ホウ酸含有点眼剤組成の抗菌メカニズム

admin — Fri, 30 Apr 2010 10:30:03 +0000

———————————————————————-Page1518あたらしい眼科Vol.27，No.4，2010（00）518（102）0910-1810/10/\100/頁/JCOPY46回日本眼感染症学会原著》あたらしい眼科27（4）：518522，2010cはじめに防腐剤は，製剤の無菌性維持や開封後の微生物の二次汚染防止を目的として広く用いられている．一般用点眼剤では，塩化ベンザルコニウムやグルコン酸クロルヘキシジン，パラベンなどの抗菌剤が防腐剤として用いられている．これら防腐剤のうち，塩化ベンザルコニウムは，正常な涙液動態を示す場合，通常の用法・用量の範囲ではほとんど影響を与えないが，頻回点眼や長期点眼により，角膜・結膜へのダメージや涙液動態の悪化を生じる可能性が指摘されている13）．これらの課題を解決するため，筆者らは，塩化ベンザルコニウムなどの防腐剤を使用しなくても，保存効力を発揮する技術を確保するため，抗菌剤やキレート剤，緩衝剤，安定剤などの点眼剤に配合可能な成分の抗菌効果を検討した．その結果，緩衝剤であるトロメタモール，ホウ酸およびキレート剤〔別刷請求先〕片岡伸介：〒256-0811小田原市田島100ライオン株式会社研究開発本部生命科学研究所Reprintrequests：ShinsukeKataoka,LionCorporation,LifeScienceResearchLaboratories,ResearchandDevelopmentHeadquarters,100Tajima,Odawara,Kanagawa256-0811,JAPANホウ酸含有点眼剤組成の抗菌メカニズム瀧沢岳＊1片岡伸介＊1小高明人＊1小池大介＊1服部学＊1海老原伸行＊2村上晶＊2＊1ライオン株式会社研究開発本部＊2順天堂大学医学部眼科学教室AntimicrobialActivitiesandMechanismsofNewCompositionforEyedropsContainingBorateTakeshiTakizawa1）,ShinsukeKataoka1）,AkitoOdaka1）,DaisukeKoike1）,ManabuHattori1）,NobuyukiEbihara2）andAkiraMurakami2）1）LionCorporation,ResearchandDevelopmentHeadquarters,2）DepartmentofOphthalmology,JuntendoUniversitySchoolofMedicine一般用点眼剤において防腐剤として使用されている塩化ベンザルコニウムは，頻回点眼・長期点眼により，角膜にダメージを与える可能性が指摘されている．筆者らは，既存の防腐剤を含まなくても保存効力を発揮する点眼剤組成を検討したところ，緩衝剤や安定剤として用いられるトロメタモール（トリス）・ホウ酸・EDTA（エチレンジアミン四酢酸）を一定比率で混合した組成が優れた抗菌効果を示すことを見出した．この抗菌効果の作用機序について解析したところ，本組成は，細菌・真菌に対して相乗的な増殖抑制効果（静菌効果）を示すこと，また，細菌の遺伝子合成や蛋白質合成に必須となるアミノアシルtRNA合成酵素を阻害していることを明らかにした．本組成が有する細菌および真菌に対する幅広い静菌効果は，点眼剤の保存効力組成としてだけでなく，近年問題視されているコンタクトレンズに対するカチオン性殺菌剤の吸着と，それにより生じる角膜障害に対して有用な手段の一つになると考えている．Benzalkoniumchloride（BAC）,usedasanophthalmicpreservativeineyedrops,hasbeenshowntocausedam-agetothecorneaandconjunctivawithlong-termorfrequentuse.Wefoundthataneyedropcompositioncontain-ingtris-hydroxylmethyl-aminomethane（Tris）,borateandethylendiaminetetraaceticacid（TBE）hadbroad-spec-trumantimicrobialactivitywithoutpreservatives.Analysisoftheactivitydemonstratedthatthroughthecombinationofthevariousingredients,TBEhadsynergisticactivitiesagainstbacteriaandfungi.Moreover,TBEsuppressedDNAbiosynthesisandaminoacyl-tRNAsynthetaseactivity,whichplaycentralrolesinproteinbiosyn-thesisinbacteria.TheseresultssuggestthatTBEwouldbeausefulcompositionnotonlyforeyedropswithoutpreservatives,butalsoasapreventiveagentforcornealdisordercausedbycontactlensadsorptionofcationicsur-factant.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）27（4）：518522,2010〕Keywords：防腐剤，抗菌効果，トロメタモール，ホウ酸，EDTA．preservative,antimicrobialactivity,tris-hydroxylmethyl-aminomethane（Tris）,borate,EDTA.———————————————————————-Page2あたらしい眼科Vol.27，No.4，2010519（103）（安定剤）であるEDTA（エチレンジアミン四酢酸）を一定比率で混合することによって高い抗菌作用を発揮することを新たに見出した．今回，筆者らは，本組成の抗菌作用機序を検討したので報告する．I実験材料および方法1.試験菌日本薬局方の点眼剤保存効力試験に指定される試験菌種であるEscherichiacoliNBRC3972,PseudomonasaeruginosaNBRC13725,StaphylococcusaureusNBRC13276,CandidaalbicansNBRC1594,AspergillusnigerNBRC9455を（独）製品評価技術基盤機構より入手し，本研究の試験菌として用いた．2.方法薬剤の抗菌力を評価するために，各試験菌の生存曲線の作成，最小発育阻止濃度（MIC）測定および顕微鏡による形態観察を行った．評価薬剤は，トロメタモール（1.0mg/ml）・ホウ酸（10mg/ml）・EDTA（1.0mg/ml）の混合組成（以下，TBE），点眼剤の防腐剤として用いられている塩化ベンザルコニウム，グルコン酸クロルへキシジンおよび保存剤であるソルビン酸カリウム（ともに和光純薬）を用いた．なお，生存曲線の検討においては，各薬剤の抗菌・殺菌活性を比較するため，塩化ベンザルコニウム，グルコン酸クロルへキシジンおよびソルビン酸カリウムの濃度を，点眼剤で使用される510倍である500ppmに設定して実験に用いた．生菌数測定は，寒天平板法により行った．培地はソイビーン・カゼインダイジェスト（SCD）培地（細菌用）およびグルコース・ペプトン（GP）培地（真菌用）を使用した（ともに日本製薬）．試験菌の前培養液を接種後32.5℃で静置培養し（A.nigerのみ22.5℃で培養），経時的に菌液を採取し，生菌数（colonyformationunit：CFU）を測定した．MIC測定は，日本化学療法学会標準法である微量液体希釈法4）に準拠した．各試験菌を，TBEを含むMuller-Hinton培地（DIFCO），またはGP培地にて35℃で24時間静置培養後，試験菌の発育を阻止する最小薬剤濃度を算出した．発育陽性の判定基準は肉眼的に混濁または1mm以上の沈殿が認められた場合とし，発育阻止の判定基準は，肉眼的に混濁または沈殿が認められない場合とした．また，発育阻止が認められた薬剤濃度において，寒天平板法にて生菌の有無から最小殺菌濃度の判定を行った．TBE含有培地中の試験菌の形態は，TBE処理24時間後，菌体を2.5％グルタールアルデヒドにより固定化し，エタノール脱水および臨界点乾燥（日立）を行い，走査型電子顕微鏡（SEM,日立）により観察した〔A.nigerのみ光学顕微鏡（オリンパス）で観察した〕．菌体内のホウ酸濃度測定は，10mg/mlホウ酸を含む生理食塩水（大塚製薬）に試験菌をOD660＝1.0となるように加え，一定時間薬剤曝露後，煮沸によって菌体細胞質画分を調製し，誘導結合プラズマ質量分析装置（ICP-MS,アプライドバイオシステムズ）を用いて，画分中のホウ酸を定量した．