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表面麻酔薬オキシブプロカイン塩酸塩点眼液の角膜傷害性評価

admin — Wed, 29 Jun 2016 15:21:45 +0000

《第35回日本眼薬理学会原著》あたらしい眼科33（6）：863.866，2016c表面麻酔薬オキシブプロカイン塩酸塩点眼液の角膜傷害性評価長井紀章＊1真野裕＊1辰巳賀陽子＊1川﨑真緒＊1伊藤吉將＊1岡本紀夫＊2下村嘉一＊2＊1近畿大学薬学部製剤学研究室＊2近畿大学医学部眼科学教室InVitroandVivoEvaluationofCornealDamageCausedbyCommerciallyAvailableOxybuprocaineEyedrops,usingHumanandRatCornealEpithelialCellsNoriakiNagai1）,YuMano1）,KayokoTatsumi1）,MaoKawasaki1）,YoshimasaIto1）,NorioOkamoto2）YoshikazuShimomura2）and1）FacultyofPharmacy,KinkiUniversity,2）DepartmentofOphthalmology,KinkiUniversitySchoolofMedicine本研究では，表面麻酔薬オキシブプロカイン塩酸塩点眼液の角膜傷害性について評価を行った．実験にはベノキシールR点眼液0.4％（先発品）とオキシブプロカイン塩酸塩点眼液0.4％「ニットー」（ジェネリック医薬品，以下GE）を用いた．角膜傷害性は，ヒト角膜上皮細胞と1次速度式から算出した急性，慢性毒性にて評価した．また，ラット角膜上皮.離モデルを用い，オキシブプロカイン塩酸塩点眼液点眼が角膜治癒へ与える影響についても検討した．GEの急性毒性は，先発品と比較し低値であった．一方，慢性毒性は，先発品とGE間で差は認められず，ラット角膜上皮.離モデルを用いた系においても，GE点眼群の角膜傷害治癒速度は先発品のそれと同程度であった．以上，市販オキシブプロカイン塩酸塩点眼液の角膜傷害性を明らかにした．本研究結果は，眼に優しい表面麻酔薬開発への一つの指標になるものと考える．Inthisstudy,weinvestigatedcornealcelldamagecausedbycommerciallyavailableoxybuprocaineeyedrops,suchasBenoxilRophthalmicsolution0.4％（originaldrug）andoxybuprocainehydrochlorideophthalmicsolution0.4％「NITTO」（genericdrug,GE）.Acuteandchronictoxicitywerecalculatedusingculturedcornealepitheliumcells（HCE-T）andfirst-orderrateequation；theeffectoftheeyedropsoncornealwoundhealingwasdemonstratedusingratdebridedcornealepithelium.AlthoughtheacutetoxicityofHCE-TcellstreatedwithGEwassignificantlylowerthanwiththeoriginaldrug,thechronictoxicitydidnotdifferbetweentheoriginaldrugandGE.Inaddition,cornealwoundhealinginratsinstilledwithGEwasalsosimilartothatoftheoriginaldrug.Thesefindingsprovidesignificantinformationforuseindesigninglocalanaestheticeyedropsfreeofcelldamage.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）33（6）：863.866,2016〕Keywords：オキシブプロカイン塩酸塩，ジェネリック医薬品，角膜傷害，点眼薬，表面麻酔薬．oxybuprocainehydrochloride,genericdrugs,cornealdamage,eyedrops,localanaestheticeyedrops.はじめにオキシブプロカイン塩酸塩点眼液は，眼科領域における検査や手術時に用いられる優れた表面麻酔薬である．しかし，表面麻酔薬の濫用により重篤な角膜傷害を起こした症例が報告されており，鎮痛などを目的とした頻回投与は副作用発現防止のため，注意喚起されている．これらオキシブプロカイン塩酸塩点眼液による角膜傷害には，使用時の涙液分泌の低下と，主薬であるオキシブプロカイン塩酸塩や保存剤（ベンザルコニウム塩化物，BAC）による細胞毒性が知られており，臨床での使用は制限されている．