswereexaminedbycountingviablecellsafterexposureofS.epidermidisbiofilmtothoseagentsat10-and30-foldtherespectiveminimuminhibitoryconcentrations（MIC）,andbyobservationunderascanningelectronmicroscope（SEM）.Results：Afterexposureofthe3biofilm-formingstrainstotheophthalmicsolutionsat10-foldand30-foldMIC,thebactericidaleffectsoftheTFLXophthalmicsolutionsweresignificantlymorepotentthanthoseofCMXophthalmicsolution.In2ofthe3testedstrains,thebactericidaleffectoftheTFLXophthalmicsolutionat10-foldMICwasalsosignificantlystrongerthanthatofLVFXophthalmicsolution.ThepotentbactericidaleffectofTFLXophthalmicsolutionwasalsoobservedviaSEM.Conclusion：TFLXophthalmicsolutionisconsideredavaluabletherapeuticagentinthetreatmentofophthalmicinfectioncausedbybiofilm-formingquinolone-susceptibleMSSE.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）29（12）：1681.1688,2012〕Keywords：トスフロキサシン，点眼液，表皮ブドウ球菌，バイオフィルム，殺菌効果．tosufloxacin,ophthalmicsolution,Staphylococcusepidermidis,biofilm,bactericidaleffect.〔別刷請求先〕井上幸次：〒683-8504米子市西町36-1鳥取大学医学部視覚病態学Reprintrequests：YoshitsuguInoue,M.D.,Ph.D.,DivisionofOphthalmologyandVisualScience,FacultyofMedicine,TottoriUniversity,36-1Nishi-cho,Yonago,Tottori683-8504,JAPAN0910-1810/12/\100/頁/JCOPY（91）1681はじめに結膜炎や角膜炎は眼感染症の代表的な疾患であり，その検出菌はグラム陽性菌のStaphylococcusepidermidis，Staphylococcusaureusが高い比率を占めている1）．また，発症頻度は低いものの，重篤な感染症である急性術後眼内炎の起因菌はグラム陽性菌の占める割合が90％と高く，なかでもS.epidermidisをはじめとするコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の分離率が高い2,3）．眼感染症では，各種コンタクトレンズ，治療に用いられる眼内レンズなどのバイオマテリアルに形成されたバイオフィルム形成菌がその発症に関与している場合があり，治療の遷延化を招いているとの報告がある4.6）．また，眼科周術期における創部からの常在菌の侵入，その後の縫合糸への菌の定着や，結膜瘻孔におけるバイオフィルム形成などが知られている4）．バイオフィルム形成菌は生育がnon-あるいはslowgrowing状態にあると同時に，菌体を覆うexopolysaccharidematrixの薬剤低透過性，さらにmultidrug-resistancepumpsの存在などにより，抗菌薬の殺菌作用を回避していると考えられている7,8）．眼感染症の原因菌として高い比率を占めるS.epidermidisやS.aureusでは菌により産生された粘液性物質（slime）がバイオフィルム形成に関与するとされ，その産生はicaA,D,Cなどの遺伝子に関連していて，ソフトコンタクトレンズ装用者における急性結膜炎患者ではslime産生株の分離頻度が高い（74.1％）との報告がある9,10）．