DNA生合成能評価は，［3H］-チミジン（アマシャム）を添加した薬剤含有培地にて，試験菌を32.5℃で静置培養し，経時的に採取した菌液の放射活性をシンチレーションカウン0127024681012Log10CFU/ml培養日数（day）培養日数（day）培養日数（day）培養日数（day）培養日数（day）0127024681012Log10CFU/ml0127024681012Log10CFU/ml0127024681012Log10CFU/ml0127024681012Log10CFU/mlacebd図1薬剤存在下における試験菌の生存曲線a：E.coli，b：P.aeruginosa，c：S.aureus，d：C.albicans，e：A.niger．：control：ソルビン酸：TBE：塩化ベンザルコニウム：グルコン酸クロルへキシジン———————————————————————-Page3520あたらしい眼科Vol.27，No.4，2010（104）ター（アロカ）により測定し，被検菌の［3H］-チミジン取り込み量を測定した．アミノアシルtRNA合成活性評価は，E.coli由来アミノアシルtRNA合成酵素（Sigma），［14C］-リシン（アマシャム）およびtRNA（Sigma）を評価薬剤存在下で反応させ，合成される［14C］-リシン-tRNA複合体量についてシンチレーションカウンターを用いて測定した．3.統計解析菌体内のホウ酸濃度の解析は，Tukey-Kramertest（Yukms，StatLight）により行った．II結果1.薬剤存在下における試験菌の生存曲線TBE，塩化ベンザルコニウム（500ppm），グルコン酸クロルヘキシジン（500ppm）を各々添加した栄養培地で試験菌を培養した．その結果，殺菌剤の塩化ベンザルコニウムおよびグルコン酸クロルヘキシジン存在下では，培養開始24時間後にすべての菌が検出限界以下となった．これに対しTBE存在下では，E.coli，P.aeruginosa，S.aureus，C.albicans，の4菌の生菌数は24時間後に初発菌数の10％，1週間後に0.10.01％まで減少し，A.nigerの生菌数は1週間後に約10％に減少した（図1）．2.薬剤の最小発育阻止濃度（MIC）比較TBE各成分のうち，ホウ酸は単独でも試験菌5菌に対し，弱い発育阻害効果が認められた．また，EDTAは細菌に対し弱い発育阻害効果を示した．トロメタモールの発育阻害効果は5菌種ともに認められなかった．これに対し，TBE混合系では，試験菌5菌に対し，TBE各成分単独の場合よりも低い濃度で発育阻害効果を示し，抗菌力の向上が認められ表1薬剤の各試験菌発育に対する最小阻害濃度（MIC）試験菌MIC（mg/ml）単成分系混合系（トロメタモール：ホウ酸：EDTA＝1：10：1）トロメタモールホウ酸EDTAトロメタモールホウ酸EDTAE.coli＞3220160.55.00.5P.aeruginosa＞3220160.55.00.5S.aureus＞3210160.55.00.5C.albicans＞325＞320.0630.630.063A.niger＞322.5＞320.0320.320.032abcdeTBEなしTBEあり図2薬剤存在下における試験菌の顕微鏡写真a：E.coli，b：P.aeruginosa，c：S.aureus（SEM×10,000），d：C.albicans（SEM×5,000），e：A.niger（microscopy×600）．———————————————————————-Page4あたらしい眼科Vol.27，No.4，2010521（105）た（表1）．また，TBEの最小殺菌濃度（MBC）を測定した結果，ホウ酸の飽和濃度付近（50mg/ml）まで上昇させても，試験菌5菌の死滅は認められなかった．3.薬剤存在下での菌体形態TBE存在下において，各細菌ともに増殖および凝集能の低下が認められ，P.aeruginosaでは伸長抑制が観察された．また，C.albicansは菌糸形で病原性を示す5）が，TBEはこの菌糸形成を抑制し，また，A.nigerでは胞子の発芽が抑制されていた（図2）．4.ホウ酸の菌体内流入量E.coli，P.aeruginosaおよびS.aureusの3菌種ともに，細胞質画分からホウ酸が検出された．また，ホウ酸の流入速度はトロメタモール・EDTAを併用した場合，3菌種ともホウ酸単独条件あるいは2成分混合条件下よりも細胞質内ホウ酸量の有意な増加が認められた（p＜0.01）（図3）．