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高浸透圧ストレスを負荷した培養ヒト角膜上皮細胞におけるレバミピドの抗炎症作用

admin — Sat, 29 Nov 2014 15:25:18 +0000

《原著》あたらしい眼科31（11）：1687.1691，2014c高浸透圧ストレスを負荷した培養ヒト角膜上皮細胞におけるレバミピドの抗炎症作用中嶋英雄田中直美浦島博樹篠原久司大塚製薬株式会社赤穂研究所Anti-inflammatoryEffectsofRebamipideinHyperosmolar-stressedHumanCornealEpithelialCellsHideoNakashima,NaomiTanaka,HirokiUrashimaandHisashiShinoharaAkoResearchInstitute,OtsukaPharmaceuticalCo.,Ltd.培養ヒト角膜上皮細胞において高浸透圧ストレスによって誘導される炎症性サイトカインの産生ならびにmitogen-activatedproteinkinase（MAPキナーゼ）経路の活性化に対するレバミピドの効果について検討した．細胞をサブコンフルエントまで培養した後，培地から増殖添加剤を除去して以下の検討に用いた．塩化ナトリウムにて調製した400.500mOsMの高浸透圧培地で24時間細胞を培養し，培養上清中の炎症性サイトカイン量をイムノビーズアッセイで測定した．つぎに，1mMまたは2mMレバミピド含有培地で細胞を1時間前処理した後，各濃度のレバミピド存在下で500mOsM培地にて24時間培養した．培養上清中の炎症性サイトカイン量に加えて，炎症性サイトカイン遺伝子の発現量およびMAPキナーゼタンパクのリン酸化レベルをそれぞれリアルタイムRT-PCRおよびイムノビーズアッセイにて評価した．培養上清中のtumornecrosisfactoralpha，monocytechemotacticprotein-1およびinterleukin-7は浸透圧の上昇に依存して増加した．レバミピドはこれらの炎症性サイトカインの産生をタンパクおよび遺伝子レベルで抑制するとともに，高浸透圧ストレスにより亢進されたc-JunN-terminalkinaseおよびp38MAPKのリン酸化を抑制した．レバミピドは，ヒト角膜上皮細胞においてMAPキナーゼ経路の活性化を抑制することにより，高浸透圧ストレス誘導性の炎症性サイトカイン産生を抑制すると考えられた．Thisstudyexaminedtheeffectofrebamipideoninflammatorycytokineproductioninhyperosmolar-stressedhumancornealepithelialcells,andthemechanismbywhichmitogen-activatedprotein（MAP）kinasepathwaysmediatetheactionofrebamipide.Subconfluentcellswereswitchedtogrowthsupplement-freemediumbeforetreatment.Cellswereculturedfor24hoursinthemedium,theosmolarityofwhichwasincreased（400-500mOsM）byaddingNaCl；inflammatorycytokinesreleasedinthemediumwerethenmeasuredusingimmunobeadassay.Next,cellswereculturedfor24hoursin500mOsMmediumwith1mMor2mMrebamipide,whichwaspre-added1hourbeforebeingreplacedwith500mOsMmedium.Then,inadditiontoassessmentofinflammatorycytokinesinthemedium,inflammatorycytokinegeneexpressionandMAPkinasephosphorylationlevelwereassessedusingreal-timeRT-PCRandimmunobeadassay.Tumornecrosisfactoralpha,monocytechemotacticprotein-1andinterleukin-7proteininthemediumincreasedinanosmolarity-dependentmanner.RebamipidesuppressedtheproductionoftheseinflammatorycytokinesatboththeproteinandmRNAlevels,andsuppressedthephosphorylationlevelsofc-JunN-terminalkinaseandp38MAPK,whichwereenhancedbyhyperosmolarity.Theseresultssuggestthatrebamipidesuppresseshyperosmolarity-inducedinflammatorycytokineproductioninhumancornealepithelialcellsviaMAPkinasepathways.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）31（11）：1687.1691,2014〕Keywords：ヒト角膜上皮細胞，高浸透圧ストレス，炎症性サイトカイン，MAPキナーゼ経路，レバミピド．humancornealepithelialcells,hyperosmolarstress,inflammatorycytokines,MAPkinasepathway,rebamipide.〔別刷請求先〕中嶋英雄：〒678-0207兵庫県赤穂市西浜北町1122-73大塚製薬株式会社赤穂研究所Reprintrequests：HideoNakashima,AkoResearchInstitute,OtsukaPharmaceuticalCo.,Ltd.,1122-73Nishihamakita-cho,Akoshi,Hyogo678-0207,JAPAN0910-1810/14/\100/頁/JCOPY（121）1687はじめにドライアイはさまざまな要因に起因する涙液および眼表面上皮における慢性疾患である．その発症メカニズムについては，国内では，涙液と角結膜上皮の異常による涙液安定性の低下がコアメカニズムとして存在し，炎症はこれらが悪循環を起こした結果であると考えられている1）のに対して，海外では，涙液の分泌減少/蒸発亢進による浸透圧の上昇ならびにそれに伴う眼表面の炎症がメカニズムの中心にあり，炎症により上皮細胞ならびに腺組織が障害された結果，涙液層の不安定化が引き起こされるという考え方が主流となっている2）．ドライアイ治療用点眼剤であるレバミピド点眼液は，眼表面ムチンの増加作用3,4）により涙液を安定化させることで角結膜上皮障害を改善する5）．胃炎・胃潰瘍治療剤でもあるレバミピドは胃粘膜組織において抗炎症作用を示すことが知られてきたが，近年，角膜および結膜上皮細胞からの炎症性サイトカイン産生を抑制することが報告されている6,7）．本検討では，高浸透圧ストレスを負荷した培養ヒト角膜上皮細胞を用いてレバミピドの抗炎症作用について検討した．I実験方法1.ヒト角膜上皮細胞の培養初代ヒト角膜上皮細胞（HCEC：LifeTechnologies）は増殖添加剤（HumanCornealGrowthSupplement：LifeTechnologies）および抗菌/抗真菌剤（Gentamicin/AmphotericinB：LifeTechnologies）を加えた基礎培地（Epilife：LifeTechnologies，305mOsM）にて培養した．コラーゲンTypeIコート100mmディッシュ（IWAKI）に細胞を播種し，CO2インキュベーター（37℃，5％CO2）内でサブコンフルエントまで培養した後，0.025％トリプシン/EDTA（エチレンジアミン四酢酸）で細胞を.離した．コラーゲンTypeIコート24ウェルプレート（IWAKI）に5×104/ウェルで細胞を播種し，サブコンフルエントまで培養した後に増殖添加剤を除去して以下の検討に用いた．2.高浸透圧ストレスの負荷とレバミピドの添加高浸透圧ストレスがヒト角膜上皮細胞からの炎症性サイトカイン産生に及ぼす影響に関する検討では，増殖添加剤を除去した基礎培地で24時間培養後に高浸透圧培地（400，450または500mOsM；基礎培地に塩化ナトリウムを加えて調製）に交換し，さらに24時間培養した．レバミピドの効果に関する検討では，増殖添加剤を除去した基礎培地で23時間培養後に1mMまたは2mMレバミピドを添加した基礎培地に交換し，その1時間後に同濃度のレバミピドを添加した500mOsM培地に交換した後，さらに24時間培養した．3.培養上清中の炎症性サイトカインタンパクの定量Bio-Plexアッセイシステム（Bio-Rad）を用いたイムノビ1688あたらしい眼科Vol.31，No.11，2014ーズアッセイ法により培養上清中の炎症性サイトカインタンパク量を評価した．測定サンプルの調製はアッセイキット（ヒトサイトカイン17-Plexパネル）推奨のプロトコールに従って実施し，Bio-Plex200システムを用いて測定した．4.炎症性サイトカイン遺伝子の発現解析PureLinkRNAMiniKit（LifeTechnologies）でtotalRNAを抽出し，PrimeScriptRTreagentKit（タカラバイオ）でcDNAを合成した．SsoFastProbesSupermix（BioRad）およびTaqmanGeneExpressionAssays（tumornecrosisfactoralpha：TNF-a［Hs01113624_g1］，monocytechemotacticprotein-1：MCP-1［Hs00234140_m1］interleukin-7：IL-7［Hs00174202_m1］，glyceraldehyde(，)3-phosphatedehydrogenase：GAPDH［Hs02758991_g1］：AppliedBiosystems）を用いてPCR（polymerasechainreaction）反応液を調製し，CFX96リアルタイムPCR解析システム（Bio-Rad）にて［95℃30秒→（95℃5秒→60℃10秒）×39サイクル］の反応条件で各遺伝子の発現量を解析した．GAPDH遺伝子を内部標準として比較Ct法により各遺伝子の相対発現比を算出した．5.MAPキナーゼ経路活性化の評価種々の環境ストレスによって活性化されるmitogen-activatedproteinkinase（MAPキナーゼ）経路について，BioPlexアッセイシステムを用いたイムノビーズアッセイ法によりc-JunN-terminalkinase（JNK）およびp38MAPKのリン酸化レベルを指標に評価した．測定サンプルは，細胞から抽出した総タンパクをリン酸化型またはトータルターゲットのJNKあるいはp38MAPKに特異的な抗体ビーズ，ついでビオチン化検出抗体と反応させた後，CellSignalingReagentKitを用いて調製した．Bio-Plex200システムにて各サンプル中のリン酸化型MAPキナーゼタンパク量，ならびにリン酸化型を含むトータルのターゲットMAPキナーゼタンパク量を測定した．トータルターゲットタンパク量でリン酸化型タンパク量を補正してリン酸化レベルを算出した．6.統計解析結果は平均値±標準誤差で示した．SAS（SASInstituteJapan，ver.9.3）を用いて5％を有意水準として解析した．高浸透圧ストレスが炎症性サイトカイン産生に及ぼす影響については，直線回帰分析を行ったが単調増加性を確認できなかったため，基礎培地群に対してDunnett検定（両側）を実施した．レバミピドの効果に関する検討においては，基礎培地群と500mOsM培地（レバミピド非添加）群の比較は対応のないt検定を実施した．500mOsM培地の3群間（レバミピド非添加，1mMレバミピド添加および2mMレバミピド添加）の比較は直線回帰分析にて単調減少性を確認した後，レバミピド非添加群に対するWilliams検定（下側）を実施した．なお，単調減少性が確認できなかった場合は非添加群に（122）対するDunnett検定（両側）を実施した．II結果1.高浸透圧ストレスによるヒト角膜上皮細胞からの炎症性サイトカイン産生誘導（図1）培養上清中のTNF-a，MCP-1およびIL-7は浸透圧の上昇に依存して増加し，TNF-aおよびIL-7が500mOsM培地群で，MCP-1が450mOsMおよび500mOsM培地群で有意に高値であった（p＜0.01）．2.炎症性サイトカインタンパクの産生増加に対するレバミピドの抑制効果（図2）500mOsM（レバミピド非添加）培地群のTNF-a，MCP-1およびIL-7はいずれも基礎培地群と比較して有意に高値であった（p＜0.01）．また，1mMおよび2mMレバミピド添加群では非添加群と比較していずれのサイトカインも有意に低値を示した（TNF-aおよびIL-7：p＜0.01，MCP-1：p＜0.01）．3.炎症性サイトカイン遺伝子の発現増強に対するレバミピドの抑制効果（図3）500mOsM（レバミピド非添加）培地群のTNF-a，MCP-1およびIL-7遺伝子の発現量はいずれも基礎培地群と比較して有意に高値であった（p＜0.01）．一方，1mMおa$$bよび2mMレバミピド添加群の遺伝子発現量は非添加群と比較していずれのサイトカインも有意に低値を示した（p＜0.01）．4.MAPキナーゼ経路の活性化に対するレバミピドの抑制作用（図4）500mOsM（レバミピド非添加）培地群ではMAPキナーゼタンパクであるJNKおよびp38MAPKのリン酸化レベルが有意に亢進していた（JNK：p＜0.05，p38MAPK：p＜0.01）．これに対して，1mMおよび2mMレバミピド添加群では非添加群と比較してリン酸化レベルの亢進は抑制される傾向を示し，JNKでは2mMレバミピド添加群にて，また，p38MAPKでは1mMおよび2mMレバミピド添加群にて有意であった（p＜0.05）．III考按ドライアイはさまざまな要因に起因する涙液および眼表面上皮における慢性疾患であるが，国内と海外を比較した場合，そのコアメカニズムの考え方の違いにより，治療に対するアプローチは大きく異なる．国内では，涙液安定性の低下がドライアイのコアメカニズムであるという考え方のもと，涙液安定性に関与する各因子をターゲットにした複数のドライアイ治療薬が開発され，これらを用いた治療（tearfilmc$$$$18015030$$251501201202090159060106030305000図1高浸透圧ストレスによるヒト角膜上皮細胞からの炎症性サイトカイン産生誘導pg/mLa：TNF-a，b：MCP-1，c：IL-7．各値は6例の平均値±標準誤差を示す．305mOsM，400mOsM，450mOsM，500mOsM．＄＄p＜0.01；Dunnett検定（両側）．a##＊＊b##$$c##＊＊4060501520＊＊3062010310000＊＊図2炎症性サイトカインタンパクの産生増加に対するレバミピドの抑制効果40$$91230pg/mLa：TNF-a，b：MCP-1，c：IL-7．各値は4.6例の平均値±標準誤差を示す．305mOsM，500mOsM（レバミピド非添加），500mOsM＋1mMレバミピド，500mOsM＋2mMレバミピド．