また，術後眼内炎の主要な起因菌，S.epidermidis,S.aureus,Enterococcusfaecalis,Propionibacteriumacnesのうち，バイオフィルム形成が特に問題となるのはStaphylococcus属の2菌種であり，S.epidermidisについては1980.1990年代にinvitroの試験で眼内レンズに菌を定着させ眼内炎との関連を報告したものがある4,11）．当時の論文にはバイオフィルムとの記述はないが，定着菌は抗菌薬に対する感受性が低下していることもすでに明らかにされており，眼内炎とバイオフィルム形成との関連はこの頃より明らかにされてきたものと考えられる．以上のように眼感染症とバイオフィルム形成菌との関わりは深いが，抗菌点眼薬のこれに対する殺菌効果についての報告はほとんど見当たらない．今回，2010.2011年に鳥取大学医学部附属病院の眼感染症患者から分離されたS.epidermidisのうち，icaA,D,C遺伝子，薬剤感受性などを検討した3株を用いてinvitroバイオフィルムを作製し，トスフロキサシン，レボフロキサシンおよびセフメノキシム各点眼液の殺菌効果を検討した．I実験材料および方法1.使用菌株鳥取大学医学部附属病院において眼感染症患者から20101682あたらしい眼科Vol.29，No.12，2012.2011年に分離されたS.epidermidis28株を用いた．さらに，これらの株からキノロン薬耐性決定領域（quinoloneresistantdeterminingregion：QRDR）遺伝子およびica遺伝子の解析，また，各種薬剤に対する感受性を調べ，planktonic菌およびバイオフィルム形成菌に対する殺菌効果の検討に用いる菌株を選定した．今回，icaA,D遺伝子保有株，非保有株について，検討薬剤に対して感性を示す株での殺菌効果を調べるため，メチシリンおよびキノロン感受性S.epidermidis（methicillin-andquinolone-susceptibleS.epidermidis：quinolone-susceptibleMSSE）F-5519（icaA,D非保有株），F-5522およびF-5545（ともにicaA,D保有株）の3株を選択した．2.QRDR遺伝子およびicaA,icaD,icaC遺伝子の解析DNAジャイレース遺伝子gyrA,gyrBおよびトポイソメラーゼIV遺伝子parC,parEのQRDR部位における遺伝子変異の解析はYamadaら12），Haasら13）の報告に基づいたpolymerasechainreaction（PCR）法で行った．また，icaA,icaD遺伝子の有無，slime産生を抑制することが報告されているicaC遺伝子へのsequenceelementIS256挿入の有無をArciolaら14），Ziebuhrら15）の方法に基づき検討した．3.使用薬剤薬剤感受性の測定にはトスフロキサシン（富山化学工業株式会社），レボフロキサシン（LKTLaboratories,Inc），セフメノキシム（ベストコールR静注用，武田薬品工業株式会社）を用いた．また，S.epidermidisのメチシリン耐性の判別のため，オキサシリン（シグマアルドリッチジャパン株式会社）を使用した．Planktonic菌およびinvitroバイオフィルム形成菌に対する殺菌効果の検討には市販のトスフロキサシン点眼液（オゼックスR点眼液0.3％，大塚製薬株式会社），レボフロキサシン点眼液（クラビットR点眼液0.5％，参天製薬株式会社），セフメノキシム点眼液（ベストロンR点眼用0.5％，千寿製薬株式会社）を目的の作用濃度になるよう25％cation-adjustedMueller-Hintonbroth（CAMHB；日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）で適宜希釈し用いた．いずれの薬剤も純度あるいは含量が明らかなものを使用し，濃度は活性本体の値として示した．4.薬剤感受性の測定抗菌薬に対する感受性の測定にはCAMHBを用い，ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute（CLSI）の微量液体希釈法に基づき行った16）．メチシリンに対する感受性/耐性はCLSIの判定基準に基づき，オキサシリンに対する最小発育阻止濃度（minimuminhibitoryconcentration：MIC）（≦0.25μg/ml：感受性，≧0.5μg/ml：耐性）によって分類した17）．