5.細菌遺伝子合成能に対する薬剤の影響DNA生合成能を評価したところ，指標とした［3H］-チミジンの取り込み量は，TBE存在下では，3菌種ともにDNA合成阻害剤であるシプロフロキサシン塩酸塩（和光純薬）と同レベルまで低下し，培養開始36時間後には［3H］-チミジンの取り込みが停止していた（図4）．6.アミノアシルtRNA合成酵素に対する薬剤の影響E.coli由来アミノアシルtRNA合成酵素活性に対する放散の影響を検討したところ，本酵素活性は，ホウ酸濃度依存的に低下することが確認された（図5）．III考察今回検討したトロメタモール・ホウ酸・EDTAの混合組成（TBE）の各成分は，一般用点眼剤においては，通常，緩衝剤や安定剤として用いられているが，その配合量を調整することにより，細菌および真菌の増殖を抑制することが明らかとなった．増殖曲線の解析から，TBEは一般用点眼剤の防0.00.51.01.52.02.5B＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊B＋ET＋BTBEホウ酸量（pg/CFU）0.00.20.40.60.81.01.2BB＋ET＋BTBEホウ酸量（pg/CFU）0.00.20.40.60.81.01.2BB＋ET＋BTBEホウ酸量（pg/CFU）abc図3薬剤処理15分後の菌体内ホウ酸濃度a：E.coli，b：P.aeruginosa，c：S.aureus．T：0.1％トロメタモール，B：1.0％ホウ酸，E：0.1％EDTA．＊：p＜0.05,＊＊：p＜0.01（Tukey-Kramer）05010015020025030035000.511.52ホウ酸濃度（）Lysyl-tRNA合成酵素活性（units/mgprotein）図5ホウ酸のアミノアシルtRNA合成酵素阻害活性3H×1,000dpm）［3H］-チミジン取込量（×1,000dpm）［3H］-チミジン取込量（×1,000dpm）培養時間（hr）02040608010004812162024培養時間（hr）04812162024培養時間（hr）04812162024abc010203040020406080100120図4薬剤存在下における細菌の［3H］チミジン取込量a：E.coli，b：P.aeruginosa，c：S.aureus．◇：control，□：TBE，△：シプロフロキサシン（10ppm）．———————————————————————-Page5522あたらしい眼科Vol.27，No.4，2010（106）腐剤として使用される塩化ベンザルコニウムのように速やかに菌を死滅させるのではなく，菌の生菌数を徐々に減少させる特徴を示すことが明らかとなった（図1）．また，TBE各成分濃度をホウ酸の飽和濃度である5倍濃度まで高めた場合において同様の検討を行ったが，増殖抑制効果は高まるものの菌を死滅させるには至らないことが明らかとなった（Datanotshown）．これらの結果から，TBEは，殺菌剤が示す殺菌作用ではなく，静菌作用によって細菌および真菌の増殖を抑制していると考えられた．つぎに，TBE各成分の細菌および真菌増殖に対する影響を明らかにするため，各成分のMICを検討した．各成分単独の場合と比較して，TBEでは，細菌および真菌の発育抑制効果が相乗的に高まること，特に真菌に対してその傾向が顕著になることを明らかにした（表1）．TBE各成分のうち，ホウ酸は細菌および真菌に対して，また，EDTAは細菌に対してそれぞれ発育抑制効果を有することが確認されたが，その効果は弱いものであった．これらの結果から，TBEにおける静菌作用の主たる効果はホウ酸が担っており，トロメタモールやEDTAは，ホウ酸の発育抑制作用を何らかの形で高めていると考えられた．殺菌剤である塩化ベンザルコニウムは，菌体表層を破壊し，それに伴い細胞同士が凝集することが報告されている6）．これに対し，試験菌の顕微鏡観察結果からは，TBE存在下での明確な菌体の変形や外膜損傷は認められなかった（図2）．これらの結果から，塩化ベンザルコニウムとは異なり，TBEは菌体表層の破壊を起こさずに増殖抑制効果を発揮していると考えられる．ICP-MSによる細菌内ホウ酸濃度の測定結果から，E.coli，P.aeruginosaおよびS.aureusの3菌種において，ホウ酸の菌体内への流入が確認され（図3），また，ホウ酸流入量はトロメタモールおよびEDTAの共存下において増加することが明らかとなった（図3）．