##p＜0.01；対応のないt検定．＊＊p＜0.01；Williams検定（下側）：直線回帰分析にて単調減少性を確認した後に実施した．＄＄p＜0.01；Dunnett検定（両側）．（123）あたらしい眼科Vol.31，No.11，20141689Relativeexpressionratioa##＊＊b##＊＊c##＊＊4104＊＊83＊＊36224112000＊＊図3炎症性サイトカイン遺伝子の発現増強に対するレバミピドの抑制効果a：TNF-a，b：MCP-1，c：IL-7．各値は305mOsM群の平均値を1としたときの相対発現比で，グラフは6例の平均値±標準誤差を示す．305mOsM，500mOsM（レバミピド非添加），500mOsM＋1mMレバミピド，500mOsM＋2mMレバミピド．##p＜0.01；対応のないt検定．＊＊p＜0.01；Williams検定（下側）：直線回帰分析にて単調減少性を確認した後に実施した．abれ，角膜組織においてリンパ管形成を誘導する作用が報告さ3#＊3##＊れている12）．以上のことから，本モデルは涙液浸透圧の上昇Phosphorylated/Totalを模したinvitro炎症モデルとして有用であると考えられ22＊た．つぎに，本モデルにおけるTNF-a，MCP-1およびIL-7の産生ならびにMAPキナーゼ経路の活性化に対する11レバミピドの効果を検討した．レバミピドはTNF-a，MCP-1およびIL-7の産生をタンパクおよび遺伝子レベル図4MAPキナーゼ経路の活性化に対するレバミピドの抑制で抑制したのに加え，JNKおよびp38MAPKタンパクのリ00作用a：JNK，b：p38MAPK．各値は305mOsM群の平均値を1としたときの相対値で，グラフは6例の平均値±標準誤差を示す．305mOsM，500mOsM（レバミピド非添加），500mOsM＋1mMレバミピド，500mOsM＋2mMレバミピド．#p＜0.05，##p＜0.01；対応のないt検定．＊p＜0.05；Williams検定（下側）：直線回帰分析にて単調減少性を確認した後に実施した．orientedtherapy）が始まっている1）．これに対して海外では，涙液浸透圧の上昇に伴う炎症こそがドライアイの本質であるとする考えから抗炎症を切り口とした治療が行われており，免疫抑制剤であるシクロスポリン点眼による治療効果が報告されている8）．レバミピド点眼液は眼表面のムチンをターゲットとして開発されたドライアイ治療薬であるが，最近，角膜および結膜上皮細胞において各種刺激による炎症性サイトカイン誘導に対する抑制効果6,7）やアレルギー性結膜炎患者の炎症症状に対する有効性9）が報告されている．そこで今回，高浸透圧ストレスを負荷した培養ヒト角膜上皮細胞を用いてレバミピドの抗炎症作用について検討した．まず，培養液の浸透圧がヒト角膜上皮細胞からの炎症性サイトカイン産生に及ぼす影響について検討したところ，高浸透圧培地群ではTNF-a，MCP-1およびIL-7の産生が亢進した．TNF-aおよびMCP-1はドライアイ患者の涙液中で増加することが報告されており10,11），また，IL-7はT細胞の成熟やホメオスタシスに関与するサイトカインとして知ら1690あたらしい眼科Vol.31，No.11，2014ン酸化を抑制した．レバミピドは，角膜上皮細胞に対する高浸透圧ストレスによって誘導されるMAPキナーゼ経路の活性化を抑制することにより炎症性サイトカインの産生亢進を抑制したと推察された．現在用いられている涙液浸透圧の測定方法はメニスカス涙液の浸透圧を測定するものである．これまでの報告では，ドライアイ患者における涙液浸透圧の上昇が指摘されている13）一方で，健常人と比較して浸透圧に差はないとする報告14）もあり，涙液浸透圧のドライアイへの関与に対しては賛否両論がある．現時点では角膜表面涙液の浸透圧を直接測定した報告はないものの，高浸透圧の点眼液が眼不快症状および涙液安定性に及ぼす影響を検討したLiuらの報告15）によると，高浸透圧の涙液が眼表面に障害を与える可能性が示唆されている．さらにLiuらは，塩化ナトリウムによる浸透圧の上昇が眼不快症状に影響するのは500mOsM以上であるとしており，この数値は今回の検討でヒト角膜上皮細胞から炎症性サイトカインの誘導が確認された浸透圧と一致する．また，眼表面の炎症性サイトカイン量は自覚症状の重症度と相関するという報告16）もあり，レバミピド点眼液による自覚症状改善効果5）にはレバミピドの有する抗炎症作用が寄与していることが推測された．これらのことから，レバミピド点眼液は，涙液浸透圧の上昇に伴う炎症に起因すると疑われるドライアイに対しても治療の選択肢の一つになりうると考えられた．今回の検討から，レバミピド点眼液は眼表面においてムチ（124）ン産生促進剤としてだけではなく抗炎症作用を有する薬剤としての可能性も示唆されたことから，多因性の眼疾患であるドライアイに対して有用な治療剤であると思われた．文献1）横井則彦，坪田一男：ドライアイのコア・メカニズム─涙液安定性仮説の考え方─．あたらしい眼科29：291-297,20122）Thedefinitionandclassificationofdryeyedisease：reportoftheDefinitionandClassificationSubcommitteeoftheInternationalDryEyeWorkshop（2007）.OculSurf5：75-92,20073）RiosJD,ShatosMA,UrashimaHetal：EffectofOPC12759onEGFreceptoractivation,p44/p42MAPKactivity,andsecretioninconjunctivalgobletcells.ExpEyeRes86：629-636,20084）ItohS,ItohK,ShinoharaH：Regulationofhumancornealepithelialmucinsbyrebamipide.CurrEyeRes39：133141,20145）KinoshitaS,OshidenK,AwamuraSetal：Arandomized,multicenterPhase3studycomparing2％Rebamipide（OPC-12759）with0.1％sodiumhyaluronateinthetreatmentofdryeye.Ophthalmology120：1158-1165,20136）TanakaH,FukudaK,IshidaWetal：RebamipideincreasesbarrierfunctionandattenuatesTNFa-inducedbarrierdisruptionandcytokineexpressioninhumancornealepithelialcells.BrJOphthalmol97：912-916,20137）UetaM,SotozonoC,YokoiNetal：RebamipidesuppressesPolyI：C-stimulatedcytokineproductioninhumanconjunctivalepithelialcells.JOculPharmacolTher29：688-693,20138）SchultzC：Safetyandefficacyofcyclosporineinthetreatmentofchronicdryeye.OphthalmolEyeDis24：37-42,20149）UetaM,SotozonoC,KogaAetal：UsefulnessofanewtherapyusingrebamipideeyedropsinpatientswithVKC/AKCrefractorytoco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各種保存剤を用いた市販緑内障治療（配合）点眼液における角膜傷害性のキネティクス解析

admin — Tue, 30 Jul 2013 15:32:21 +0000

《原著》あたらしい眼科30（7）：1023.1028，2013c各種保存剤を用いた市販緑内障治療（配合）点眼液における角膜傷害性のキネティクス解析長井紀章＊1大江恭平＊1森愛里＊1伊藤吉將＊1,2岡本紀夫＊3下村嘉一＊3＊1近畿大学薬学部製剤学研究室＊2同薬学総合研究所＊3近畿大学医学部眼科学教室KineticAnalysisofCornealEpithelialCellDamagebyCommerciallyAvailableAnti-Glaucoma（Combination）Eyedrops,UsingFirst-OrderRateEquationNoriakiNagai1）,KyouheiOe1）,AiriMori1）,YoshimasaIto1,2）,NorioOkamoto3）andYoshikazuShimomura3）1）SchoolofPharmacy,2）PharmaceutialResearchandTechnologyInstitute,KinkiUniversity,3）DepartmentofOphthalmology,KinkiUniversitySchoolofMedicine本研究では，ヒト角膜上皮細胞（HCE-T）および一次速度式を用いて緑内障治療薬の急性および慢性毒性を算出し，invitro角膜上皮細胞傷害性評価を行った．緑内障治療薬は市販製剤であるアイファガンR，キサラタンR，チモプトールR，トラバタンズR，トルソプトR，ミケランR，ミロルR，ラタノプロスト「TS」（LPテイカ），イソプロピルウノプロストン「TS」（IUテイカ）および配合点眼薬であるザラカムR，デュオトラバR，コソプトRの12剤を用いた．本研究の結果，急性毒性はザラカムR＞キサラタンR＞IUテイカ＞ミケランR＞コソプトR≒LPテイカ≒ミロルR≒チモプトールR＞デュオトラバR≒トルソプトR＞トラバタンズR＞アイファガンRであり，慢性毒性はキサラタンR≒ザラカムR≒アイファガンR＞IUテイカ＞ミケランR≒ミロルR≒LPテイカ＞チモプトールR＞コソプトR＞デュオトラバR≒トルソプトR＞トラバタンズRの順であった．以上，一次速度式にて解析することで，点眼薬の角膜上皮細胞傷害性を評価できることを明らかとした．Inthisstudy,weinvestigatedcornealepithelialcelldamagecausedbycommerciallyavailableanti-glaucomaeyedrops.Wealsoperformedkineticanalysisofcornealepithelialcelldamage,usingthefirst-orderrateequation,andcalculatedeyedropacuteandchronictoxicity.Usedinthisstudywere12eyedroppreparations：AiphaganR,XalatanR,TimoptolR,TravatanzR,TrusoptR,MikelanR,MirolR,latanoprostgenericproducts（LPTeika）,isopropylunoprostonegenericproducts（IUTeika）andanti-glaucomacombinationeyedrops（XalacomR,DuotravR,CosoptR）.Eyedropacuteandchronictoxicitydecreasedinthefollowingorder：acutetoxicit：XalacomR＞XalatanR＞IUTeika＞MikelanR＞CosoptR≒LPTeika≒MirolR≒TimoptolR＞DuotravR≒TrusoptR＞TravatanzR＞AiphaganR；chronictoxicity：XalatanR≒XalacomR≒AiphaganR＞IUTeika＞MikelanR≒MirolR≒LPTeika＞TimoptolR＞CosoptR＞DuotravR≒TrusoptR＞TravatanzR.Theseresultsshowthatkineticanalysisofcornealepithelialcelldamagecausedbyeyedrops,usingHCE-Tandfirst-orderrateformula,issuitableforresearchingcornealdamagecausedbyanti-glaucomaeyedrops.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）30（7）：1023.1028,2013〕Keywords：緑内障治療薬，速度論解析，ヒト角膜上皮細胞，急性毒性，慢性毒性．anti-glaucomaeyedrops,kineticanalysis,humancorneaepithelialcell,acutetoxicity,chronictoxicity.はじめに治療薬には多くの種類があるが，最も作用が強いという理由失明を伴う眼疾患である緑内障の要因には，眼圧とそれ以から，臨床ではおもにプロスタグランジン（PG）点眼薬が第外の因子（循環障害など）が考えられており，臨床では，緑一選択として用いられ，眼圧コントロールが困難な患者に対内障治療薬による薬物治療が第一選択となる．これら緑内障して作用機序の異なる複数の緑内障治療薬が適宜追加され〔別刷請求先〕伊藤吉將：〒577-8502東大阪市小若江3-4-1近畿大学薬学部製剤学研究室Reprintrequests：YoshimasaIto,Ph.D.,SchoolofPharmacy,KinkiUniversity,3-4-1Kowakae,Higashi-Osaka,Osaka577-8502,JAPAN0910-1810/13/\100/頁/JCOPY（141）1023る．しかし，緑内障治療薬の多剤併用や長期連続投与は点眼表層角膜症や眼瞼炎といった眼局所の副作用や，患者からのしみる，かすむ，眼が充血するといった訴えを増加させるとともに，患者のアドヒアランス低下に繋がる．これらの問題を改善すべく，近年ではsofZiaTM（塩化亜鉛，ホウ酸を含むソルビトール緩衝剤保存システム）を保存剤とするトラバタンズRや亜塩素酸ナトリウムを用いたアイファガンRのようなベンザルコニウム塩化物（BAC）非含有製剤が開発されている．また，ラタノプロスト・チモロールマレイン酸塩配合点眼薬であるザラカムRなどの配合点眼薬も市販され，これらBAC非含有製剤および配合点眼薬はqualityoflife（QOL）の高い治療法へ繋がるものとして注目されている．緑内障治療薬の角膜障害は，点眼薬中に含まれる主薬，添加剤，保存剤だけでなく，角膜知覚，涙液動態および結膜といったオキュラーサーフェス（眼表面）の状態が関与することが明らかとされ，臨床（invivo）および基礎（invitro）両面からの観察が重要であることが報告されている1）．筆者らはこれまで，緑内障治療薬による不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T）傷害作用が，正常ヒト角膜上皮培養細胞への傷害作用に非常に類似し，さらに細胞増殖性，感受性にばらつきが少ないため，HCE-Tが正常ヒト角膜上皮細胞の代わりにinvitro角膜傷害性評価に使用できることを報告してきた2）．また，点眼薬処理時の角膜上皮細胞の生存率から細胞死亡率を測定し，一次速度式を用いた細胞傷害性解析にて，急性および慢性毒性を算出する方法（invitro角膜上皮細胞傷害性評価）が緑内障治療薬の角膜傷害性を明らかとするうえで有用であることを報告してきた3）．