また，キノロン薬に対する感受性/耐性は同判定基準に基づき，レボフロキサシンに対するMIC（≦1μg/ml：感（92）受性，≧4μg/ml：耐性）によって分類した17）．5.Planktonic菌に対する抗菌点眼薬の殺菌効果CAMHBを用いて，37℃で一夜振盪培養した菌を用いた．これを25％CAMHBで80倍希釈した菌液4mlに25％CAMHBでMICの50および150倍濃度に調製した各薬液1mlを加え（終濃度，10および30MIC），37℃で振盪培養した．培養開始24時間後に生菌数測定を行った（n＝1）．対照として薬剤不含CAMHB5mlを用い，同様の操作にて薬剤非添加時の生菌数を測定した．6.Invitroバイオフィルムの作製とバイオフィルム形成菌に対する抗菌点眼薬の殺菌効果Websterら18）の方法に基づき，CAMHBで一夜培養したS.epidermidisの菌液を通常の10％培地成分濃度のMueller-Hintonagar（MHA,日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）平板上に置いたmembranefilter（MF,DURAPORERMEMBRANEFILTER0.45μmHV；MILLIPORE）上に25μl滴下した（n＝3）．37℃，48時間培養後，各薬剤10および30MICを含む25％濃度のCAMHB1ml中に浸漬し，さらに37℃，24時間後，MF上とCAMHB1ml中の生菌数の総計を計測した．なお，作用濃度（10および30MIC）はトスフロキサシン頻回反復点眼時の結膜.内濃度などを参考にした19）．また，生菌数の測定にあたっては上述のMFと浸漬液〔薬剤含有あるいは不含（対照）CAMHB〕をMulti-BeadsShockerR（安井器械株式会社，大阪）で破砕，ホモジナイズした試料を適宜希釈し，MHA平板に塗布し，II結果1.使用菌株の各種抗菌薬に対する感受性，gyrA,gyrBおよびparC,parE遺伝子におけるQRDR部位およびicaA,icaD,icaC遺伝子の解析S.epidermidis28株に対するトスフロキサシンとレボフロキサシン，またはセフメノキシムとのMIC相関図を図1に示す．いずれの薬剤にも感受性を示した株は7株であり，28株中，メチシリン耐性S.epidermidis（methicillin-resistantS.epidermidis：MRSE）は19株（67.9％），キノロン耐性S.epidermidisは21株（75.0％）であった．Planktonic菌およびバイオフィルム形成菌に対する殺菌効果の検討に使用した菌株の各遺伝子の解析および薬剤感受性の結果を表1に示す．QRDR部位解析の結果，F-5545株のParEにIle575Thrの変異が認められたが，他の株ではいずれの部位にも変異は認められなかった（表1）．icaA,icaD遺伝子については，F-5522,F-5545株は両遺伝子を保有していたが，F-5519株ではいずれも認められなかった．さらにicaA,icaD遺伝子を保有していたF-5522,F-5545にicaC遺伝子におけるsequenceelementIS256の挿入は認められなかった（表1）．なお，今回の眼感染症由来のS.epidermidis28株中icaA,icaD遺伝子をともに保有していた株は8株（28.6％）であった．3336655110.25110.125113111トスフロキサシンMIC（μg/ml）≧16生育コロニー数を計測した．7.Invitroバイオフィルム形成菌に対する抗菌点眼薬の作用像薬剤作用後1.5％glutaraldehyde（和光純薬工業株式会社）にて1時間固定した後，さらに1％osmiumtetroxide（TAABLaboratories）に18時間浸漬し固定した．さらにアルコール814210.55230.0611≦0.03≦0.030.1250.528≦0.030.1250.528脱水-酢酸イソアミル（和光純薬工業株式会社）置換を経た後，臨界点乾燥を行った試料を白金-パナジウム蒸着した．0.060.2514≧160.060.2514≧16レボフロキサシンMICセフメノキシムMIC（μg/ml）（μg/ml）本試料を走査型電子顕微鏡（SEM：HITACHIS-4500）で形態観察した．図1Staphylococcusepidermidis28株に対するトスフロキサシンとレボフロキサシン，またはセフメノキシムとのMIC相関図相関図中の数値は株数．