一方，2013年6月にオキシブプロカイン塩酸塩のジェネリック医薬品としてオキシブプロカイン塩酸塩点眼液0.4％「ニットー」（日東メ〔別刷請求先〕伊藤吉將：〒577-8502東大阪市小若江3-4-1近畿大学薬学部製剤学研究室Reprintrequests：YoshimasaIto,Ph.D.,FacultyofPharmacy,KinkiUniversity,3-4-1Kowakae,Higashi-Osaka,Osaka577-8502,JAPAN0910-1810/16/\100/頁/JCOPY（103）863ディック）が販売された．本製剤は先発品と比較し，保存剤であるBAC濃度の減少および増粘剤の追加がなされているが，薬効は同程度と報告されており1），製剤工夫による副作用発現の低下や用途拡大が期待できる．点眼薬の角膜傷害性を検討するうえで，評価系の選択はきわめて重要である．角膜傷害は，点眼薬中に含まれる主薬，添加剤，保存剤だけでなく，角膜知覚，涙液動態および結膜といったオキュラーサーフェス（眼表面）の状態が関与することが知られており，臨床および基礎両面からの観察が重要であると考えられている．筆者らはこれまで，不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T）および1次速度式を用いた細胞傷害性解析にて，急性および慢性毒性を算出する方法（invitro角膜上皮細胞傷害性評価）が点眼薬の角膜傷害性強度を明らかとするうえで有用であることを報告してきた2,3）．また，角膜上皮.離ラットを用いることで，invivo系における薬物角膜傷害強度が評価可能であることを明らかとしてきた4）．そこで今回，これらinvitro，invivo角膜傷害性評価法を用いることで，現在臨床現場で使用されているオキシブプロカイン塩酸塩点眼液先発品およびジェネリック医薬品の角膜傷害性評価を行った．I対象および方法1.使用細胞培養細胞は不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T，RCBNo.1384）を用い，1,000IU/mLペニシリン（GIBCO社製），100mg/mLストレプトマイシン（GIBCO社製）および5％ウシ胎児血清（FBS，GIBCO社製）を含むDMEM/F12培地（GIBCO社製）にて培養した．2.使用薬物眼科用表面麻酔薬は臨床現場にて多用されるオキブプロカイン塩酸塩点眼液先発品（ベノキシールR点眼液0.4％，参天製薬）およびジェネリック医薬品（オキシブプロカイン塩酸塩点眼液0.4％「ニットー」，日東メディック）を用いた．表1に両製剤の組成を示す．3.角膜上皮細胞傷害性の評価筆者らが確立し報告してきたinvitro角膜上皮細胞傷害性評価法に従い行った2,3）．HCE-T細胞を96wellプレートに100mL（1×104個）ずつ播種し，24時間培養（37℃，5％CO2条件下）したものを実験に用いた．実験操作は以下のようにして行った．HCE-T細胞を10.120秒薬剤にて処理後，PBSにて2回洗浄し，各wellにナカライ社製CellCountReagentSFを含有する培地120mLを加え，1時間処理（37℃，5％CO2）後，マイクロプレートリーダー（BIO-RAD社製）にて450nmの吸光度（Abs）を測定した．本研究では，薬剤処理後の細胞死亡率（％）を次式（1）により算出した．細胞死亡率（％）＝（Abs未処理.Abs薬剤処理）/Abs未処理×100（1）また，薬剤処理が細胞傷害へ与える影響をより詳細に検討するために，次式（2）を用いて解析を行った．Dt＝D∞（1.e.kDt）（2）kDは細胞傷害速度定数（min.1），tは点眼薬処理後の時間（0.2分），D∞およびDtは薬剤処理∞およびt分後の細胞死亡率を示す．本研究ではkD，D∞をそれぞれ急性毒性および慢性毒性として表すパラメーターとした．また，先発品およびジェネリック医薬品に含まれる添加物中の急性，慢性毒性の評価には，眼科用剤の最大許容濃度を使用した．4.ラット角膜上皮.離モデルを用いた角膜傷害治癒解析イソフルラン麻酔下，生検トレパンで円形にラット角膜を形取り，ブレードで角膜上皮を.離した（.離面積10.1±0.6,mm2；平均値±標準誤差）．実験時には点眼液を1日3回（9：00，15：00，21：00）1回30μL，実験終了まで点眼した．角膜上皮欠損部分の推移は，角膜.離0，6，24時間後に1％フルオレセイン含有0.4％ベノキシール点眼液にて染色し，トプコン社製眼底カメラ装置TRC-50Xで撮影した画像をImageJにて解析することで評価した．角膜傷害治癒率（％）は，次式（3）にて算出した4）．角膜傷害治癒率（％）＝（面積.離直後.面積.離6,24時間後）/面積.離直後×100（3）5.統計解析得られたデータは平均値±標準誤差として表した．各々の実験値はStudentのt-testにより解析した．また，本研究ではp値が0.05以下を有意差有りとした．表1オキシブプロカイン塩酸塩点眼液先発品およびジェネリック医薬品の組成先発品塩化ナトリウムエデト酸ナトリウム水和物ベンザルコニウム塩化物（0.004％）ポリビニルアルコールpH調整剤（）内の数値は濃度を示す．