今回，HCE-Tを用い，緑内障治療薬処理時の細胞死亡率を測定し，一次速度式を用いた細胞傷害性解析を行うことで，現在臨床現場で多用されているBAC非含有点眼液および緑内障治療配合点眼液のinvitro角膜上皮細胞傷害性評価を行った．I対象および方法1.使用細胞培養細胞は理化学研究所より供与された不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T，RCBNo.1384）を用い，100IU/mlペニシリン（GIBCO社製），100μg/mlストレプトマイシン（GIBCO社製）および5.0％ウシ胎児血清（FBS，GIBCO社製）を含むDMEM/F12培地（GIBCO社製）にて培養した．2.使用薬物緑内障治療薬は市販製剤である0.1％アイファガンR（主薬ブリモニジン酒石酸塩），0.005％キサラタンR（主薬ラタノプロスト），0.5％チモプトールR（主薬チモロールマレイン酸塩），0.004％トラバタンズR（主薬トラボプロスト），1％トルソプトR（主薬ドルゾラミド塩酸塩），2％ミケランR（カルテオロール塩酸塩），0.5％ミロルR（レボブノロール塩酸塩），キサラタンRの後発品である05％ラタノプロスト「TS」（LPテイカ），レスキュラRの後発品である0.12％イソプロピルウノプロストン「TS」（IUテイカ）の9剤および配合点眼薬であるザラカムR（主薬ラタノプロストおよびチモロールマレイン酸塩），デュオトラバR（主薬トラボプロストおよび表1各種緑内障治療薬に含まれる添加物緑内障治療薬添加物キサラタンRベンザルコニウム塩化物（0.02％），等張化剤，無水リン酸一水素Na，リン酸二水素Na一水和物アイファガンR亜塩素酸Na（濃度非公開），塩化Mg，ホウ酸，ホウ砂，カルメロースNa，塩化Na，塩化K，塩化Ca水和物，塩酸，水酸化NaミロルRベンザルコニウム塩化物（0.002％），リン酸二水素K，リン酸水素Na水和物，ピロ亜硫酸Na，等張化剤，pH調整剤，エデト酸Na水和物，ポリビニルアルコール（部分けん化物）ミケランRベンザルコニウム塩化物液（0.005％），塩化Na，リン酸二水素Na，無水リン酸一水素Na，精製水トラバタンズRホウ酸，塩化亜鉛，d-ソルビトール（sofZiaTM），プロピレングリコール，ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油40，pH調節剤2成分チモプトールRベンザルコニウム塩化物液（0.005％），水酸化Na，リン酸二水素Na，リン酸水素Na水和物トルソプトRベンザルコニウム塩化物液（0.005％），ヒドロキシエチルセルロース，d-マンニトール，クエン酸Na水和物，塩酸LPテイカベンザルコニウム塩化物（濃度非公開），グリセリン，トロメタモール，ヒプロメロース，等張化剤，ポリソルベート80，pH調節剤IUテイカクロルヘキシジングルコン酸塩（濃度非公開），ホウ酸，グリセリン，ステアリン酸ポリエチレングリコール，塩酸，トロメタモールザラカムRベンザルコニウム塩化物（0.02％），無水リン酸一水素Na，リン酸二水素Na一水和物，等張化剤デュオトラバR塩化ポリドロニウム（濃度非公開），ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油40，プロピレングリコール，ホウ酸，塩化Na，d-マンニトール，pH調節剤2成分コソプトRベンザルコニウム塩化物液（0.005％），ヒドロキシエチルセルロース，d-マンニトール，クエン酸Na水和物，水酸化Na下線は保存剤を，括弧はその濃度または名称を示す．1024あたらしい眼科Vol.30，No.7，2013（142）チモロールマレイン酸塩），コソプトR（主薬ドルゾラミド塩酸塩およびチモロールマレイン酸塩）の3剤の計12剤を用いた．表1には本研究で用いた各種緑内障治療薬中の添加物を示した．これら点眼薬は製薬会社からの提供ではなく，市販のものを購入しており利益相反はない．3.緑内障治療薬による細胞処理法HCE-T（50×104個）をフラスコ（75cm2）内に播種し，80％に達するまで培養した4,5）．この細胞を，0.05％トリプシンにて.離し，細胞数を計測後，96穴プレートに100μl（1×104個）ずつ播種し，37℃，5％CO2インキュベーター内で24時間培養したものを実験に用いた．実際の操作法として，HCE-T細胞を0，10，20，30，60または120秒間薬剤にて処理後，リン酸緩衝液（PBS）にて2回洗浄し，各wellに100μlの培地およびTetraColorONE（生化学社製）20μlを加え，37℃，5％CO2インキュベーター内で1時間処理後，マイクロプレートリーダー（BIO-RAD社製）にて490nmの吸光度（Abs）を測定した．本実験における細胞傷害評価にはTetraColorONEを用い，テトラゾリウム塩が生細胞内ミトコンドリアのデヒドロゲナーゼにより生産されたホルマザンを測定することで表した．本研究では，薬剤処理後の細胞死亡率（％）を次式（1）により算出した．細胞死亡率（％）＝（Abs未処理.Abs薬剤処理）/Abs未処理×100（1）また，薬剤処理が細胞傷害へ与える影響をより詳細に検討すべく，次式（2）を用いて解析を行った．Dt＝D∞･･t）（2）（1.e.kDkDは細胞傷害速度定数（min.1），tは点眼薬処理後の時間（0.2分），D∞およびDtは薬剤処理∞およびt分後の細胞死亡率を示す．本研究ではkD，D∞をそれぞれ急性毒性および慢性毒性として表した．4.統計学的処理実験結果は平均値±標準誤差（SE）で表した．有意差検定はJAMVer.5.1（日本SAS協会）コンピュータプログラムを用いて行った．各々の実験値はDunnettの多群間比較により解析した．また，本研究ではp値が0.05以下を有意差ありとした．II結果1.緑内障治療薬における角膜上皮細胞傷害性の比較表2にはアイファガンR，ミケランR，ミロルR，LPテイカおよびIUテイカにおける急性毒性（kD）と慢性毒性（D∞）を示す．いずれの処理群においても処理時間の増加とともに細胞死亡率の増加が認められ，傷害性に差がみられた．その急性毒性はIUテイカ＞ミケランR＞LPテイカ≒ミロルR≫アイファガンRの順であった．また，慢性毒性はアイファガンR＞IUテイカ＞ミケランR≒ミロルR≒LPテイカの順で低値を示した．なかでもアイファガンRの急性毒性は0.09±0.02min.1（平均値±標準誤差，n＝7）とこれまで測定した緑内障治療薬のなかで最も低値であった．2.緑内障治療剤・配合点眼液ザラカムR，デュオトラバRおよびコソプトRによる角膜上皮細胞傷害性表3は緑内障治療剤・配合点眼液ザラカムR処理における点眼薬の細胞傷害性を示す．キサラタンRおよびチモプトールRの主薬を有する配合点眼薬であるザラカムRの急性および慢性毒性はそれぞれ7.91±1.58min.1，100.9±3.5％（平均値±標準誤差，n＝5）であり，キサラタンRおよびチモプトールRの急性毒性と比較し，有意に高値であった（慢性毒性；ザラカムR≒キサラタンR＞チモプトールR，急性毒性；ザラカムR≫キサラタンR＞チモプトールR）．表4はトラバタンズRおよびチモプトールRの主薬を有する配合点眼薬であるデュオトラバR処理における点眼薬の細胞傷害性を示す．急性および慢性毒性ともに，デュオトラバRの毒性はトラバタンズRより高かったが，チモプトールRの毒性と比較し低値であった（急性および慢性毒性；チモプトールR＞表2各種緑内障治療薬処理における角膜傷害性の比較アイファガンRミロルRミケランRLPテイカIUテイカkD（min.1）0.09±0.021.81±0.122.45±0.191.79±0.132.63±0.17D∞（％）100.8±14.168.7±3.871.0±2.968.1±2.178.6±3.2平均値±標準誤差，n＝5.8．表3緑内障治療剤・配合点眼液ザラカムR処理における角膜傷害性ザラカムRキサラタンRチモプトールRkD（min.1）7.91±1.582.80±0.25＊1.78±0.06＊D∞（％）100.9±3.5101.5±6.646.6±1.3＊平均値±標準誤差，n＝5．＊p＜0.05vs.ザラカムR（Dunnettの多群間比較）．表4緑内障治療剤・配合点眼液デュオトラバR処理における角膜傷害性デュオトラバRトラバタンズRチモプトールRkD（min.1）1.20±0.030.27±0.07＊1.78±0.06＊D∞（％）12.2±0.93.9±0.3＊46.6±1.3＊平均値±標準誤差，n＝5．＊p＜0.05vs.デュオトラバR（Dunnettの多群間比較）．（143）あたらしい眼科Vol.30，No.7，20131025表5緑内障治療剤・配合点眼液コソプトR処理における角膜傷害性コソプトRトルソプトRチモプトールRkD（min.1）1.79±0.061.27±0.03＊1.78±0.06D∞（％）30.0±1.115.1±0.1＊46.6±1.3＊平均値±標準誤差，n＝5．＊p＜0.05vs.コソプトR（Dunnettの多群間比較）．デュオトラバR＞トラバタンズR）．表5はトルソプトRおよびチモプトールRの主薬を有する配合点眼薬コソプトR処理における点眼薬の細胞傷害性を示す．コソプトRの急性毒性はコソプトR≒チモプトールR＞トルソプトRの順であり，慢性毒性はチモプトールR＞コソプトR＞トルソプトRと，コソプトRの慢性毒性はチモプトールRと比較し有意に低値であった．III考按筆者らはこれまで，一次速度式を用いた細胞死亡率解析により点眼薬点眼時の角膜に対する急性および慢性毒性の算出法を確立した3）．また，現在臨床現場で多用されている緑内障治療薬PG点眼薬先発品（キサラタンR，レスキュラR，トラバタンズRおよびタプロスR）や代表的なラタノプロスト後発品（LPケミファ，LPセンジュ，LPわかもとおよびLPサワイ），チモプトールR，トルソプトR，デタントールR，ハイパジールRおよびサンピロRなどの急性および慢性毒性を算出し，その毒性の強度について報告してきた3）．本研究ではこれら一次速度式を用いたinvitro角膜上皮細胞傷害性評価法により，新たにアイファガンR，ミケランR，ミロルR，LPテイカおよびIUテイカといった，臨床で多用されるBAC非含有点眼液および緑内障治療配合点眼液について評価を行った．さらに，近年注目されている緑内障治療剤・配合点眼液3種（ザラカムR，デュオトラバRおよびコソプトR）についての検討も行った．まず，配合点眼液を除くアイファガンR，ミケランR，ミロルR，LPテイカおよびIUテイカについて評価を行った．いずれの処理群においても処理時間の増加とともに細胞死亡率の増加が認められ，その急性毒性はIUテイカ＞ミケランR＞LPテイカ≒ミロルR≫アイファガンRの順であった．慢性毒性はアイファガンR＞IUテイカ＞ミケランR≒ミロルR≒LPテイカの順で低値を示した（表2）．筆者らはこれまで，pHは4.4.7.5内では，本実験系の細胞生存率にほとんど影響を与えないことを報告してきた3）．また，今回用いた点眼薬におけるpHは5.5.7.5内であることから，これら傷害性は主として添加物によるものと考えられる．点眼薬には品質の劣化を防ぐ目的で保存剤が添加されており，薬剤性角膜傷害には主薬のみでなくこの保存剤が強く関与する6）．なかでも保存剤1026あたらしい眼科Vol.30，No.7，2013BACは界面活性作用により細胞膜の浸透性を高め，膜破壊，細胞質の変性を起こすことで，高い角膜上皮細胞傷害性を有する7,8）．今回用いたミケランR，ミロルRおよびLPテイカでは保存剤としてBACが用いられており，ミケランR，ミロルRに含まれるBAC濃度はそれぞれ0.005％，0.002％であった（LPテイカ中BAC濃度は非公開）．また，Guenounらは結膜細胞を用い，PG分子がBACによる細胞傷害の抑制効果を有していることを報告している9.11）．したがって，ミケランRがミロルRおよびLPテイカと比較し，毒性強度が高い要因として，添加剤中BAC濃度とLPテイカ中の主薬ラタノプロストのBAC角膜傷害性軽減効果が考えられる．一方，アイファガンRとIUテイカではBACは用いられず，保存剤としてそれぞれ亜塩素酸ナトリウム，クロルヘキシジングルコン酸塩が用いられている．これら亜塩素酸ナトリウムおよびクロルヘキシジングルコン酸塩の使用濃度は公開されておらず不明であるが，一般に点眼領域で用いられる濃度範囲〔亜塩素酸ナトリウム：0.00001.1％（w/v），クロルヘキシジングルコン酸塩：0.001.0.01％（w/w）〕を参考とし，0.001％亜塩素酸ナトリウム，0.005％クロルヘキシジングルコン酸塩をHCE-T細胞へ1分間処理した際の細胞傷害性を測定したところ，それぞれ生存率は98.4±1.5％，37.7±2.9％（平均値±標準誤差，n＝5）であった（0.5％亜塩素酸ナトリウム使用時では生存率37.2±6.9％，平均値±標準誤差，n＝5）．したがって，アイファガンRの非常に低い急性毒性は，亜塩素酸ナトリウムという安全な保存剤の適応がかかわっており，アイファガンRは慢性毒性が高いが，急性毒性は非常に低いため，実際の使用時には角膜傷害はほとんどみられず，安全な点眼薬になりうるものと考えられる．一方，IUテイカの急性・慢性毒性は，クロルヘキシジングルコン酸塩がかかわるものと示唆された．また，濃度にもよるが，BACとクロルヘキシジングルコン酸塩では，BACのほうが高い角膜傷害性を示すが，IUテイカの急性・慢性毒性は，先発品であるレスキュラRと比較し高かった3）．この毒性強度の違いには，先に示したPG分子によるBAC細胞傷害の抑制効果がかかわっているのではないかと考えられた．つぎに，緑内障治療剤・配合点眼液ザラカムR，デュオトラバRおよびコソプトRによる角膜上皮細胞への急性および慢性毒性を解析した．筆者らはすでにヒト角膜上皮細胞を用い，配合点眼液ザラカムR，デュオトラバRおよびコソプトRの傷害性の要因について明らかにしており，キサラタンRおよびチモプトールRの主薬を有する配合点眼薬ザラカムRの傷害性には，保存剤BAC濃度とチモロールマレイン酸塩が主として関与することを報告している12）．本結果から，ザラカムRの慢性毒性はザラカムR≒キサラタンR＞チモプトールRであった（表3）．ザラカムR，キサラタンRおよびチモプトールRいずれにおいても保存剤としてBACが用いられ（144）ており，その濃度はザラカムR，キサラタンRでは0.02％，チモプトールRでは0.005％であった．したがって，チモプトールRと比較し，ザラカムRおよびキサラタンRで慢性毒性が高いのは，0.02％というBAC濃度がおもに起因するものと考えられた．さらに，筆者らはチモロールマレイン酸塩とBACの細胞傷害性は相加的に上昇することもすでに明らかにしており12），ザラカムRの急性毒性が同濃度のBACを含有するキサラタンRより高い角膜上皮細胞傷害性を示す要因には，チモロールマレイン酸塩がかかわるものと示唆された（急性毒性：ザラカムR≫キサラタンR＞チモプトールR）．トラバタンズRおよびチモプトールRの主薬を有する配合点眼薬デュオトラバRの急性および慢性毒性は，ともにトラバタンズRより高かったが，チモプトールRの毒性と比較し低値であった（表3，急性および慢性毒性；チモプトールR＞デュオトラバR＞トラバタンズR）．デュオトラバRやトラバタンズRはBAC非含有製剤であり，日本アルコン株式会社が特許を有するポリクオッド（塩化ポリドロニウム）およびsofZiaTM（塩化亜鉛，ホウ酸を含むソルビトール緩衝剤保存システム）をそれぞれ保存剤として使用している．