表1使用菌株のDNAジャイレース，トポイソメラーゼIV遺伝子のQRDR変異，ica遺伝子の解析，および各種抗菌薬に対する感受性QRDRにおける変異IntercellularadhesiongeneMIC（μg/ml）菌株トスフロレボフロセフメノオキサGyrAGyrBParCParEicaAicaDicaCキサシンキサシンキシムシリンF-5519──────NT0.06250.250.50.125F-5522────＋＋Normal0.06250.250.50.125F-5545───Ile575Thr＋＋Normal0.06250.250.50.125─/＋：非検出/検出，NT：試験せず，Normal：IS256挿入なし．（93）あたらしい眼科Vol.29，No.12，20121683109A887766510NSNS＊＊＊＊＊＊薬剤10MIC30MIC10MIC30MIC10MIC30MIC＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊NS＊＊＊＊＊＊ABC5Viablecellscount（LogofCFU/MF）Viablecellscount（LogofCFU/ml）410B98765410987654薬剤C無添加トスフロキサシンレボフロキサシンセフメノキシム点眼液点眼液点眼液図2Staphylococcusepidermidisのplanktonic菌に対する各種点眼薬の殺菌効果A：F-5519株，B：F-5522株，C：F-5545株．MIC（μg/ml）は3株とも同じ．トスフロキサシン0.0625，レボフロキサシン0.25，セフメノキシム0.5，薬剤作用時間：24時間，n＝1．F-5545株がparEに変異を保有していたものの，使用菌株はキノロン薬に感受性であり，MICはいずれもトスフロキサシンが0.0625μg/ml,レボフロキサシンは0.25μg/mlであった．また，オキサシリンに対するMICは，いずれの株も0.25μg/ml以下で，すべての株がMSSEであり，セフメノキシムのMICはいずれも0.5μg/mlであった（表1）17）．2.Planktonic菌に対する抗菌点眼薬の殺菌効果Planktonic菌に対する薬剤10および30MIC，24時間作用後の生菌数を図2に示す．いずれの薬剤も10および30MIC作用後の生菌数は薬剤無添加の場合に比べ，約10.3から10.5に減少し，強い殺菌効果が認められた．セフメノキシム点眼液作用時では生菌数減少と用量との相関性が認められなかった（図2）．3.Invitroバイオフィルム形成菌に対する抗菌点眼薬の殺菌効果バイオフィルムを形成した各株に対する薬剤10および30MIC，24時間作用後の生菌数を図3に示す．S.epidermidisF-5519株におけるトスフロキサシン点眼液10MICの241684あたらしい眼科Vol.29，No.12，201210MIC30MIC10MIC30MIC10MIC30MIC987654無添加トスフロキサシンレボフロキサシンセフメノキシム点眼液点眼液点眼液図3Staphylococcusepidermidisのinvitroバイオフィルム形成菌に対する各種点眼薬の殺菌効果A：F-5519株，B：F-5522株，C：F-5545株．薬剤作用時間：24時間，n＝3，同じ作用濃度間の有意差：＊＊＊：p＜0.001,＊＊：p＜0.01，＊p＜0.05vs.トスフロキサシン（Dunnetttest）．NS：notsignificant，MF：membranefilter．時間作用時の殺菌効果は，10MIC濃度のレボフロキサシン（p＜0.05）およびセフメノキシム点眼液（p＜0.001）より有意に強かった．トスフロキサシン点眼液30MICの24時間作用時の殺菌効果は，30MIC濃度のセフメノキシム点眼液（p＜0.001）より有意に強く，レボフロキサシン点眼液と同程度であった（図3A）．F-5522株におけるトスフロキサシン点眼液10および30MICの殺菌効果は，同濃度のレボフロキサシン（p＜0.01,図4StaphylococcusepidermidisF.5522株が形成したinvitroバイオフィルムに対する各点眼薬作用時の走査型電子顕微鏡像A：薬剤無添加，B：トスフロキサシン点眼液10MIC，C：レボフロキサシン点眼液10MIC，D：セフメノキシム点眼液10MIC，E：トスフロキサシン点眼液10MIC，F：トスフロキサシン点眼液30MIC，G：レボフロキサシン点眼液30MIC，H：セフメノキシム点眼液30MIC．