ジェネリック医薬品塩化ナトリウムエデト酸ナトリウム水和物ベンザルコニウム塩化物（0.002％）ヒプロメロースpH調整剤864あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016（104）A0時間6時間24時間先発品020304050600.0細胞死亡率（％）10先発品●ジェネリック医薬品＊＊＊0.51.01.52.0ジェネリック処理時間（分）医薬品図1HCE.Tを用いたオキシブプロカイン塩酸塩点眼液の細胞傷害性評価平均値±標準誤差，n＝6．＊p＜0.05,vs.先発品．B100先発品■ジェネリック医薬品角膜傷害治癒度（％）80604020表2オキシブプロカイン塩酸塩点眼液先発品およびジェネリック医薬品処理による角膜傷害性の比較先発品ジェネリック医薬品kD（min.1）3.10±0.391.29±0.22＊D∞（％）56.4±2.763.3±7.0平均値±標準誤差，n＝6．＊p＜0.05,vs.先発品．II結果1.オキシブプロカイン塩酸塩点眼液先発品およびジェネリック医薬品の角膜傷害性比較図1はオキシブプロカイン塩酸塩点眼液処理時におけるHCE-T細胞の死亡率を示す．また，表2にはオキシブプロカイン塩酸塩点眼液処理時における急性毒性（kD）と慢性毒性（D∞）を示す．結果から，両製剤処理群の傷害性強度に差がみられ，市販オキシブプロカイン塩酸塩点眼液のジェネリック医薬品を30秒処理した際の細胞死亡率は31.7±1.0％と，先発品（45.8±4.1％）と比較し細胞傷害性は有意に低値であった（平均値±標準誤差，n＝6）．また，ジェネリック医薬品の急性毒性は，先発品と比べ低値を示したが，慢性毒性においては，先発品とジェネリック医薬品間で差は認められなかった．一方，BAC単独処理実験にて0.002％と0.004％BACの30秒処理後の細胞傷害性を調べたところ，それぞれ7.1±1.9％，19.7±3.6％であり，単独2分処理後の細胞傷害性は21.3±5.1％，29.3±5.5％であった（平均値±標準誤差，n＝6）．加えて，先発品中に含まれる増粘剤ポリビニルアルコールおよびジェネリック医薬品中の増粘剤ヒプロメロースの慢性毒性を算出したところ，1％ポリビニルアルコールは4.7±2.1％，0.35％ヒプロメロースでは6.6±2.5％であった（薬剤処理時間2分，平均値±標準誤差，n＝6）．また，先発品およびジェネリック医薬品両製剤に含まれる添加物0.9％塩化ナトリウムおよび0.12％エデト酸ナトリウムの慢性毒性は，0.6±0.1％，9.8±2.4％であった（薬剤処理時間2分，平均値±標準誤差，n＝6）．図2はオキシブプロカ（105）06時間24時間.離後の時間図2オキシブプロカイン塩酸塩点眼液点眼が角膜傷害治癒へ与える影響A：代表的角膜画像（破線内は傷害部分を表す）．B：オキシブプロカイン塩酸塩点眼液点眼後の角膜傷害治癒度度．平均値±標準誤差，n＝5．イン塩酸塩点眼液点眼に伴うラット角膜傷害治癒速度の変化を示す．Invitro系の慢性毒性の結果と同様，ラット角膜上皮.離モデルを用いた系では，先発品およびジェネリック医薬品間で差はみられなかった．III考按オキシブプロカイン塩酸塩点眼液は，眼科領域における検査や手術時に用いられるが，濫用により重篤な角膜傷害を起こすことが知られている．本研究では2013年6月に販売開始されたオキシブプロカイン塩酸塩点眼液のジェネリック医薬品における角膜上皮細胞毒性（副作用）について先発品と比較評価した．まず，オキシブプロカイン塩酸塩点眼液の先発品とジェネリック医薬品のinvitro角膜上皮傷害評価を行ったところ，両処理群において処理時間の増加とともに細胞死亡率が増加し，その急性毒性は先発品＞ジェネリック医薬品であった（表2）．これら点眼製剤の角膜傷害性には保存剤の関与が知られている．点眼剤中に含まれる保存剤は，二次汚染を防止し安全に使用するために必要不可欠である．しかし，一般に保存剤は細菌を殺すという性質上，使用後の“しみる”，“かあたらしい眼科Vol.33，No.6，2016865すむ”，眼の充血をはじめ，点眼表層角膜症や眼瞼炎といった眼局所の副作用発現に繋がり，臨床において問題視されている5）．今回検討したオキシブプロカイン塩酸塩点眼液にはBACが保存剤として用いられており，BACは陽電荷をもつ原子団が菌体表面に吸着することで細胞膜破壊，細胞内の酵素蛋白の変性，呼吸系の阻害を引き起こすことが報告されている6.8）．一方，先発品中に含まれるBAC濃度は0.004％であったが，ジェネリック医薬品ではBAC濃度が0.002％と半分に軽減されている．さらに，0.002％と0.004％BAC単独30秒処理時の細胞傷害性は，それぞれ7.1％，19.7％であったことから，両製剤間の急性毒性の違い（先発品＞ジェネリック医薬品）にはBAC濃度の差が関与しているものと示唆された．これら急性毒性とは異なり，慢性毒性は両製剤ともに約60％であり，先発品とジェネリック医薬品間で差は認められなかった．そこで次に，これら慢性毒性の差を明らかとすべく，BAC濃度0.002％と0.004％の単独2分処理後の細胞傷害性を調べた．その結果，BAC濃度0.002％と0.004％の細胞傷害性はそれぞれ21.3％，29.3％であり，両製剤の慢性毒性に比べ低値であることから，BAC以外の要因が慢性毒性には強く関与しているものと示唆された．