これら保存剤はBACの高い角膜上皮細胞傷害性を避けるために考案されたものであり，デュオトラバRやトラバタンズRの急性・慢性毒性がチモプトールRのそれらより低いという今回の結果はこれらの知見（製剤工夫の目的）と一致した．また，デュオトラバR中のチモロールマレイン酸塩は，デュオトラバRとトラバタンズR間における毒性の強度差にかかわるものと示唆された．コソプトR（主薬ドルゾラミド塩酸塩およびチモロールマレイン酸塩）では，急性毒性はコソプトR≒チモプトールR＞トルソプトRの順であったが，慢性毒性はチモプトールRと比較し低く，チモプトールR＞コソプトR＞トルソプトRであった（表5）．コソプトR，トルソプトRおよびチモプトールRもまた保存剤としてBACが用いられており，トルソプトR，チモプトールRおよびコソプトR中のBAC濃度は0.005％である．しかし，急性毒性はトルソプトRが最も低く，チモプトールR・トルソプトRの主薬を含むコソプトRとチモプトールRでは同程度であり，慢性毒性はチモプトールR＞コソプトR＞トルソプトRの順と，BAC濃度や主薬の関係だけでは説明できなかった．BAC濃度は角膜傷害性に強くかかわるが，筆者らはd-マンニトールが添加されている際，BACの細胞傷害性が軽減されることを明らかとしており12），コソプトRおよびトルソプトRには，添加剤としてd-マンニトールが用いられている．したがって，これらd-マンニトールの含有がコソプトRの角膜傷害性が，チモプトールR単剤より低いという結果に繋がっているものと示唆された．Invitro実験系にて点眼薬の角膜傷害性を検討するうえで，点眼薬処理時間の設定は重要である．Invivoでは一般（145）的に点眼薬は点眼後涙液により1/5まで希釈され，その後涙液として鼻涙管から排出されることが知られている13）．このように，invivoでは薬剤が長時間角膜に滞留しないことから，本実験のようなinvitro実験系では臨床（invivo）よりも短時間で強い細胞傷害性が認められる．したがって，本研究では点眼薬処理開始後2分を目安に実験を行い，点眼薬自身の角膜上皮細胞への傷害性評価を行った．急性毒性は薬剤の角膜傷害性の起こしやすさや進行速度を反映し，慢性毒性からは傷害時の大きさ（深刻度）についての情報を得ることが可能であるため，慢性毒性が高く急性毒性の低い薬剤では，正常なオキュラーサーフェスではその傷害性はわずかであるが，ドライアイ患者などでは涙液低下や滞留の増加により急性毒性が高まる可能性が考えられる．これら角膜上皮細胞傷害性は，臨床においては涙液分泌能低下などの他の作用により相乗的に角膜上皮細胞傷害をひき起こすことから12），今回のinvitroの結果（角膜傷害強度および傷害速度の算出）を基盤とした臨床結果のさらなる解析は，緑内障患者の状態に合わせた薬剤決定をより容易にするために重要である．本報告は今後の点眼薬開発および緑内障治療薬投与時における薬物選択を決定するうえで一つの指標になるものと考えられる．文献1）徳田直人，青山裕美子，井上順ほか：抗緑内障薬が角膜に及ぼす影響：臨床とinvitroでの検討．聖マリアンナ医科大学雑誌32：339-356,20042）長井紀章，伊藤吉將，岡本紀夫ほか：抗緑内障点眼薬の角膜障害におけるInVitroスクリーニング試験：SV40不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T）を用いた細胞増殖抑制作用の比較．あたらしい眼科25：553-556,20083）長井紀章，大江恭平，伊藤吉將ほか：ヒト角膜上皮細胞（HCE-T）を用いた緑内障治療薬のInVitro角膜細胞傷害性評価．あたらしい眼科28：1331-1336,20114）ToropainenE,RantaVP,TalvitieAetal：Culturemodelofhumancornealepitheliumforpredictionofoculardrugabsorption.InvestOphthalmolVisSci42：2942-2948,20015）TalianaL,EvansMD,DimitrijevichSDetal：Theinfluenceofstromalcontractioninawoundmodelsystemoncornealepithelialstratification.InvestOphthalmolVisSci42：81-89,20016）NagaiN,MuraoT,OkamotoNetal：Comparisonofcornealwoundhealingratesafterinstillationofcommerciallyavailablelatanoprostandtravoprostinratdebridedcornealepithelium.JOleoSci59：135-141,20107）河嶋洋一：防腐剤の功罪（使い捨て点眼薬を含む），点眼薬の使い方．眼科診療プラクティス44，p86-87，文光堂，19998）DeSaintJeanM,BrignoleF,BringuierAFetal：EffectsofbenzalkoniumchlorideongrowthandsurvivalofChangconjunctivalcells.InvestOphthalmolVisSci40：あたらしい眼科Vol.30，No.7，20131027619-630,19999）PisellaPJ,DebbaschC,HamardPetal：Conjunctivalproinflammatoryandproapoptoticeffectsoflatanoprostandpreservedandunpreservedtimolol：anexvivoandinvitrostudy.InvestOphthalmolVisSci45：1360-1368,200410）GuenounJM,BaudouinC,RatPetal：Invitrostudyofinflammatorypotentialandtoxicityprofileoflatanoprost,travoprost,andbimatoprostinconjunctiva-derivedepithelialcells.InvestOphthalmolVisSci46：2444-2450,200511）GuenounJM,BaudouinC,RatPetal：Invitrocomparisonofcytoprotectiveandantioxidativeeffectsoflatanoprost,travoprost,andbimatoprostonconjunctiva-derivedepithelialcells.InvestOphthalmolVisSci46：4594-4599,200512）NagaiN,MuraoT,OeKetal：Aninvitroevaluationforcornealdamagesbyanti-glaucomacombinationeyedropsusinghumancornealepithelialcell（HCE-T）.YakugakuZasshi131：985-991,201113）後藤浩，吉川啓司，山田昌和ほか：眼科開業医のための疑問・難問解決策．p216-217，診断と治療社,2006＊＊＊1028あたらしい眼科Vol.30，No.7，2013（146）

酸化ストレスによる角膜上皮バリアの障害に対するレバミピドの効果

admin — Sat, 29 Sep 2012 15:23:36 +0000

《原著》あたらしい眼科29（9）：1265.1269，2012c酸化ストレスによる角膜上皮バリアの障害に対するレバミピドの効果竹治康広田中直美篠原久司大塚製薬株式会社赤穂研究所ProtectiveEffectofRebamipideonOxidativeStress-inducedDisruptionofBarrierFunctioninHumanCornealEpithelialCellsYasuhiroTakeji,NaomiTanakaandHisashiShinoharaAkoResearchInstitute,OtsukaPharmaceuticalCo.,Ltd.酸化ストレスは，さまざまな前眼部疾患の発症・増悪に関与しており，ドライアイもその一つであると考えられている．レバミピドは，角膜および結膜においてムチン産生促進作用を有するドライアイに対する治療薬であり，またフリーラジカル消去作用をもつことが報告されている．今回，酸化ストレスによる角膜バリアの障害に対するレバミピドの効果について，培養ヒト角膜上皮細胞を用いて検討した．バリアの機能について経上皮電気抵抗（TER）を，バリアの構造についてタイトジャンクションの構成蛋白を指標とし，酸化ストレスの負荷方法として過酸化水素を用いた．その結果，過酸化水素を角膜上皮細胞に処理すると，TERは用量依存的に低下するが，そのTERの低下はレバミピドの前処置により抑制された．さらに，レバミピドは過酸化水素によるタイトジャンクションの構成蛋白であるZonulaoccludens-1の障害に対して保護作用を示した．以上より，レバミピドは，培養角膜上皮細胞において，酸化ストレスによるバリア機能およびタイトジャンクションの障害に対して保護作用を示すことが明らかになった．Oxidativestressisthoughttobeinvolvedintheonsetandexacerbationofvariousanterioreyediseases,suchasdryeye.Rebamipide,atherapeuticagentfordryeyethatpromotestheproductionofmucinincorneaandconjunctiva,reportedlyhasafreeradicalscavengingaction.Inthepresentstudy,weinvestigatedtheeffectivenessofrebamipideagainstcornealbarrierdisruptioncausedbyoxidativestress,usingculturedhumancornealepithelialcells.Transepithelialelectricalresistance（TER）wasevaluatedasanindicatorofbarrierfunction,andtightjunctionproteinsasanindicatorofbarrierstructure.Hydrogenperoxidewasusedforoxidativestresschallenge.TreatmentwithhydrogenperoxideinducedTERdecreaseinadose-dependentmanner,butthedecreasewassuppressedbypretreatmentwithrebamipide.Inaddition,rebamipideexhibitedaprotectiveactionagainsthydrogenperoxideimpairmentofZonulaoccludens-1,atightjunctionprotein.Rebamipidewasthusshowntohaveaprotectiveactionagainstoxidativestress-inducedbarrierfunctionandtightjunctionimpairmentinthecornealepithelialcell.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）29（9）：1265.1269,2012〕Keywords：レバミピド，ヒト角膜上皮細胞，酸化ストレス，バリア機能，タイトジャンクション．rebamipide,humancornealepithelialcell,oxidativestress,barrierfunction,tightjunction.はじめに眼領域において，ドライアイ，白内障，ぶどう膜炎など多くの疾患の発症・増悪に酸化ストレスは関与している．酸化ストレスは，眼表面における活性酸素の産生亢進と，生体内の活性酸素に対する防御機構とのバランスにより調節されている1）．涙液中にはスーパーオキシドジスムターゼやラクトフェリンなどの抗酸化作用を含む物質が含まれており，防御機構の役割を果たしている．正常な状態であれば紫外線などさまざまな要因により発生した活性酸素は速やかに消去されるが，〔別刷請求先〕竹治康広：〒678-0207兵庫県赤穂市西浜北町1122-73大塚製薬株式会社赤穂研究所Reprintrequests：YasuhiroTakeji,AkoResearchInstitute,OtsukaPharmaceuticalCo.,Ltd.,1122-73Nishihamakita-cho,Ako-shi,Hyogo678-0207,JAPAN0910-1810/12/\100/頁/JCOPY（89）1265涙液量が低下しているドライアイでは，発生した活性酸素を十分に消去できなくなる．増加した活性酸素は，角膜に障害を与えドライアイの増悪の原因の一つになっているのではないかと考えられている2）．角膜上皮は，病原微生物の感染，粉塵，外傷など外界からの直接的な侵襲から角膜を保護しており，隣接する角膜上皮細胞間に存在する接着構造がバリアとして重要な働きを担っている．数種の接着構造が角膜上皮には存在し，そのなかでも最も表層に存在するタイトジャンクションが外界からの刺激を受けやすい．培養角膜上皮細胞に炎症性サイトカインや低酸素などの刺激を与えると，タイトジャンクションが障害を受ける3）．さらに，タイトジャンクションは，活性酸素による酸化ストレスによっても障害を受けることが報告されている4）．レバミピドは，角膜および結膜においてムチン産生促進作用を有するドライアイに対する治療薬である一方，ヒドロキシラジカル消去作用を有する抗酸化物質の一面をもつことが報告されている5）．今回，培養角膜上皮細胞における酸化ストレスによるバリア障害に対するレバミピドの作用を，バリア機能および，タイトジャンクション蛋白の両面から検討した．I実験方法1.細胞培養ヒト角膜上皮細胞（SV40不死化ヒト角膜上皮細胞，RCBNo.2280：理化学研究所）を10％FBS（fetalbovineserum）（ATCC：AmericanTypeCultureCollection）を含むDulbecco’sModifiedEagleMedium/F-12（DMEM/F-12）（Invitrogen）を用いて37℃，5％CO2インキュベーター内で培養し継代維持した．経上皮電気抵抗（transepithelialelectricresistance：TER）測定の試験において，細胞懸濁液を24穴のトランスウェルプレート（ミリポア）に5×104cells/wellで添加し，blankwellには細胞を含まない培地を添加した．細胞播種4日後，FBSを含まないDMEM/F-12に交換した．免疫染色およびWesternblottingの試験において，細胞懸濁液を24ウェルプレートに5×104cells/wellで播種した．細胞がコンフレントになった後，10％FBSを含まないDMEM/F-12に交換した．2.薬物の投与レバミピド（大塚製薬）およびジクアホソルナトリウム（大塚製薬）ともFBSを含まないDMEM/F-12に溶解させて使用した．TERに対する過酸化水素の用量反応性の検討について，FBSを含まないDMEM/F-12に交換した翌日，新たな培地に交換した．その1時間後，過酸化水素（和光純薬）を添加1266あたらしい眼科Vol.29，No.9，2012し，37℃，5％CO2インキュベーター内で静置した．