矢印：破砕した菌体．MF：membranefilter．倍率＝A.D，F.H：3,000倍，E：10,000倍．（94）ABCDEMFMFMFMFMFMFMFMFFABCDEMFMFMFMFMFMFMFMFFGH〔図4〕図説明は前頁参照（95）あたらしい眼科Vol.29，No.12，20121685p＜0.05）およびセフメノキシム点眼液（p＜0.001,p＜0.001）より有意に強かった（図3B）．F-5545株におけるトスフロキサシン点眼液10および30MICの殺菌効果は，それぞれ同じ濃度のセフメノキシム点眼液（p＜0.001,p＜0.001）より有意に強く，レボフロキサシン点眼液と同程度であった（図3C）．4.F.5522株が形成したinvitroバイオフィルムに対する抗菌点眼薬の作用像F-5522株が形成したinvitroバイオフィルムに対する各点眼液10および30MIC作用時のSEM像を図4に示す．セフメノキシム点眼液24時間作用後のバイオフィルム像は10MICおよび30MIC作用時ともに薬剤無処理群（図4A）とほぼ同様であった（図4D,H）．トスフロキサシン点眼液およびレボフロキサシン点眼液作用時では10MIC（図4B，C）および30MIC作用時（図4F，G）ともに，バイオフィルム構造が消失し，破砕した菌体（各矢印）が観察されたが，その程度はトスフロキサシン点眼液のほうがレボフロキサシン点眼液より強かった．トスフロキサシン点眼液10MIC作用時の形態を高倍率で観察すると，球菌の形状を留めない，多くの破砕した菌体が見られた（図4E矢印）．なお，今回の試験ではicaA,D遺伝子の有無にかかわらず，他の2株でもF-5522株と同様なバイオフィルム形成像がSEMで観察された（データ示さず）．また，SEM試料作製時の操作がバイオフィルム像へ影響するとの報告もあるが，今回，薬剤無処理群の形態はPalmerらの報告に示されたものに近似していた20,21）．III考按臨床の多くの領域で，さまざまな感染症起因菌がバイオフィルムを形成し，病態の慢性化，治療の遷延化を招いている．バイオフィルムは細菌が付着材料とともに形成したマトリックスであり，付着材料には心臓弁，中耳や副鼻腔といった生体由来の組織，器官の場合と，生体内に留置された医療的なもの，カテーテル，ペースメーカー，人工関節などの場合がある22）．眼科領域では後者に相当するものとして，コンタクトレンズ，眼内レンズ，手術時縫合糸，涙点プラグ，涙道形成用チューブなど，多くの医療材料が付着材料として存在する．眼感染症起因菌では近年，Staphylococcus属やPseudomonasaeruginosaなどによるバイオフィルム形成が臨床的に問題となっており，このうち，Staphylococcus属では涙点プラグが関連した急性結膜炎や眼内レンズに付着した菌による術後眼内炎での報告が多い4,23,24）．S.epidermidisを含む眼由来分離菌における薬剤感受性を検討した報告ではレボフロキサシン，セフメノキシムに対する感受性が高いとの結果が示されている1）．しかし，これらの結果はplanktonic菌に対するものであり，バイオフィル1686あたらしい眼科Vol.29，No.12，2012ム形成菌に対して同じような抗菌作用が認められるかどうかは明らかでない．そこで今回，S.epidermidisのinvitroバイオフィルムを作製し，汎用されている市販抗菌点眼薬，トスフロキサシン，レボフロキサシンおよびセフメノキシム各点眼液の殺菌効果を検討した．検討にあたっては，用いたいずれの薬剤にも感受性の株を使用した．また，S.epidermidisのslime産生に関連9,10）があるとされるicaA,icaD遺伝子の有無をPCR法で確認し，非保有株1株，保有株2株で検討した．なお，icaA,icaD遺伝子を保有していた2株では，slime産生を抑制することが報告15）されているicaC遺伝子へのsequenceelementIS256の挿入は認められなかった．Staphylococciのpolysaccharideintercellularadhesin（PIA）はバイオフィルム形成との関連が報告されているslimeの主要構成成分と考えられており，その生合成にはica遺伝子locusが関連し，icaA,DはN-acetylgulcosaminetransferase,icaBはPIAdeacetylase,icaCはPIAのexporter遺伝子とされている25）．