オキシブプロカイン塩酸塩点眼液の先発品とジェネリック医薬品の組成の違いとして，BAC濃度の差に加え，異なる増粘剤が用いられていることが挙げられる（表1）．しかし，先発品中に含まれる増粘剤ポリビニルアルコールおよびジェネリック医薬品中の増粘剤ヒプロメロースの慢性毒性を算出してみたところ，1％ポリビニルアルコールと0.35％ヒプロメロースの慢性毒性はともに低値であった．また，両製剤に含まれる添加物0.9％塩化ナトリウムと0.12％エデト酸ナトリウムの慢性毒性はほとんどみられなかった．このように，含有される添加物の細胞傷害性と比較し，オキシブプロカイン塩酸塩点眼液の細胞傷害性（慢性毒性）が高いことから，これら製剤の慢性毒性には，主薬であるオキシブプロカイン自身がもっとも強く関与していることが示唆された．さらに，invivo系にて両製剤が角膜傷害治癒に与える影響を検討したところ，invitro慢性毒性と同様，先発品およびジェネリック医薬品間で差はみられなかった．オキシブプロカイン塩酸塩などの表面麻酔薬は，その麻酔作用により涙液分泌の低下がみられ，薬物による傷害性が高まる危険性が考えられる．また，本invitro系実験にて，オキシブプロカイン塩酸塩の慢性毒性には，主薬がもっとも強く関与していることを示した．以上，オキシブプロカイン塩酸塩点眼液では，BAC濃度を減らすことで，細胞傷害の誘発率を反映する急性毒性の減弱がみられるが，傷害度強度や傷害治癒への影響にかかわる慢性毒性の軽減のためには，もともと0.004％と低濃度であるBACの含量の減弱よりも，主薬自身の傷害性を抑制するような工夫が必要であることを示した．本研究結果は，表面麻酔薬選択や眼に優しい局所麻酔薬の開発における一つの指標になるものと考える．利益相反：利益相反公表基準に該当なし文献1）日東メディック株式会社：オキシブプロカイン塩酸塩点眼液0.4％「ニットー」．添付文書20132）NagaiN,MuraoT,OkamotoNetal：Comparisonofcornealwoundhealingratesafterinstillationofcommerciallyavailablelatanoprostandtravoprostinratdebridedcornealepithelium.JOleoSci59：135-141,20103）長井紀章，大江恭平，森愛里ほか：各種保存剤を用いた市販緑内障治療（配合）点眼液における角膜傷害性のキネティクス解析．あたらしい眼科30：1023-1028,20134）NagaiN,YoshiokaC,ManoYetal：Ananoparticleformulationofdisulfiramprolongscornealresidencetimeofthedrugandreducesintraocularpressure.ExpEyeRes132：115-123,20155）瀧沢岳，片岡伸介，小高明人ほか：ホウ酸含有点眼剤組成の抗菌メカニズム．あたらしい眼科27：518-522,20106）DebbaschC,PisellaPJ,DeSaintJeanMetal：Mitochondrialactivityandglutathioneinjuryinapoptosisinducedbyunpreservedandpreservedbeta-blockersonChangconjunctivalcells.InvestOphthalmolVisSci42：25252533,20017）DeSaintJeanM,BrignoleF,BringuierAF：EffectsofbenzalkoniumchlorideongrowthandsurvivalofChangconjunctivalcells.InvestOphthalmolVisSci40：619-630,19998）DebbaschC,BrignoleF,PisellaPJetal：Quaternaryammoniumsandotherpreservatives’contributioninoxidativestressandapoptosisonChangconjunctivalcells.InvestOphthalmolVisSci42：642-652,2001＊＊＊866あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016（106）

点眼用添加物EDTA が種々保存剤の抗菌力および角膜傷害性へ与える影響

admin — Wed, 29 Jun 2016 15:20:14 +0000