TER測定，免疫染色およびWesternblottingの各試験でのドライアイ治療薬の検討について，FBSを含まないDMEM/F-12に交換した翌日，コントロール（培地のみ），レバミピドおよびジクアホソルナトリウムを溶解させた培地に交換した．薬物添加1時間後，過酸化水素を添加し，37℃，5％CO2インキュベーター内で静置した．正常群には，過酸化水素ではなく培地を添加した．3.経上皮電気抵抗（TER）の測定過酸化水素添加24時間後に，電気抵抗値測定システム（ミリセルERS-2,ミリポア）を用いて各wellのTERを測定した．TERは以下の式により算出した．TER（W・cm2）＝（薬物添加wellの電気抵抗.blankwellの電気抵抗）×培養面積（cm2）4.Zonulaoccludens.1（ZO.1）の免疫染色過酸化水素添加24時間後にZO-1の免疫染色を実施した．細胞を100％メタノールで20分間固定した後，0.1％Triton-Xを含むPBS（phosphatebufferedsaline）で30分間透過処理した．1％BSA（bovineserumalbumin）/PBSを1時間室温処置でブロッキングを実施した後，一次抗体のZO-1抗体（1：100,Invitrogen）で1時間室温インキュベートした．PBSで洗浄後，AlexaFluor488-conjugate二次抗体（1：1,000,Invitrogen）で室温1時間，さらに0.5μMDAPI（4￠,6-diamidino-2-phenylindol）（Polyscience）を室温30分間インキュベートし，核染色を行った．洗浄後，蛍光顕微鏡（BZ-9000,Keyence）を用いて観察した．5．ZO.1蛋白の発現過酸化水素添加24時間後にZO-1蛋白の発現をWesternblottingにて実施した．Proteaseinhibitorcocktail含有RIPAbufferにて蛋白を抽出し，BCAProteinAssayKit（ThermoSCIENTIFIC）を用いて蛋白濃度測定を行った．蛋白抽出液を電気泳動し，メンブレンに転写した後，ブロッキング処理を施した．一次抗体であるantiZO-1ポリクローナル抗体（1：300,Invitrogen）およびantib-actin抗体（AC-15）（1：10,000,Abcam）で4℃オーバーナイト，およびhorseradishperoxidase-conjugated二次抗体（GEHealthcare）で室温1時間処理し，標的蛋白を検出した．検出したバンドはImageQuantTL（GEHealthcare）を用いて，シグナル強度を数値化した．ZO-1蛋白のシグナル強度をb-actinシグナル強度で補正し，ZO-1蛋白の発現量を算出した．6.統計解析統計解析をSAS（Release9.1,SASInstituteJapan,Ltd）を用いて実施した．（90）TERに対する過酸化水素の用量反応性について，0μMと500各濃度（250,500および750μM）の過酸化水素でDunnett500各濃度（250,500および750μM）の過酸化水素でDunnett400検定（両側）を行った．TERに対するドライアイ治療薬の効果の検討については，正常とコントロールで対応のないt-検定（両側）を行った．レバミピドの用量反応性については，直線回帰分析による単調増加性が確認されたため，コントロールとレバミピドの各群でWilliams検定（上側）を行った．ジクアホソルナトリウムの効果については，コントロールとの間で対応のないt検定（両側）を実施した．ZO-1発現の検討については，正常とコントロールで対応のないt-検定（両側）を行い，コントロールとレバミピドおよびジクアホソルナトリウムの各群でDunnett検定（両側）を行った．いずれの検定も5％を有意水準として解析した．II結果＊＊＊＊TER（W・cm2）3002001000過酸化水素（μM）図1角膜上皮細胞におけるバリア機能に及ぼす過酸化水素の影響値は平均値±標準誤差を示す（n＝4）．TERは過酸化水素添加24時間後に測定．＊＊：p＜0.01vs0mM〔Dunnetttest（両側）〕．02505007501.TERに対する過酸化水素の用量反応性500角膜上皮細胞に過酸化水素を添加し，24時間後のTERの結果を図1に示す．過酸化水素の用量に依存して，TERは400＃＃＃＊＊低下した．250μM過酸化水素添加時のTER（420±18W・cm2；平均値±標準誤差）は，0μM（382±20W・cm2）に対してほとんど変化を示さないのに対し，500μMでは279±13W・cm2に，750μMでは127±4W・cm2に有意に低下した．TER（W・cm2）3002001002.TERに対するドライアイ治療薬の効果角膜上皮細胞におけるTERに対するドライアイ治療薬（レバミピドおよびジクアホソルナトリウム）の効果を検討した（図2）．過酸化水素の濃度は，TERが約7割に低下する500μMを用いた．その結果，レバミピドの前処置により，過酸化水素によるTERの低下は用量依存性に抑制された．300μMおよび1,000μMでレバミピドは，コントロールに対して有意な差を示した．一方，ジクアホソルナトリウムはコントロールに対して変化を示さなかった．3.タイトジャンクション蛋白に対するドライアイ治療薬の効果タイトジャンクションの構成蛋白の一つであり，角膜を含めさまざまな組織でタイトジャンクションのマーカーとして利用されているZO-1に対するレバミピドの作用を免疫染色およびWesternblottingにより検討した．免疫染色の結果（図3），正常群では，ZO-1は，細胞-細胞間つまりタイトジャンクションに局在していることが観察された．500μM過酸化水素を添加すると，部分的にZO-1のタイトジャンクションへの局在が阻害されていることが観察された．1,000μMレバミピドを前処置しておくと，過酸化水素により生じたZO-1の変化は抑制されたが，1,000μMジクアホソルナトリウムはZO-1の変化に対して作用を示さ（91）0正常ジクアホソルレバミピド（μM）ナトリウム500μM過酸化水素図2酸化ストレスによるバリア機能の低下に対するドライアイ治療薬の効果値は平均値±標準誤差を示す（n＝4）．TERは過酸化水素添加24時間後に測定．＊＊：p＜0.01vs正常〔対応のないt-検定（両側）〕．＃：p＜0.05，＃＃：p＜0.01vsコントロール〔Williams検定（上側）〕．なかった．ZO-1蛋白発現に対するレバミピドの作用をWesternblottingにより検討した（図4）．正常群に比べ500μM過酸化水素を添加すると，ZO-1蛋白発現の低下が観察された．1,000μMレバミピドを前処置しておくと，過酸化水素により生じたZO-1蛋白発現低下は抑制された．III考按ドライアイの発症・増悪には，涙液の異常以外にも多くの要因が関与しており，外的もしくは内的要因により生じた活性酸素の増加がその一つとして報告されている2）．角膜上皮あたらしい眼科Vol.29，No.9，20121267コントロール1003001,0001,000μM正常過酸化水素（コントロール）過酸化水素（レバミピド処置）過酸化水素（ジクアホソルナトリウム処置）図3酸化ストレスによるZO.1の変化に対するドライアイ治療薬の効果培地（コントロール），レバミピドおよびジクアホソルナトリウムを添加し，1時間後に500μMの過酸化水素を添加した．免疫染色は，過酸化水素添加24時間後に実施した．過酸化水素により，ZO-1のタイトジャンクションへの局在が阻害された（矢印）．その阻害は，レバミピドの前処置により抑制された．ZO-1b-actinジクアホソル正常コントロールレバミピドナトリウム500μM過酸化水素0.10＊＊0.080.060.040.020.00正常コントロールレバミピドジクアホソルナトリウム＃ZO-1/b-actin500μM過酸化水素図4酸化ストレスによるZO.1の変化に対するドライアイ治療薬の効果値は平均値±標準誤差を示す（n＝6）．＊＊：p＜0.01vs正常〔対応のないt-検定（両側）〕．＃：p＜0.05vsコントロール〔Dunnett検定（両側）〕．および涙液中には，活性酸素を消去する物質が存在しているため，眼表面で発生した活性酸素は速やかに消去されるが，涙液分泌の異常に伴う抗酸化物質の減少，炎症を伴う病態および紫外線などの影響を受けた場合，活性酸素が上昇する．増加した活性酸素は，直接的に角膜障害を起こしたり，また炎症反応を介してドライアイの発症・増悪をひき起こしていると考えられている．ドライアイ患者の涙液において，過酸化脂質が高いことからも，ドライアイの発症・増悪には酸化ストレスが関与していることが示唆されている6）．角膜上皮において，バリア機能が障害された所見の一つとして点状表層角膜症がある．この所見は，ドライアイ，アトピー性角膜炎，春季カタル，薬剤性角膜上皮障害などでみられ，上皮の表層細胞が欠損しており，その部位でタイトジャンクションの障害が生じている7）．レバミピドは，培養胃上皮細胞において酸化ストレスによるバリア機能低下を抑制し，その効果はタイトジャンクションの障害に対する保護作用によることが報告されている8）．今回，角膜上皮細胞における酸化ストレスによるバリア障害に対するレバミピドの効果を検討した．酸化ストレスを負荷する方法として，活性酸素の一つであるヒドロキシラジカルを生じる過酸化水素を用いた．生体内で過酸化水素より産生されるヒドロキシラジカルは，分解する酵素がないうえに，非常に高い細胞障害性をもつ物質である．1268あたらしい眼科Vol.29，No.9，2012（92）角膜バリア機能の指標となるTERにおいて，レバミピドは過酸化水素によるTER低下に対して保護作用を示した．また，角膜バリアの役割を担うタイトジャンクションの構成蛋白の一つであるZO-1の障害に対しても保護作用を示した．以前の報告で，レバミピドはelectronspinresponse法を用いた検討において，ヒドロキシラジカルを消去する作用を有することが確認されており5），またラットのUVB（ultraviolet-B）誘導による角膜障害および酸化ストレスマーカーである8-OHdG（8-hydroxydeoxyguanosine）の増加に対して抑制作用を示し，その作用はヒドロキシラジカルを消去したためであることが報告されている9）．そこで今回のレバミピドの過酸化水素に対する保護作用は，この活性酸素をトラップしたためであると推測される．以上より，レバミピドは，培養角膜上皮細胞において，酸化ストレスによるバリア機能およびタイトジャンクションの障害に対して保護作用を示すことが明らかになった．文献1）WakamatsuTH,DogruM,TsubotaK：Tearfulrelations：oxidativestress,inflammationandeyediseases.ArqBrasOftalmol71：72-79,20082）樋口明弘，坪田一男：ドライアイ活性酸素仮説．あたらしい眼科25：1639-1645,20083）木村和博：炎症性サイトカインtumornecrosisfactor-aによる培養角膜上皮バリアー破綻の機序．日眼会誌114：935-943,20104）BasuroyS,SethA,EliasBetal：MAPKinteractswithoccludinandmediatesEGF-inducedpreventionoftightjunctiondisruptionbyhydrogenperoxide.BiochemJ393：69-77,20065）YoshikawaT,NaitoY,TanigawaTetal：Freeradicalscavengingactivityofthenovelanti-ulceragentrebamipidestudiedbyelectronspinresonance.Arzneimittelforschung43：363-366,19936）AugustinAJ,SpitznasM,KavianiNetal：Oxidativereactionsinthetearfluidofpatientssufferingfromdryeyes.GraefesArchClinExpOphthalmol233：694-698,19957）横井則彦：眼表面上皮のバリアー機能と疾患への応用．眼科NewInsight10：14-29,19978）HashimotoK,OshimaT,TomitaTetal：Oxidativestressinducesgastricepithelialpermeabilitythroughclaudin-3.BiochemBiophysResCommun376：154-157,20089）TanitoM,TakanashiT,KaidzuSetal：CytoprotectiveeffectsofrebamipideandcarteololhydrochlorideagainstultravioletB-inducedcornealdamageinmice.InvestOphthalmolVisSci44：2980-2985,2003＊＊＊（93）あたらしい眼科Vol.29，No.9，20121269

ヒト角膜上皮細胞（HCE-T）を用いた緑内障治療薬のIn Vitro角膜細胞傷害性評価

admin — Thu, 29 Sep 2011 15:25:23 +0000