EDTAについては，グラム陰性菌体表層を形成するリポ多糖（LPS）分子間に存在する2価金属イオンをキレートすることによって，また，トロメタモールについては，LPSの金属イオン結合サイトに結合することによって，菌体表層構造に変化を与える可能性が指摘されている7）．これらのことからTBEは，EDTAとトロメタモールの菌体への直接作用によってホウ酸の菌体内への透過性が向上していると考えられる．グラム陽性菌や真菌のホウ酸流入経路やトロメタモールおよびEDTA共存下での透過性作用機序は不明な点が多いため，抗菌活性との関連を含めて，今後，詳細を検討する予定である．細菌遺伝子生合成，蛋白質生合成に対するTBEの影響を検討したところ，TBE存在下では，遺伝子生合成が抑制され，アミノアシルtRNA合成酵素活性も阻害されることが明らかになった（図4，5）．遺伝子合成能評価指標であるチミジンはDNAを構成する塩基の一つであり，この塩基の菌体内への取り込みが抑制され，菌体の遺伝子生合成が抑制，または停止したと考えられる．また，アミノアシルtRNA合成酵素は，蛋白質合成の翻訳過程において必須の酵素であり，本酵素の阻害は蛋白質合成に大きく影響すると考えられる8）．また，アミノアシルtRNAは細菌のペプチドグリカン形成にも関与しており9），本酵素の阻害により菌体表層構造の形成も影響を受ける可能性が考えられる．これらの結果から，TBE存在下では，菌体の増殖や生存に必要な遺伝子生合成および蛋白質生合成が低下し，菌体の増殖が抑制されると考えられた．以上の結果から筆者らは，緩衝剤や安定剤として配合されているトロメタモール，ホウ酸，EDTAの3成分を一定比率で配合した組成，すなわち，TBEの細菌および真菌に対する増殖抑制効果と作用機序の一部を明らかにした．TBEが有する細菌および真菌に対する幅広い抗菌作用は，点眼剤の防腐剤フリー組成としてだけでなく，近年問題視されているコンタクトレンズに対する塩化ベンザルコニウムなどのカチオン性殺菌剤の吸着とそれにより生じる角膜障害に対して有効な手段の一つになると考えている．文献1）BursteinNL：Preservativecytotoxicthresholdforben-zalkoniumchlorideandchlorhexidinedigluconateincatandrabbitcorneas.InvestOphthalmolVisSci19：308-313,19802）植田喜一，柳井亮二：シリコーンハイドロゲルコンタクトレンズとマルチパーパスソリューション，点眼薬．あたらしい眼科25：923-930,20083）CuijuX,DongC,JingboLetal：Arabbitdryeyemodelinducedbytopicalmedicationofapreservativebenzalko-niumchloride.InvestOphthalmolVisSci49：1850-1856,20084）高鳥浩介：抗菌剤の効力評価．誰でもわかる抗菌の基礎知識（高麗寛紀，芝崎勲，高鳥浩介ほか編），p99-108,テクノシステム，19995）西川朱實：カンジダの菌学．真菌誌48：126-128,20076）SakagamiY,YokoyamaH,NishimuraHetal：MechanismofresistancetobenzalkoniumchloridebyPseudomonasaeruginosa.ApplEnvironMicrobiol55：2036-2040,19897）MarttiV：Agentsthatincreasethepermeabilityoftheoutermembrane.MicrobiolRev56：395-411,19928）RockFL,MaoW,YaremchukAetal：Anantifungalagentinhibitsanaminoacyl-tRNAsynthetasebytrappingtRNAintheeditingsite.Science316：1759-1761,20079）RajBhandraryUL,SollD：Aminoacyl-tRNAs,thebacteri-alcellenvelope,andantibiotics.ProcNatlAcadSciUSA105：5285-5286,2008

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