《第35回日本眼薬理学会原著》あたらしい眼科33（6）：857.861，2016c点眼用添加物EDTAが種々保存剤の抗菌力および角膜傷害性へ与える影響長井紀章＊1田辺航＊1辻朗子＊1勝井結美＊1伊藤吉將＊1岡本紀夫＊2下村嘉一＊2＊1近畿大学薬学部製剤学研究室＊2近畿大学医学部眼科学教室EffectofEDTAonAntimicrobialActivityandCornealToxicityofVariousEyedropPreservativesNoriakiNagai1）,WataruTanabe1）,AkikoTsuji1）,YumiKatsui1）,YoshimasaIto1）,NorioOkamoto2）YoshikazuShimomura2）and1）FacultyofPharmacy,KinkiUniversity,2）DepartmentofOphthalmology,KinkiUniversitySchoolofMedicine今回筆者らは，一般的な点眼用添加剤である安定化剤エチレンジアミン四酢酸（EDTA）が，各種保存剤の抗菌力および角膜傷害性に与える影響について検討を行った．保存剤はベンザルコニウム塩化物（BAC），パラオキシ安息香酸メチル（MP），パラオキシ安息香酸プロピル（PP），亜塩素酸ナトリウム（SC）およびクロルヘキシジングルコン酸塩（CHG）の計5種を用いた．また，抗菌力および角膜傷害性の確認には大腸菌（E.coli，ATCC8739），ヒト角膜上皮細胞（HCE-T）を用いた．その結果，EDTA併用下において，BACの抗菌力上昇が認められたが，細胞傷害性に変化はみられなかった．一方，他の4剤の保存剤では，EDTAとの併用により抗菌力および細胞傷害性の低下がみられた．以上，点眼薬処方におけるEDTA使用は，保存剤の抗菌力や細胞傷害性に影響を与えることを明らかとした．本研究成果は，点眼薬処方設計の一つの指標になるものと考える．Inthisstudy,weinvestigatedtheeffectofethylenediaminetetraaceticacid（EDTA）ontheantimicrobialactivityandcornealtoxicityofvariouspreservatives,usingEscherichiacoli（E.coli,ATCC8739）andculturedcornealepitheliumcells（HCE-T）.Benzalkoniumchloride（BAC）,methylparahydroxybenzoate（MP）,propylparahydroxybenzoate（PP）,sodiumchlorite（SC）andchlorhexidinegluconate（CHG）wereusedaspreservativesinthisstudy.AlthoughtheantimicrobialactivityofBACwasincreasedbytheadditionofEDTA,thecornealtoxicityofBACwassimilartothatofthecombinationofEDTAandBAC.Ontheotherhand,boththeantimicrobialactivityandcornealtoxicityofMP,PP,SCandCHGweredecreasedbytheadditionofEDTA.TheseresultsshowthattheuseofEDTAasanophthalmicpharmaceuticaladditiveaffectstheantimicrobialactivityandcornealtoxicityofpreservatives.Thesefindingsprovidesignificantinformationforuseinthedesigningofeyedrops.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）33（6）：857.861,2016〕Keywords：保存剤，エチレンジアミン四酢酸，抗菌力，角膜毒性，点眼薬．preservatives,ethylenediaminetetraaceticacid,antimicrobialactivity,cornealtoxicity,eyedrops.はじめに医薬品は主成分となる薬剤（主剤）のみでは製剤とはいえず，これに製剤設計上必要な薬剤（添加剤）が加えられ初めて製剤となる．点眼薬においても同様であり，一般的に点眼薬には可溶化剤（ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油，ポリソルベート80，ポビドンなど），安定化剤（ポリソルベート80，ポビドン，エチレンジアミン四酢酸（EDTA）など），等張化剤（塩化ナトリウム，ブドウ糖，マンニトールなど），緩衝剤（酢酸ナトリウム水和物，炭酸水素ナトリウム，ホウ酸など），pH調節剤（希塩酸，水酸化ナトリウムなど），保存剤（ベンザルコニウム塩化物（BAC），パラオキシ安息香酸メチル（MP），パラオキシ安息香酸プロピル（PP），亜塩〔別刷請求先〕伊藤吉將：〒577-8502東大阪市小若江3-4-1近畿大学薬学部製剤学研究室Reprintrequests：YoshimasaIto,Ph.D.,FacultyofPharmacy,KinkiUniversity,3-4-1Kowakae,Higashi-Osaka,Osaka577-8502,JAPAN0910-1810/16/\100/頁/JCOPY（97）857素酸ナトリウム（SC），クロルヘキシジングルコン酸塩（CHG）など）が含まれる．