0910-1810/11/\100/頁/JCOPY（111）1331《原著》あたらしい眼科28（9）：1331?1336，2011cはじめに緑内障治療薬には多くの種類があるが，最も作用が強いという理由から，臨床ではおもにプロスタグランジン（PG）点眼薬が第一選択として用いられ，眼圧コントロールが困難な患者に対して作用機序の異なる複数の緑内障治療薬が適宜追加される．しかし，緑内障治療薬の多剤併用は点眼表層角膜症や眼瞼炎といった眼局所の副作用や，患者からのしみる，かすむ，眼が充血するといった訴えを増加させるとともに，患者のアドヒアランス低下に繋がる．したがって，現在用いられている緑内障治療薬の角膜上皮に対する傷害性を明らか〔別刷請求先〕伊藤吉將：〒577-8502東大阪市小若江3-4-1近畿大学薬学部製剤学研究室Reprintrequests：YoshimasaIto,Ph.D.,SchoolofPharmacy,KinkiUniversity,3-4-1Kowakae,Higashi-Osaka,Osaka577-8502,JAPANヒト角膜上皮細胞（HCE-T）を用いた緑内障治療薬のInVitro角膜細胞傷害性評価長井紀章＊1大江恭平＊1伊藤吉將＊1,2岡本紀夫＊3下村嘉一＊3＊1近畿大学薬学部製剤学研究室＊2同薬学総合研究所＊3近畿大学医学部眼科学教室InVitroEvaluationofCornealDamageCausedbyAnti-GlaucomaEyedropsUsingHumanCornealEpithelialCell（HCE-T）NoriakiNagai1）,KyouheiOe1）,YoshimasaIto1,2）,NorioOkamoto3）andYoshikazuShimomura3）1）SchoolofPharmacy,2）PharmaceuticalResearchandTechnologyInstitute,KinkiUniversity,3）DepartmentofOphthalmology,KinkiUniversitySchoolofMedicine本研究では，ヒト角膜上皮細胞（HCE-T）および1次速度式を用いて緑内障治療薬の慢性および急性毒性を算出し，invitro角膜上皮細胞傷害性評価を行った．緑内障治療薬は市販製剤であるチモプトールR，レスキュラR，キサラタンR，トラバタンズR，タプロスR，トルソプトR，デタントールR，ハイパジールR，サンピロRおよびキサラタンRの後発品であるラタノプロスト「ケミファ」（LPケミファ），「センジュ」（LPセンジュ），「わかもと」（LPわかもと），「サワイ」（LPサワイ）の13剤を用いた．本研究の結果，慢性毒性はキサラタンR≒LPケミファ≒LPわかもと≒LPセンジュ≒デタントールR＞LPサワイ≒レスキュラR＞タプロスR＞チモプトールR＞ハイパジールR＞サンピロR＞トルソプトR＞トラバタンズRであり，急性毒性はLPわかもと≒LPセンジュ＞キサラタンR＞LPサワイ≒レスキュラR＞タプロスR≒チモプトールR≒ハイパジールR≒サンピロR＞トルソプトR＞LPケミファ≒デタントールR≒トラバタンズRの順であった．以上，1次速度式にて解析することで，点眼薬の角膜上皮細胞傷害性を評価できることを明らかとした．Inthisstudy,weinvestigatedcornealepithelialcelldamagecausedbycommerciallyavailableanti-glaucomaeyedrops.Wealsoperformedkineticanalysisofcornealepithelialcelldamageusingthefirst-orderrateformula,andcalculatedthechronicandacutetoxicityofeyedrops.Usedinthisstudywere13preparationsofeyedrops（TimoptolR,ResculaR,XalatanR,TravatanzR,TaprosR,TrusoptR,DetantolR,HypadilR,SanpiloRandlatanoprostgenericproducts（LPChemiphar,LPSENJU,LPWAKAMOTO,LPSAWAI）.Eyedropchronicandacutetoxicitydecreasedinthefollowingorder：chronictoxicity,XalatanR≒LPChemiphar≒LPWAKAMOTO≒LPSENJU≒DetantolR＞LPSAWAI≒ResculaR＞TaprosR＞TimoptolR＞HypadilR＞SanpiloR＞TrusoptR＞TravatanzR；acutetoxicity,LPWAKAMOTO≒LPSENJU＞XalatanR＞LPSAWAI,ResculaR＞TaprosR≒HypadilR≒SanpiloR≒TimoptolR＞TimoptolR＞LPChemiphar,DetantolR≒TravatanzR.Theseresultsshowthatkineticanalysisofcornealepithelialcelldamagecausedbyeyedrops,usingHCE-Tandfirst-orderrateformula,issuitableforresearchingcornealdamagecausedbyanti-glaucomaeyedrops.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）28（9）：1331?1336,2011〕Keywords：緑内障治療薬，速度論解析，ヒト角膜上皮細胞，慢性毒性，急性毒性．anti-glaucomaeyedrops,kineticanalysis,humancorneaepithelialcell,chronictoxicity,acutetoxicity.1332あたらしい眼科Vol.28，No.9，2011（112）とすることは臨床的に非常に重要である．緑内障治療薬の角膜傷害は，角膜知覚，涙液動態および結膜といったオキュラーサーフェス（眼表面）の状態が関与することから，臨床（invivo）および基礎（invitro）両面からの観察が重要であることが報告されている1）．筆者らはこれまで，角膜上皮細胞を用い点眼薬処理時の細胞増殖抑制率を求め，点眼薬の細胞傷害性の評価を行ってきた2）．また，緑内障治療薬による不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T）傷害作用が，正常ヒト角膜上皮培養細胞への傷害作用に非常に類似し，さらに細胞増殖性，感受性にばらつきが少ないため，HCE-Tが正常ヒト角膜上皮細胞の代わりにinvitro角膜傷害性評価に使用できることを報告している2）．一方，この方法は角膜細胞増殖の抑制からその傷害性を表す間接的なものであるため，点眼薬処理時の角膜上皮細胞の生存率から細胞死亡率を算出するほうが臨床での使用状況に近く，より意義のある方法と考えられた．今回，HCE-Tを用い，現在臨床現場で多用されている緑内障治療薬処理時の細胞死亡率を測定するとともに，1次速度式を用いた細胞傷害性解析によるinvitro角膜上皮細胞傷害性評価を行った．I対象および方法1.使用細胞培養細胞は理化学研究所より供与された不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T，RCBNo.1384）を用い，100IU/mlペニシリン（GIBCO社製），100μg/mlストレプトマイシン（GIBCO社製）および5.0％ウシ胎児血清（FBS，GIBCO社製）を含むDMEM/F12培地（GIBCO社製）にて培養した．2.使用薬物緑内障治療薬は市販製剤であるb遮断薬（0.5％チモプトールR），PG点眼薬（0.12％レスキュラR，0.005％キサラタンR，0.004％トラバタンズR，0.0015％タプロスR），炭酸脱水酵素阻害薬（1％トルソプトR），選択的交感神経a1遮断薬（0.01％デタントールR），a，b受容体遮断薬（0.25％ハイパジールR），副交感神経作動薬（1％サンピロR）およびキサラタンRの後発品であるラタノプロスト「ケミファ」（LPケミファ），「センジュ」（LPセンジュ），「わかもと」（LPわかもと），「サワイ」（LPサワイ）の13剤を用いた．表1には本研究で用いた各種緑内障治療薬に含まれる添加物および保存剤の濃度を示す．これら点眼薬は製薬会社からの提供ではなく，市販のものを購入しており利益相反はない．3.緑内障治療薬による細胞処理法HCE-T（50×104個）をフラスコ（75cm2）内に播種し，80％に達するまで培養した3,4）．この細胞を，0.05％トリプシンにて?離し，細胞数を計測後，96穴プレートに100μl（1×104個）ずつ播種し，37℃，5％CO2インキュベーター内で24時間培養したものを実験に用いた．実際の操作法として，HCE-T細胞を0，10，20，30，60または120秒間薬剤にて処理後，PBS（リン酸緩衝液）にて2回洗浄し，各wellに表1各種緑内障治療薬に含まれる添加物緑内障治療薬添加物保存剤キサラタンRベンザルコニウム塩化物，等張化剤，無水リン酸一水素Na，リン酸二水素Na一水和物0.02％BACレスキュラRベンザルコニウム塩化物，ポリソルベート80，濃グリセリン，D-マンニトール，エデト酸ナトリウム水和物，pH調節剤0.005％BACトラバタンズRポリオキシエチレン硬化ヒマシ油40，プロピレングリコール，ホウ酸，D-ソルビトール，塩化亜鉛，pH調節剤2成分sofZiaTM（濃度非公開）タプロスRベンザルコニウム塩化物，ポリソルベート80，濃グリセリン，エデト酸Na水和物，リン酸二水素Na，pH調節剤0.001％BACチモプトールRベンザルコニウム塩化物液，水酸化Na，リン酸二水素Na，リン酸水素Na水和物0.005％BACトルソプトRベンザルコニウム塩化物液，ヒドロキシエチルセルロース，D-マンニトール，クエン酸ナトリウム水和物，塩酸0.005％BACデタントールRベンザルコニウム塩化物，濃グリセリン，ホウ酸，pH調節剤0.005％BACハイパジールRベンザルコニウム塩化物液，リン酸水素Na，リン酸二水素K，塩酸，塩化Na，0.002％BACサンピロRパラオキシ安息香酸プロピル（1），パラオキシ安息香酸メチル（2），クロロブタノール（3），酢酸Na水和物，pH調節剤，ホウ酸，ホウ砂，（1）0.014％（2）0.026％（3）0.2％LPケミファ濃ベンザルコニウム塩化物液50，塩化Na，リン酸二水素Na，リン酸水素Na水和物，ポリソルベート80，pH調節剤，エデト酸ナトリウム水和物BAC（濃度非公開）LPセンジュベンザルコニウム塩化物，塩化Na，リン酸二水素ナトリウム，リン酸水素ナトリウム水和物，塩酸，水酸化NaBAC（濃度非公開）LPわかもとベンザルコニウム塩化物，塩化Na，リン酸二水素Na，リン酸水素Na水和物，エデト酸ナトリウム水和物BAC（濃度非公開）LPサワイベンザルコニウム塩化物，塩酸，クエン酸，グリセリン，トロメタモール，ヒプロメロース，ポリソルベート80，D-マンニトールBAC（濃度非公開）サンピロRの保存剤濃度（1）～（3）は添加物中の（1）～（3）を示す．BAC：ベンザルコニウム塩化物．（113）あたらしい眼科Vol.28，No.9，20111333100μlの培地およびTetraColorONE（生化学社製）20μlを加え，37℃，5％CO2インキュベーター内で1時間処理後，マイクロプレートリーダー（BIO-RAD社製）にて490nmの吸光度（Abs）を測定した．本実験における細胞傷害はTetraColorONEを用い，テトラゾリウム塩が生細胞内ミトコンドリアのデヒドロゲナーゼにより生産されたホルマザンを測定することで表した．本研究では，薬剤処理後の細胞死亡率（％）を次式（1）により算出した．細胞死亡率（％）＝（Abs未処理?Abs薬剤処理）/Abs未処理×100（1）また，薬剤処理が細胞傷害へ与える影響をより詳細に検討すべく，次式（2）を用いて解析を行ったDt＝D∞･（1?e?kD･t）（2）kDは細胞傷害速度定数（min?1），tは点眼薬処理後の時間（0?2分），D∞およびDtは薬剤処理∞およびt分後の細胞死亡率を示す．本研究ではkD，D∞をそれぞれ急性毒性および慢性毒性として表した．II結果1.緑内障治療薬における角膜上皮細胞傷害性の比較図1にはPG点眼薬処理における細胞死亡率を示す．キサラタンR，レスキュラRおよびタプロスR処理群では処理時間の増加とともに細胞死亡率の増加が認められた．キサラタンR処理群において，0.5分処理後の細胞死亡率は88.7％であり，今回用いた緑内障治療薬のなかで最も強い細胞死亡率を示した．レスキュラRおよびタプロスR処理群では，キサラタンRと比較しその細胞死亡率は低いものの，0.5分処理後の細胞死亡率はそれぞれ41.2％，32.3％であった．一方，トラバタンズR処理群ではほとんど細胞傷害が認められず，2分処理後における細胞死亡率は1.6％であった．図2にはおもな緑内障治療薬処理時の細胞死亡率を示す．いずれの処理群においても処理時間の増加とともに細胞死亡率の増加が認められたが，PG点眼薬であるキサラタンR，レスキュラRおよびタプロスRと比較しその傷害性は低値を示した．今回用いたPG点眼薬を除く緑内障治療薬のなかで最も細胞死亡率が低かったのは炭酸脱水酵素阻害薬トルソプトRであり，その0.5分処理後の細胞死亡率は7％であった．表2および表3はPG点眼薬（表2）および他の作用機序を有する緑内障治療薬の慢性毒性（D∞）と急性毒性（kD）を示す．本実験で用いた代表的な緑内障治療薬の慢性毒性はキサラタンR≒デタントールR＞レスキュラR＞タプロスR＞チモプトールR＞ハイパジールR＞サンピロR＞トルソプトR＞トラバタンズRの順であり，急性毒性はキサラタンR＞レスキュラR＞タプロスR≒チモプトールR≒ハイパジールR≒サンピロR＞トルソプトR＞デタントールR≒トラバタンズRの順で低値を示表2プロスタグランジン点眼薬処理における角膜傷害性の比較キサラタンRレスキュラRトラバタンズRタプロスRkD（min?1）2.80±0.252.26±0.040.27±0.071.81±0.25D∞（％）101.5±6.661.1±0.33.9±0.356.8±2.6平均値±標準偏差，n＝4?5．表3各種緑内障治療薬処理における角膜傷害性の比較チモプトールRトルソプトRデタントールRハイパジールRサンピロRkD（min?1）1.78±0.061.27±0.030.29±0.031.77±0.091.77±0.01D∞（％）46.6±1.315.1±0.194.6±11.930.1±0.521.6±0.1平均値±標準偏差，n＝4?5．0204060801000.00.51.01.52.0処理時間（分）細胞死亡率（％）●：キサラタンR◆：レスキュラR▲：トラバタンズR■：タプロスR図1プロスタグランジン点眼薬処理によるHCE-T死亡率の変化平均値±標準誤差，n＝4?5．●：チモプトールR▲：トルソプトR▼：デタントールR◆：ハイパジールR■：サンピロR020406080100細胞死亡率（％）0.00.51.01.52.0処理時間（分）図2各種緑内障治療薬処理によるHCE-T死亡率の変化平均値±標準誤差，n＝4?5．1334あたらしい眼科Vol.28，No.9，2011（114）した．2.キサラタンRおよびその後発品における角膜上皮細胞傷害性の比較図3および表4はラタノプロスト点眼薬先発品（キサラタンR）と後発品処理における細胞死亡率（図3），点眼薬の細胞傷害性（表4）を示す．LPセンジュおよびLPわかもと処理群では，先発品であるキサラタンR処理群と比較し高い細胞死亡率を示した．この結果とは反対に，LPサワイおよびLPケミファ処理群では，キサラタンR処理群に比べその細胞死亡率は低値を示し，0.5分処理後の細胞死亡率はそれぞれ47.4％，16.1％であった．これらラタノプロスト点眼薬先発品および後発品の慢性毒性（D∞）はキサラタンR，LPケミファ，LPわかもとおよびLPセンジュでは同程度であったがLPサワイのみ有意に低値を示した．また，急性毒性（kD）はLPわかもと≒LPセンジュ＞キサラタンR＞LPサワイ＞LPケミファの順であった（表4）．III考按本研究では，現在臨床現場で多用されている緑内障治療薬処理時の細胞死亡率を測定するとともに，1次速度式を用いた細胞死亡率解析によるinvitro角膜上皮細胞傷害性評価を行った．Invitro角膜上皮細胞傷害性評価を行ううえで点眼薬処理時間の設定は重要である．Invivoでは一般的に点眼液は点眼後涙液により1/5まで希釈され，その後涙液として鼻涙管から排出されることが知られている5）．このように，invivoでは薬剤が長時間角膜に滞留しないことから，本実験のようなinvitro実験系では臨床（invivo）よりも短時間で強い細胞傷害性が認められる．したがって，本研究では点眼薬処理開始後2分を目安に実験を行い，点眼薬自身の角膜上皮細胞への傷害性評価を行った．本研究の結果から1次速度式を用いて解析することで，薬剤自身の有する慢性毒性（D∞）および急性毒性（kD）が算出でき，これら慢性および急性毒性が高いほど角膜傷害性が高くなることがわかった．そこでこの1次速度式を用い，臨床で第一選択として用いられるPG点眼薬キサラタンR，レスキュラR，トラバタンズRおよびタプロスRの角膜上皮細胞傷害性について評価を行った．PG点眼薬では慢性および急性毒性ともにキサラタンR＞レスキュラR＞タプロスR＞トラバタンズRの順であった（図1および表2）．点眼薬には品質の劣化を防ぐ目的で保存剤が添加されており，薬剤性角膜傷害には主薬のみでなくこの保存剤が強く関与する6）．なかでも保存剤ベンザルコニウム塩化物（BAC）は界面活性作用により細胞膜の浸透性を高め，膜破壊，細胞質の変性を起こすことで，高い角膜上皮細胞傷害性を有する7,8）．