しかし近年，icaA,Dを保有していなくてもバイオフィルム形成が認められるS.epidermidisの存在が報告されており，今回用いたF-5519株もバイオフィルムを形成したことなどから，今後その詳細な解明が待たれる26）．使用菌株に対する抗菌活性はトスフロキサシンがレボフロキサシン，セフメノキシムに比べ4.8倍強く，2009年分離の外眼部感染症由来coagulase-negativeStaphylococcusの成績とほぼ同様であった27）．Invitroバイオフィルム形成菌に対する作用濃度は，作用が薬剤間で同等になるよう，それぞれの10および30MICとし，24時間作用させた．抗菌点眼薬のヒト眼内動態についての報告はきわめて少ないが，トスフロキサシンについては，健康成人男子を対象に1回1滴，1日8回14日間点眼し，結膜.内濃度を測定した成績がある19）．点眼1日目の初回点眼15分後の濃度は40.4±37.5μg/mlであり，点眼14日目の初回点眼24時間後の濃度は2.0±2.69μg/mlであった．涙液が絶え間なく流れる，限られた容量の結膜.内に局所投与された点眼液は，経口投与や，静脈内投与された抗菌薬の場合より，その眼内動態や薬効の推測はきわめて困難と考えられる．バイオフィルム形成による眼感染症であった場合，さらに薬効の推測はむずかしく，実験動物を用いたバイオフィルム感染モデルがその検討に適しているのかもしれない．しかし，現在その報告はなく，今回，invitroでバイオフィルムを作製し検討した．上述のトスフロキサシン点眼液の24時間値（約2.0μg/ml）はS.epidermidisMIC値（0.0625μg/mlとしたとき）の約32倍に相当することから，各点眼液についても，30MICおよびその1/3濃度の10MIC，24時間作用時のinvitroバイオフィルムに対する殺菌作用を検討した．（96）バイオフィルムを形成したS.epidermidisに対し，F5519,F-5522株では10MIC作用時，トスフロキサシン点眼液は同濃度で比較したレボフロキサシンおよびセフメノキシム点眼液より有意に強い殺菌効果を示した．また，F-5522株でのSEMによる形態観察ではトスフロキサシン点眼液ではバイオフィルム形成菌に対する強い殺菌像が観察された．バイオフィルムを形成した細菌がplanktonic菌に比べ抗菌薬抵抗性を示すこと，また，その抵抗性には薬剤系統差があることが知られている7）．S.epidermidisにおいてキノロン系抗菌薬シプロフロキサシンはplanktonic菌よりバイオフィルム形成菌に対する殺菌効果が弱いとの報告がある28）．今回の試験でもplanktonic菌に比べ，バイオフィルムを形成した菌に対する殺菌作用はいずれの薬剤も弱かった（図2，3）．薬剤系統差についてはP.aeruginosaバイオフィルムに対する殺菌作用が，キノロン系抗菌薬，アミノ配糖体系抗菌薬，b-ラクタム系抗菌薬の順に強いことが報告されている7）．これらのことから，バイオフィルム形成菌に対しては，b-ラクタム系抗菌薬よりもキノロン系抗菌薬を，また，キノロン系抗菌薬のなかでも目標とする菌に対して，より強い抗菌活性を示す薬剤を選択すべきと考えられた．術後感染症としての眼内炎は発症すれば失明や視力低下につながる重篤な感染症であり，これらの事態をひき起こさないために手術前後に眼瞼および結膜.内を十分殺菌しておくことは重要である．キノロン系点眼薬の眼科周術期における無菌化率は高く，トスフロキサシン点眼液の場合も手術14日後に判定した術後感染症の発症は全例（108例）において認めず，また，術後無菌化率は95.1％で，類薬と同程度であった29,30）．これらの成績におけるバイオフィルム形成菌関与の程度は不明であるが，感染時に菌がバイオフィルムを形成している場合の懸念を少しでも払拭する薬剤を使用することが望ましいことから，その薬剤選択には十分な配慮が必要と思われる．以上，キノロン系のトスフロキサシン点眼液はb-ラクタム系のセフメノキシム点眼液より，バイオフィルムを形成したS.epidermidisに強い殺菌効果を示した．また，試験3株中2株ではトスフロキサシン点眼液10MIC作用時の殺菌効果はレボフロキサシン点眼液の場合より強かった．トスフロキサシン点眼液はバイオフィルムを形成したメチシリンおよびキノロン感受性S.epidermidisによる眼感染症の治療，予防において有用と考えられた．