なかでもこれら点眼薬中に含まれる保存剤は，二次汚染を防止し安全に使用するために必要不可欠である．現在市販されている点眼薬では，保存剤の約7割にBACが用いられ，約2割にパラベン類（MPやPP），そしてその他の約1割にSCやCHGなどが使用されている．しかし，これら保存剤の長期連続投与は，使用後の“しみる”“かすむ”，眼の充血をはじめ，点眼表層角膜症や眼瞼炎とい(，)った眼局所の副作用発現に繋がるため，臨床において問題視されている1）．したがって，抗菌力が高く，角膜傷害性の少ない眼にやさしい新たな製剤処方の開発が望まれている．このような背景から，眼科領域では1回使い切りタイプの容器やPFデラミ容器R（容器を二層構造とし点眼薬に添加される保存剤を不要にしたもの）などが市販されている．また，配合剤や細胞毒性の低い新規保存剤の開発のための研究も進められている1）．一方，製剤処方において，主薬と添加物の相互作用についてはいまだ十分に検討はなされておらず，添加物が各種保存剤の抗菌力や角膜毒性に与える影響を明確にすることは，眼にやさしく，高い抗菌力を維持する製剤処方の確立において非常に重要である．そこで今回，基礎研究として代表的点眼製剤用添加物であるEDTAが保存剤各種の抗菌力および角膜傷害性に与える影響について検討を行った．I対象および方法1.使用薬物点眼用添加物である安定化剤EDTAと保存剤として多用されているBAC，MP，PP，SCおよびCHGの計6種を用いた．各種試験溶液は，EDTAと各種保存剤（BAC，MP，PP，SC，CHG）を精製水で溶解し，細孔径0.2μmのメンブランフィルターで濾過滅菌することで調製した．角膜細胞傷害性の評価に用いたEDTAの濃度は，過去の報告に従い2），眼科用最大許容投与量（0.127％）以下である0.1％（1mg/mL）とした2）．また，各種保存剤濃度は，臨床で用いられる濃度を参考に，いずれも0.005％（50mg/mL）とした．2.最小発育阻止濃度（MIC）の測定試験菌株には，独立行政法人製品評価技術機構から購入した大腸菌（E.coli，ATCC8739）を用い，MICの測定は微量液体希釈法に従い行った1）．また，感受性測定用培地はMuellerHintonBroth（日本ベクトン・ディッキンソン）を用いた．実験操作は以下のようにして行った．まず，E.coliを寒天培地上で18.24時間培養（35±1℃）後，滅菌生理食塩液にて試験菌が1×108個含まれる菌液を調製し，薬液と1×106個/mLの生菌数になるように混合した（試験液）．これらの試験液を含む容器を22.5±2.5℃の条件下で遮光保存し，28日後の試験溶液中生菌数の確認を行った．生菌数の858あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016確認にはカンテン平板混釈法を用い，対照に用いた薬剤不含有培地での菌の発育を確認後，菌の発育が肉眼的に認められないwellのうち最小の薬剤濃度をMICとした1）．3.角膜上皮細胞傷害性の評価培養細胞は理化学研究所より購入した不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T，RCBNo.1384）を用い，角膜細胞傷害性の評価は，筆者らが確立し報告してきたinvitro角膜上皮細胞傷害性評価法に従った2.4）．HCE-T細胞を96wellプレートに100mL（1×104個）ずつ播種し，37℃，5％CO2インキュベーター内で24時間培養したものを実験に用いた．実験操作は以下のようにして行った．HCE-T細胞を10.120秒薬剤にて処理後，PBSにて2回洗浄し，各wellに100mLの培地およびCellCountReagentSF（ナカライラスク社製）20mLを加え，37℃，5％CO2インキュベーター内で1時間処理後，450nmの吸光度（Abs）を測定した．薬剤処理後の細胞死亡率（％）は次式（1）により算出した．細胞死亡率（％）＝（Abs未処理.Abs薬剤処理）/Abs未処理×100（1）4.統計解析実験は1群に対し8回（検体）行い，得られたデータは平均値±標準誤差（SE）として表した．各々の実験値はStudentのt-testにより解析した．また，本研究ではp値が0.05以下を有意差ありとした．II結果1.EDTA添加に伴う種々保存剤の抗菌力の変化表1はEDTAおよび種々保存剤のMICを示す．また，図1にはEDTAと種々保存剤併用処理時における抗菌力の変化を示す．EDTAのMICは700mg/mLであり，今回使用した保存剤のMICはBAC＞CHG＞Mp＞SC＞PPの順であった．これら保存剤にEDTAを添加したところ，MP，PP，SCおよびCHGにおいて抗菌力の低下がみられた．一方，BACではEDTAの添加により抗菌力の増大が認められ，MICより低い濃度においても十分な抗菌力を示した．