筆者らもまた本実験系にてBACが高い細胞傷害性を示すことを明らかとしている9）．今回用いたキサラタンR，レスキュラRおよびタプロスRいずれにおいても保存剤としてBACが用いられており，その濃度はそれぞれ0.02％，0.005％および0.001％であった．したがって，キサラタンR，レスキュラRおよびタプロスRの毒性強度の順は点眼薬中に含まれる主薬の傷害性とBAC濃度が関与するものと考えられる．一方，トラバタンズRはBAC非含有製剤であり，日本アルコン株式会社が特許を有するsofZiaTM（塩化亜鉛，ホウ酸を含むソルビトール緩衝剤保存システム）を保存剤として使用している．この保存剤はBACの高い角膜上皮細胞傷害性を避けるために考案されたものであり，トラバタンズRの毒性が他のPG点眼薬より低い主たる理由として，保存剤の違いが関与するものと考えられる．つぎに第2，3選択として，PG点眼薬とは作用機序の異なる点眼薬チモプトールR，トルソプトR，デタントールR，ハイパジールRおよびサンピロRを用い，角膜上皮細胞傷害性の検討を行った．いずれの処理群においても処理時間の増加とともに細胞死亡率の増加が認められ，その慢性毒性および保存剤はキサラタンR（0.02％BAC）≒デタントールR表4ラタノプロスト点眼薬先発品および後発品処理における角膜傷害性の比較先発品後発品キサラタンRLPケミファLPセンジュLPわかもとLPサワイkD（min?1）2.80±0.250.35±0.01＊12.27±2.49＊12.93±1.88＊2.37±0.21D∞（％）101.5±6.6100.2±3.396.3±2.497.7±1.765.1±3.5＊平均値±標準偏差，n＝4?5，＊p＜0.05vs.キサラタンR（Dunnettの多群間比較）．20406080100細胞死亡率（％）○：キサラタンR●：LPケミファ▲：LPセンジュ◆：LPわかもと■：LPサワイ0.00.51.01.52.0処理時間（分）図3ラタノプロスト点眼薬先発品および後発品処理によるHCE-T死亡率の変化平均値±標準誤差，n＝4?5．（115）あたらしい眼科Vol.28，No.9，20111335（0.005％BAC）＞レスキュラR（0.005％BAC）＞タプロスR（0.001％BAC）＞チモプトールR（0.005％BAC）＞ハイパジールR（0.002％BAC）＞サンピロR（パラベン類）＞トルソプトR（0.005％BAC）＞トラバタンズR（sofZiaTM）の順であった（表2および表3）．急性毒性においても慢性毒性と同様の順であったが，デタントールRでのみ他の点眼薬と比較し慢性毒性が高値を示し，急性毒性が低値を示した（表2および表3）．実際の臨床現場において，緑内障治療薬による角膜上皮細胞傷害はPG点眼薬やb遮断薬で高頻度にみられることはすでによく知られており10），筆者らが示したPG点眼薬が強い毒性を有すことと一致が認められた．b遮断薬であるチモプトールRのBAC濃度は0.005％であることから，チモプトールRの毒性は，BACと主薬であるチモロールマレイン酸塩がおもに関与するものと考えられる．デタントールRも高い慢性毒性を示したが，急性毒性は非常に低かった．デタントールRのBAC含有濃度は0.005％であり，添加物も一般的であることから，主薬であるブナゾシン塩酸塩がこの慢性および急性毒性に関わるものと考えられる．高い慢性毒性を有するデタントールRが臨床で高頻度に角膜傷害を示さないのは，急性毒性が低いことが関与するものと思われる．一方，ハイパジールR，サンピロR，トルソプトRの毒性は低かった．ハイパジールRはBAC濃度が0.002％と低く，サンピロRでは保存剤にパラベン類が用いられていた．サンピロRの保存剤であるパラベン類はBACと比較し角膜細胞にほとんど影響を与えないことはすでに報告されている10）．これらのことから，ハイパジールRおよびサンピロRの低傷害性はそれぞれBAC濃度，保存剤の種類の相違によるものと考えられる．トルソプトRでは保存剤として0.005％BACが用いられているものの，添加剤としてd-マンニトールが含まれていた．筆者らはこれまで添加物であるd-マンニトールがBACの傷害性を軽減することを明らかとしている9）．したがって，トルソプトRがハイパジールRよりBAC濃度が高いにもかかわらず，傷害性が低いことに，d-マンニトール含有の有無および主薬自身の毒性が起因するものと考えられる．最後に，多くの後発品が販売されているラタノプロストについてHCE-Tを用い角膜上皮細胞傷害性評価を行った．代表的なラタノプロスト後発品としてLPケミファ，LPセンジュ，LPわかもとおよびLPサワイの4品目について慢性毒性を検討した結果，LPケミファ，LPわかもとおよびLPセンジュでは同程度であったが，LPサワイのみ有意に低値を示した．急性毒性はLPわかもと≒LPセンジュ＞キサラタンR，LPサワイ＞LPケミファの順となり，LPわかもとおよびLPセンジュの2剤が先発品であるキサラタンRより高い毒性を示した（表4）．このLPわかもとおよびLPセンジュは先発品であるキサラタンと主薬は同じであり，添加物からもこれら後発品と先発品で大きな違いがみられないことから，製剤自身の急性毒性には添加物を加える順番など製剤過程での違いが影響すると考えられる．一方，先発品と比較しLPサワイは慢性毒性が，LPケミファでは急性毒性が有意に低かった．LPサワイではd-マンニトールが含まれており，BAC濃度も先発品の約半量と低値である．このBACおよび添加物がLPサワイの低い慢性毒性へと繋がっていると思われた．LPケミファのBAC濃度は非公開であるが，界面活性剤であるポリソルベート80が含まれることからBACの濃度は先発品より低いものと考えられる．しかし，LPケミファは他のラタノプロスト後発品と比較し，処理時間当たりの細胞死亡率が非常に低く，急性毒性も有意に低値であることから，BAC濃度だけでなく製剤過程でも他の工夫がなされている可能性がある．以上，本研究ではHCE-Tを用いた点眼薬の細胞死亡率を1次速度式にて解析することで，緑内障治療薬自身が有する急性および慢性毒性の算出が可能であることを明らかとした（図4）．慢性毒性が高く急性毒性の低い薬剤では，正常なオキュラーサーフェスではその傷害性はわずかであるが，ドライアイ患者などでは涙液低下や滞留の増加により急性毒性が高まる可能性が考えられる．したがって，これら薬剤の急性および慢性毒性を明らかとすることは非常に意義あるものと考えられる．これら角膜上皮細胞傷害性は，臨床においては涙液分泌能低下などの他の作用により相乗的に角膜上皮細胞傷害をひき起こすことから9），今回のinvitroの結果（角膜傷害強度および傷害速度の算出）を基盤とした臨床結果のさらなる解析は，緑内障患者の状態に合わせた薬剤決定をより容易にするために重要である．本報告は今後の点眼薬開発および緑内障治療薬投与時における薬物選択を決定するうえで一つの指標になるものと考えられる．LPサワイレスキュラR慢性毒性大小キサラタンRトラバタンズRLPケミファLPわかもとLPセンジュデタントールRタプロスRチモプトールRトルソプトRハイパジールRサンピロRLPケミファデタントールRトラバタンズRLPわかもとLPセンジュLPサワイ急性毒性レスキュラR大小キサラタンRタプロスRチモプトールRハイパジールRサンピロRトルソプトR図4各種緑内障治療薬の慢性および急性毒性強度1336あたらしい眼科Vol.28，No.9，2011文献1）徳田直人，青山裕美子，井上順ほか：抗緑内障薬が角膜に及ぼす影響：臨床とinvitroでの検討．聖マリアンナ医科大学雑誌32：339-356,20042）長井紀章，伊藤吉將，岡本紀夫ほか：抗緑内障点眼薬の角膜障害におけるInVitroスクリーニング試験：SV40不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T）を用いた細胞増殖抑制作用の比較．あたらしい眼科25：553-556,20083）ToropainenE,RantaVP,TalvitieAetal：Culturemodelofhumancornealepitheliumforpredictionofoculardrugabsorption.InvestOphthalmolVisSci42：2942-2948,20014）TalianaL,EvansMD,DimitrijevichSDetal：Theinfluenceofstromalcontractioninawoundmodelsystemoncornealepithelialstratification.InvestOphthalmolVisSci42：81-89,20015）後藤浩，吉川啓司，山田昌和ほか：眼科開業医のための疑問・難問解決策．p216-217，診断と治療社，20066）NagaiN,MuraoT,OkamotoNetal：Comparisonofcornealwoundhealingratesafterinstillationofcommerciallyavailablelatanoprostandtravoprostinratdebridedcornealepithelium.JOleoSci59：135-141,20107）河嶋洋一：防腐剤の功罪（使い捨て点眼薬を含む），点眼薬の使い方．眼科診療プラクティス42，p86-87，文光堂，19998）DeSaintJeanM,BrignoleF,BringuierAFetal：EffectsofbenzalkoniumchlorideongrowthandsurvivalofChangconjunctivalcells.InvestOphthalmolVisSci40：619-630,19999）長井紀章，村尾卓俊，大江恭平ほか：不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T）を用いた緑内障治療配合剤のinvitro角膜細胞傷害性評価．YAKUGAKUZASSHI131：985-991,201110）青山裕美子：緑内障の薬物治療-抗緑内障点眼薬と角膜．FrontiersinGlaucoma4：132-147,2003（116）＊＊＊

培養ヒト角膜上皮細胞におけるジクアホソルナトリウムの膜結合型ムチン遺伝子の発現促進作用

admin — Wed, 30 Mar 2011 15:26:50 +0000

0910-1810/11/\100/頁/JCOPY（117）425《原著》あたらしい眼科28（3）：425.429，2011cはじめにドライアイ患者の眼表面では，涙液の分泌低下あるいは蒸発亢進により，涙液3層（水層・ムチン層・油層）構造が崩れ，涙液層の安定性の低下が認められている．涙液層は，水層だけでなく，油層およびムチン層の働きによってその表面張力が下げられることで安定化している．なかでも，ムチン層は，粘性の高い分泌型ムチンと角結膜上皮の表面に発現している膜結合型ムチンが相互に作用し，水層の眼表面への広がりおよび保持に貢献している1）．これまでに，眼表面上皮の膜結合型ムチンとして，蛋白質の発現が確認されているのは，MUC1，MUC4およびMUC16であり，ドライアイ治療を考えるうえで，これら3〔別刷請求先〕七條優子：〒630-0101生駒市高山町8916-16参天製薬株式会社研究開発センターReprintrequests：YukoTakaoka-Shichijo,Research&DevelopmentCenter,SantenPharmaceuticalCo.,Ltd.,8916-16Takayamacho,Ikoma,Nara630-0101,JAPAN培養ヒト角膜上皮細胞におけるジクアホソルナトリウムの膜結合型ムチン遺伝子の発現促進作用七條優子中村雅胤参天製薬株式会社研究開発センターStimulatoryEffectofDiquafosolTetrasodiumontheExpressionofMembrane-BindingMucinGenesinCulturedHumanCornealEpithelialCellsYukoTakaoka-ShichijoandMasatsuguNakamuraResearch&DevelopmentCenter,SantenPharmaceuticalCo.,Ltd.SV40不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T）における膜結合型ムチン遺伝子（MUC1，MUC4およびMUC16）の発現に及ぼすP2Y2受容体作動薬であるジクアホソルナトリウムの影響について定量的real-timepolymerasechainreaction（RT-PCR）法を用いて検討した．その結果，HCE-Tに100μMジクアホソルナトリウムを処理することにより，MUC1，MUC4およびMUC16，いずれの遺伝子の発現量も，添加3時間後には一過性に上昇し，その後定常レベルまで減少した．MUC1，MUC4およびMUC16において，添加3時間後の各遺伝子発現促進作用は，無処置群に比べていずれも有意であった．また，ジクアホソルナトリウムは，濃度依存的にMUC1，MUC4およびMUC16の遺伝子発現を促進し，100μMジクアホソルナトリムによるMUC1，MUC4およびMUC16の促進作用は，薬剤無添加群に比べて有意であった．以上から，ジクアホソルナトリウムは，角膜上皮細胞における膜結合型ムチンの遺伝子発現を促進させることが明らかとなった．ThisstudyinvestigatedtheeffectoftheP2Y2receptoragonistdiquafosoltetrasodiumontheexpressionofmembrane-bindingmucingenes（MUC1,MUC4andMUC16）inSV-40-immortalizedhumancornealepithelialcells（HCE-T）,usingthequantitativereal-timepolymerasechainreaction（RT-PCR）method.GeneexpressionofMUC1,MUC4andMUC16increasedtransientlywith100μMdiquafosoltetrasodiumfor3h,thendecreasedaswellasconstitutivelevel.ThisenhancementofMUC1,MUC4andMUC16geneexpressionat3hwassignificantlydifferentfromthatseenintheno-treatmentgroup.DiquafosoltetrasodiumincreasedgeneexpressionofMUC1,MUC4andMUC16inaconcentration-dependentmanner,thestimulatoryeffectsofmucingeneexpressionby100μMdiquafosoltetrasodiumdifferingsignificantlyfromthoseseeninthevehicle-onlygroup.Theseresultsrevealedthatdiquafosoltetrasodiumstimulatesgeneexpressionofmembrane-bindingmucininhumancornealepithelialcells.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）28（3）：425.429,2011〕Keywords：ジクアホソルナトリウム，P2Y2受容体作動薬，膜結合型ムチン遺伝子，ヒト角膜上皮細胞．