文献1）小早川信一郎，井上幸次，大橋裕一ほか：細菌性結膜炎における検出菌・薬剤感受性に関する5年間の動向調査（多施設共同研究）．あたらしい眼科28：679-687,20112）EndophthalmitisVitrectomyStudyGroup：Resultsofthe（97）EndophthalmitisVitrectomyStudy：Arandomizedtrialofimmediatevitrectomyandofintravenousantibioticsforthetreatmentofpostoperativebacterialendophthalmitis.ArchOphthalmol113：1479-1496,19953）薄井紀夫，宇野敏彦，大木孝太郎ほか：白内障に関連する術後眼内炎全国症例調査．眼科手術19：73-79,20064）亀井裕子：眼感染症とバイオフィルム．臨床と微生物36：439-444,20095）BehlauI,GilmoreMS：Microbialbiofilmsinophthalmologyandinfectiousdisease.ArchOphthalmol126：15721581,20086）KodjikianL,BurillonC,LinaGetal：Biofilmformationonintraocularlensesbyaclinicalstrainencodingtheicalocus：ascanningelectronmicroscopystudy.InvestOphthalmolVisSci44：4382-4387,20037）SpoeringAL,LewisK：BiofilmsandplanktoniccellsofPseudomonasaeruginosahavesimilarresistancetokillingbyantimicrobials.JBacteriol183：6746-6751,20018）MayT,ItoA,OkabeS：InductionofmultidrugresistancemechanisminEscherichiacolibiofilmsbyinterplaybetweentetracyclineandampicillinresistancegenes.AntimicrobAgentsChemother53：4628-4639,20099）ChristensenGD,BaldassarriL,SimpsonWA：Colonizationofmedicaldevicesbycoagulase-negativestaphylococci.InBisnoALandWaldvogelFA（ed.）,InfectionsAssociatedwithIndwellingMedicalDevices,2nded.p45-78,AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,D.C.,199410）CatalanottiP,LanzaM,DelPreteAetal：Slime-producingStaphylococcusepidermidisandS.aureusinacutebacterialconjunctivitisinsoftcontactlenswearers.NewMicrobiol28：345-354,200511）GriffithsPG,ElliotTS,McTaggartL：AdherenceofStaphylococcusepidermidistointraocularlenses.BrJOphthalmol73：402-406,198912）YamadaM,YoshidaJ,HatouSetal：MutationsinthequinoloneresistancedeterminingregioninStaphylococcusepidermidisrecoveredfromconjunctivaandtheirassociationwithsusceptibilitytovariousfluoroquinolones.BrJOphthalmol92：848-851,200813）HaasW,PillarCM,HesjeCKetal：Bactericidalactivityofbesifloxacinagainststaphylococci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