表1眼科用添加物のE.coliに対する最小阻害濃度眼科用添加物MIC（μg/mL）BAC（ベンザルコニウム塩化物）16MP（パラオキシ安息香酸メチル）6PP（パラオキシ安息香酸プロピル）1.25SC（亜塩素酸ナトリウム）5CHG（クロルヘキシジングルコン酸塩）8EDTA（エチレンジアミン四酢酸）700（98）A：BACB：MB：MPC：PP1001008080保存効力なし●保存効力ありPP濃度（μg/mL）保存効力なし●保存効力あり保存効力なし●保存効力あり細胞死亡率（％）細胞死亡率（％）SC濃度（μg/mL）BAC濃度（μg/mL）細胞死亡率（％）細胞死亡率（％）CHG濃度（μg/mL）MP濃度（μg/mL）604020604020000010020030040050001002003004005000100200300400500EDTA濃度（μg/mL）EDTA濃度（μg/mL）EDTA濃度（μg/mL）D：SCE：CHG100保存効力なし●保存効力あり保存効力なし●保存効力あり図1EDTAが種々保存剤の抗菌力に与え001002003004005000100200300400500る影響EDTA濃度（μg/mL）EDTA濃度（μg/mL）破線は各保存剤自身（単独）のMICを示す．0A：BACB：MPC：PP8080606040402020MP●MPwithEDTA＊＊00306090120時間（sec）00306090120時間（sec）PP●PPwithEDTAE：CHGD：SC00306090120時間（sec）BAC●BACwithEDTA808080707070細胞死亡率（％）606060505050404040303030202020＊101010SC●SCwithEDTA＊＊CHG●CHGwithEDTA図2EDTA（0.1％）が各種保存剤（0.005208080706050403020＊70＊60504030％）の角膜細胞傷害性に与える影響10細胞死亡率は式（1）を用いて算出した．平0030609012000306090120均値±標準誤差，n＝8．＊p＜0.05vs.コン時間（sec）時間（sec）トロール群（EDTA非添加群）．2.EDTA添加に伴う種々保存剤の角膜細胞傷害性のBAC≒CHG＞SC≫MPの順であった．一方，パラベン類で変化あるPPにおいては処理120秒まで細胞傷害は認められなか図2はEDTAと種々保存剤処理時におけるHCE-T細胞ったが，処理180秒後では細胞傷害がみられ，その細胞死の死亡率を示す．BAC，MP，SCおよびCHGでは処理時間亡率は13.9±2.1（平均値±SE）であった．これら種々保存の増加とともに細胞死亡率の増加が認められ，その傷害性は剤にEDTAを添加したところ，BAC処理群ではその細胞傷（99）あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016859害性に大きな影響はみられなかった．このBAC処理群の結果とは異なり，MP，SCおよびCHG処理群ではEDTAの併用処理により，細胞毒性が有意に低下した．また，PPおよびEDTA併用処理群では，処理0.180秒間において細胞傷害性はみられなかった．III考按EDTAは点眼薬中に多く含まれる安定化剤であり，BAC，MP，PP，SC，CHGは点眼製剤の製造において多用される保存剤である．本研究ではEDTAと各種保存剤（BAC，MP，PP，SC，CHG）の組み合わせが，保存剤の有する抗菌力および角膜上皮細胞毒性（副作用）へ与える影響について明らかにするために検討した．まず，今回用いたEDTAと各種保存剤（BAC，MP，PP，SC，CHG）の抗菌力および角膜上皮細胞傷害性について検討したところ，EDTAの抗菌力はMIC700mg/mLと低かったが，各種保存剤単独では強い抗菌力が確認できた．一方，0.005％における各種保存剤の角膜上皮細胞傷害性は，BAC≒CHG＞SC≫MPの順であり，PPにおいては処理120秒間で細胞傷害性はみられず，毒性は非常に低いものであった．一般に，保存剤の抗菌メカニズムと角膜細胞毒性とは密接にかかわっていることが知られている．今回選択したBACは陽電荷をもつ原子団が菌体表面に吸着することで細胞膜破壊，細胞内の酵素蛋白質の変性，呼吸系の阻害を引き起こす5.7）．また，パラベン類（MPやPP）の抗菌作用発現機構は，膜イオン透過性亢進による膜電位の消失もしくはミトコンドリアの呼吸機能障害によることが先行研究により示唆されており，アルキル側鎖の長さが長い程細胞毒性が低下することが知られている8,9）．これらパラベン類のアルキル側鎖の長さと細胞毒性の関係は，今回示したMP，PPの結果と同様であった（表1および図1）．さらに，SCはアミノ酸のスルフィド（S-H）結合と酵素のジスルフィド（S-S）結合を酸化して細胞の機能を破壊するとともに，細胞膜を直接的に破壊して抗菌活性を示すとされており10），CHGは細胞膜に吸着し，細胞膜傷害と細胞質の漏洩を起こすとともに，酵素蛋白質に吸着して活性阻害を起こすことが知られている11）．一方，本研究では抗菌力の評価に，環境中に存在する菌類の主要な種の一つであるグラム陰性の桿菌E.coliを用いた．グラム陰性菌は細胞膜と外膜の2つの脂質膜に包まれている．この外膜はリポ多糖，リン脂質および数種の蛋白質などからなり，2価陽イオンでそれらの一部が結びつけられているため，陽イオンのキレーターであるEDTAを作用させると，外膜を構成する成分の一部が遊離し，外膜に障害が認められる12,13）．