diquafosoltetrasodium,P2Y2receptoragonist,membrane-bindingmucingenes,humancornealepithelialcells.426あたらしい眼科Vol.28，No.3，2011（118）種の膜結合型ムチンの眼表面への発現亢進について関心が高まっている2）．ドライアイ治療薬の一つで，P2Y2受容体作動薬であるジクアホソルナトリウムは，結膜上皮組織，特に杯細胞からの分泌型ムチンの分泌を促進することが報告されている3,4）．一方，ジクアホソルナトリウムの角結膜上皮における膜結合型ムチンの発現に対する作用については明らかにされていない．そこで今回，培養ヒト角膜上皮細胞を用いて，これら膜結合型ムチン（MUC1，MUC4およびMUC16）の発現に及ぼすジクアホソルナトリウムの影響について検討した．I実験方法1.細胞SV40不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T，RCBNo.2280：理化学研究所より供与）は，培養培地〔15％ウシ血清（FBS），5μg/mLinsulin，10ng/mLhumanEGF，40μg/mLgentamicinを含むDMEM/F-12〕にて培養，継代維持した．HCE-Tは，75cm2フラスコ内に播種し，サブコンフルエントまで培養培地にて培養し，0.05％トリプシン.0.53mMEDTAにて.離し，培養培地に回収した．回収した細胞を24穴プレートの各穴に1mL（2.0×104/well）ずつ播種し，37℃，5％CO2インキュベーター内でコンフルエントまで培養した．その後，培養培地を除去し，DMEM/F-12培地に交換し，CO2インキュベーター（37℃，5％CO2）内で24時間培養した．その後，DMEM/F-12培地に溶解した種々濃度のジクアホソルナトリウム（ジクアホソル：ヤマサ醤油）を一定時間処理をした．2.総RNA抽出およびreal.timepolymerasechainreaction（RT.PCR）反応HCE-Tの総RNAの抽出は，RNeasyProtectCellminikit（QIAGEN）を使用し，製造元推奨プロトコールに従い行った．MUC1，MUC16およびGAPDH（グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素）遺伝子には，50ngの総RNA，MUC4遺伝子には，100ngを用い，QuantiFastSYBRGreenRT-PCRKit（QIAGEN）を使用し，逆転写反応により，初期cDNA合成後，引き続きRT-PCRを行った．PCRには，宝酒造が設計した各種プライマー（表1）1μMを用いて，40サイクル〔50℃：10分，95℃：5分，95℃：10秒.60℃：30秒（40サイクル），95℃：15秒，65℃：1分〕の条件でABIPrism7500FastReal-TimePCRSystemにて増幅させた．3.解析a.相対定量解析検量線用あるいは未知サンプルのPCR増幅産物がある一定量に達したときのサイクル数（thresholdcycle：Ct値）を求め，Ct値と初期cDNA量間の相関式にて，未知サンプル中のcDNA量を算出した．GAPDHの遺伝子発現量により各膜結合型ムチン遺伝子の発現量を補正して相対的に定量化した．最終的に同条件下の薬剤無添加群に対する相対比で表した．b.統計解析EXSAS（アーム）を用いて，時間的変化の検討では，各処理時間におけるジクアホソルの効果を無処理（0時間処理）群に対するDunnettの多重比較検定法，濃度依存性の検討では，薬剤無添加群に対するDunnettの多重比較検定法にて，5％を有意水準として解析した．II結果1.PCR産物の確認HCE-T由来のmRNA（50ng，MUC4に限り100ng）を各種プライマーおよびQuantiFastSYBRGreenRT-PCRKitを用いて増幅させた各種ムチン遺伝子産物の電気泳動像を図1に示す．各種ムチン遺伝子産物（MUC1，MUC4およびMUC16）は，1本のバンドとして増幅され，サイズも予測値と一致しており，良好な増幅条件での反応であると判断できた．表1各種プライマープライマー名配列サイズTakaraPrimersetIDMUC1forwardprimerCCGGGATACCTACCATCCTATGAG124bpHA138064MUC1reverseprimerGCTGCTGCCACCATTACCTGMUC4forwardprimerGAAGACGTGCGCGATGTGA73bpHA057958MUC4reverseprimerCCTTGTAGCCATCGCATCTGAAMUC16forwardprimerCTGCAGAACTTCACCCTGGACA121bpHA125114MUC16reverseprimerCCAAGCCGATGAGGATGACAGAPDHforwardprimerGCACCGTCAAGGCTGAGAAC138bpHA067812GAPDHreverseprimerTGGTGAAGACGCCAGTGGA（119）あたらしい眼科Vol.28，No.3，20114272.MUC1遺伝子発現量最初に，ジクアホソルのHCE-TにおけるMUC1遺伝子発現に対する作用を検討した．図2に示すように，MUC1遺伝子の発現量は，100μMジクアホソルの添加により，添加3時間後に薬剤無添加群に比して約1.5倍に増加し，無処理群に比して有意であった．その後定常レベルまで減少した．また，ジクアホソルの添加3時間後のMUC1遺伝子の発現量は，濃度依存的に増加し，100μMでは，薬剤無添加群に比して有意であった．3.MUC4遺伝子発現量次に，ジクアホソルのHCE-TにおけるMUC4遺伝子発現に対する作用を検討した．基礎検討により増幅効率がMUC1あるいはMUC16に比して低かったので，2倍量の総RNAを用いた．図3に示すように，MUC4遺伝子の発現量は，100μMジクアホソルの添加により，添加3時間後に薬剤無添加群に比して一過性に約2倍まで増加し，無処理群に比して有意であった．その後，定常レベルまで減少した．また，ジクアホソルの添加3時間後のMUC4遺伝子の発現量も，濃度依存的に増加し，100μMでは，薬剤無添加群に比して有意であった．4.MUC16遺伝子発現量図4にジクアホソルのHCE-TにおけるMUC16遺伝子発現に対する作用を示す．MUC16遺伝子の発現量は，100μMジクアホソルの添加により，添加3時間後に薬剤無添加群に比して一過性に約2.5倍まで増加し，無処理群に比して有意であった．その後，定常レベルまで減少した．また，ジクアホソルの添加3時間後のMUC16遺伝子の発現量は，MUC1およびMUC4と同様，濃度依存的に増加し，100μMでは，薬剤無添加群に比して有意であった．III考按眼表面での蛋白質発現が認められている膜結合型ムチン，MUC1，MUC4およびMUC16は，細胞内ドメインと多量の糖鎖をもつ高分子蛋白質の細胞外ドメインより成る．これらムチンの細胞外ドメインは，3種間に若干の構造上の差異はあるものの，その機能は類似しており，親水性の糖鎖による保潤・保水効果，非接着分子機能による閉瞼時の眼瞼結膜上皮と角膜上皮の癒着防止効果，分泌型ムチンとの糖衣バリアーの形成による感染防御効果およびローズベンガル染色液に対しての拡散障壁効果などを担っており，眼表面から膜結合型ムチンが欠乏することは，ドライアイの発症および悪化をもたらすと考えられている2）．今回，ジクアホソルが，培養ヒト角膜上皮細胞において，MUC1，MUC4およびMUC16，いずれの膜結合型ムチン遺伝子の発現を亢進する123451,000bp500bp200bp100bp図1各種プライマーを用いたPCR増幅産物の電気泳動パターンレーン1：マーカー，レーン2：MUC1（124bp），レーン3：MUC4（73bp），レーン4：MUC16（121bp），レーン5：GAPDH（138bp）．ab01230110100ジクアホソル（μM）MUC1遺伝子発現量（薬剤無添加群に対する相対比）＊＊01230361224培養時間（時間）MUC1遺伝子発現量（薬剤無添加群に対する相対比）＊＊図2ジクアホソルのHCE.TにおけるMUC1mRNA発現促進作用各値は，薬剤無添加群に対する比率として算出した．a：100μMジクアホソル溶液を処理．各値は4例の平均値±標準誤差を示す．＊＊：p＜0.01，無処理（0時間処理）群との比較（Dunnettの多重比較検定）．b：各濃度のジクアホソル溶液を3時間処理．各値は4例の平均値±標準誤差を示す．＊＊：p＜0.01，薬剤無添加（0μMジクアホソル）群との比較（Dunnettの多重比較検定）．428あたらしい眼科Vol.28，No.3，2011（120）ことを明らかにした．ジクアホソルは，2つのヌクレオチドから成る分子量約880の化合物である．成長因子などの生理活性物質が眼表面に作用を示すinvitroとinvivoの濃度差は100.1,000倍であるという報告5）を参考に，今回（invitro）の膜結合型ムチン遺伝子の発現亢進を示す濃度（100μM）を，実際の臨床（invivo）で効果を発現すると考えられる濃度に換算すると0.88.8.8％（10.100mM）となる．ラット眼窩外涙腺摘出ドライアイモデルでのジクアホソルの角膜上皮障害改善作用は1％（11mM）で最大効果を示すこと4）から，今回の得られたinvitroの濃度は実際のinvivoでの効果にも十分反映しているものと考えられ，臨床的にも1％以上のジクアホソル濃度であれば臨床効果に寄与するものと考えられた．横井6）は，ドライアイの病態の構築は，涙液層および角結膜上皮層異常の慢性化，すなわち①瞬目の摩擦，②涙液の減少，③涙液の安定性の低下，④炎症および⑤涙液動態の障害にあるとしている．これらリスクファクターへの治療の切り口として，②に対しては，涙液の分泌を促進するあるいは眼表面の水分量を増加させること，③に対しては，涙液3層の質あるいは量を正常化すること，④に対しては，原因となるリスクファクター（マイボーム腺機能不全症，Sjogren症候群，アレルギー性結膜炎あるいは感染による炎症など）を看破することあるいは涙液の浸透圧を正常化することをあげている．また，①に対しては，摩擦の原因と考えられる眼表面の凹凸を減少させるための外科的治療に加え，角結膜の癒着を減少させる潤滑作用を示すムチン層の正常化を目的にした治療がなされている7）．現在，ドライアイの治療には，人工涙液あるいはヒアルロン酸ナトリウム点眼液が用いられている．人工涙液は，涙液の減少に対して一時的な水分補給あるいは一部涙液のクリアランスを促進するウォッシュアウト（上記②，⑤に対する治療）に，ヒアルロン酸ナトリウム点眼液は，角結膜上皮障害改善作用に加えて，涙液の減少に対する水分補給あるいはその三次構造に基づく保水性による涙液層の安定化作用（上記01230110100ジクアホソル（μM）MUC4遺伝子発現量（薬剤無添加群に対する相対比）＊01230361224培養時間（時間）MUC4遺伝子発現量（薬剤無添加群に対する相対比）＊ab図3ジクアホソルのHCE.TにおけるMUC4mRNA発現促進作用各値は，薬剤無添加群に対する比率として算出した．a：100μMジクアホソル溶液を処理．各値は，3あるいは4例の平均値±標準誤差を示す．＊：p＜0.05，無処理（0時間処理）群との比較（Dunnettの多重比較検定）．b：各濃度のジクアホソル溶液を3時間処理．各値は4例の平均値±標準誤差を示す．＊：p＜0.05，薬剤無添加（0μMジクアホソル）群との比較（Dunnettの多重比較検定）．012340361224培養時間（時間）MUC16遺伝子発現量（薬剤無添加群に対する相対比）＊＊012340110100ジクアホソル（μM）MUC16遺伝子発現量（薬剤無添加群に対する相対比）＊＊ab図4ジクアホソルのHCE.TにおけるMUC16mRNA発現促進作用各値は，薬剤無添加群に対する比率として算出した．a：100μMジクアホソル溶液を処理．各値は，3あるいは4例の平均値±標準誤差を示す．＊＊：p＜0.01，無処理（0時間処理）群との比較（Dunnettの多重比較検定）．b：各濃度のジクアホソル溶液を3時間処理．各値は4例の平均値±標準誤差を示す．＊＊：p＜0.01，薬剤無添加（0μMジクアホソル）群との比較（Dunnettの多重比較検定）．（121）あたらしい眼科Vol.28，No.3，2011429②，③に対する治療）に期待されている．しかし，これら治療に対しても十分な効果が得られない症例もある．ジクアホソルは，これまでに報告されている涙液の分泌促進作用4,8,9），分泌型ムチンの分泌促進作用3,4）に加えて，今回新たに膜結合型ムチンの発現促進作用を有する可能性が示唆された．このことは，ジクアホソルを含む点眼液が上記②，③ばかりでなく，非接着分子による摩擦の低下作用あるいは感染源の眼表面への侵入防止作用により①あるいは④のリスクファクターに対しても治療効果をもたらすと考えられる．今後，さらに細胞膜上の蛋白質発現量に及ぼす影響を検討する必要があるものの，今回の結果は，ジクアホソルが，分泌型ムチンの分泌促進作用3,4）だけでなく，膜結合型ムチンの角結膜上皮細胞上の蛋白質発現を促進している可能性を示唆している．したがって，ジクアホソル点眼液は，既存薬では，十分効果を示さない症例に対して有効性を示す可能性が考えられ，ドライアイ患者に対する有用な新しい治療剤として期待される．文献1）渡辺仁：ムチン層の障害とその治療．あたらしい眼科14：1647-1633,19972）GovindarajanB,GipsonIK：Membrane-tetheredmucinshavemultiplefunctionsontheocularsurface.ExpEyeRes90：655-663,20103）FujiharaT,MurakamiT,NaganoTetal：INS365suppresseslossofcornealepithelialintegritybysecretionofmucin-likeglycoproteininarabbitshort-termdryeyemodel.JOculPharmacolTher18：363-370,20024）FujiharaT,MurakamiT,FujitaHetal：ImprovementofcornealbarrierfunctionbytheP2Y（2）agonistINS365inaratdryeyemodel.InvestOphthalmolVisSci42：96-100,20015）SotozonoC,InatomiT,NakamuraMetal：Keratinocytegrowthfactoracceleratescornealepithelialwoundhealinginvivo.InvestOphthalmolVisSci36：1524-1529,19956）横井則彦：ドライアイ．あたらしい眼科25：291-296,20087）加冶優一，横井則彦，大鹿哲郎：結膜疾患とドライアイ．あたらしい眼科22：317-322,20058）YerxaBR,DouglassJG,ElenaPPetal：PotencyanddurationofactionofsyntheticP2Y2receptoragonistsonSchirmerscoresinrabbits.AdvExpMedBiol506：261-265,20029）MurakamiT,FujitaH,FujiharaTetal：Novelnoninvasivesensitivedeterminationoftearvolumechangesinnormalcats.OphthalmicRes34：371-374,2002＊＊＊