このような膜の傷害によって，外膜により膜内への透過が抑制されていた薬剤が容易に外膜を通過できるよ860あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016うになり，薬効および毒性が高まることが報告されている．したがって，E.coliにEDTAと各種保存剤を併用した際には，薬剤のE.coliに対する膜透過性亢進により抗菌力が高まるが，外膜を持たない角膜上皮細胞に対する細胞傷害性は大きく変化しないものと考えられた．本研究においても，BACとEDTAの組み合わせでは，抗菌力は上昇したが，角膜傷害性においては有意な差はみられなかった．このBACとEDTAの組み合わせの結果とは異なり，パラベン類（MP，PP），SCおよびCHGでは，EDTA併用により抗菌力および角膜傷害性の低下が認められた．EDTA併用処理では薬剤の膜透過性亢進が考えられるが，E.coliに対する抗菌力の低下と角膜上皮細胞における細胞毒性の軽減がともにみられたことから，パラベン類（MP，PP），SCやCHGの薬効（抗菌力）や副作用発現（細胞傷害性）には2価陽イオンがかかわっており，陽イオンのキレーターであるEDTAとの併用はそれらの効力を低下させる可能性が示唆された．以上，点眼薬の処方設計において，添加物EDTAの組み合わせは保存剤の抗菌力，角膜傷害性に影響を及ぼすことを見出した．今後，E.coli以外の菌類に対してどのような影響を与えるかを検討するとともに，パラベン類（MP，PP），SCおよびCHGの保存効果機構と2価陽イオンの関係についても検討を進めていく予定である．本研究結果は，点眼薬処方設計の一つの指標になるものと考える．利益相反：利益相反公表基準に該当なし文献1）瀧沢岳，片岡伸介，小高明人ほか：ホウ酸含有点眼剤組成の抗菌メカニズム．あたらしい眼科27：518-522,20102）長井紀章，村尾卓俊，伊藤吉將ほか：点眼薬含有添加剤であるポリソルベート80及びEDTA点眼が角膜上皮傷害治癒へ与える影響．あたらしい眼科27：1299-1302,20103）NagaiN,YoshiokaC,ManoYetal：Ananoparticleformulationofdisulfiramprolongscornealresidencetimeofthedrugandreducesintraocularpressure.ExpEyeRes132：115-123,20154）NagaiN,ItoY,OkamotoNetal：Ananoparticleformulationreducesthecornealtoxicityofindomethacineyedropsandenhancesitscornealpermeability.Toxicology319：53-6220145）DebbaschC,PisellaPJ,DeSaintJeanMetal：Mitochondrialactivityandglutathioneinjuryinapoptosisinducedbyunpreservedandpreservedbeta-blockersonChangconjunctivalcells.InvestOphthalmolVisSci42：25252533,20016）DeSaintJeanM,BrignoleF,BringuierAF：EffectsofbenzalkoniumchlorideongrowthandsurvivalofChangconjunctivalcells.InvestOphthalmolVisSci40：619-630,（100）19997）DebbaschC,BrignoleF,PisellaPJetal：Quaternaryammoniumsandotherpreservatives’contributioninoxidativestressandapoptosisonChangconjunctivalcells.InvestOphthalmolVisSci42：642-652,20018）BredinJ,Davin-RegliA,PagesJM：PropylparabeninducespotassiumeffluxinEscherichiacoli.JAntimicrobChemother55：1013-1015,20059）NakagawaY,MoldeusP：Mechanismofp-hydroxybenzoateester-inducedmitochondrialdysfunctionandcytotoxicityinisolatedrathepatocytes.BiochemPharmacol55：1907-1914,199810）小林正枝，秋山茂，岩下正人ほか：亜塩素酸ナトリウム製剤の殺菌効力に関する検討．食品衛生学雑誌30：367374,198911）第十六改正日本薬局方解説書廣川書店，C-1563,201112）AsbellMA,EagonRG：Roleofmultivalentcationsintheorganization,structure,andassemblyofthecellwallofPseudomonasaeruginosa.JBacteriol92：380-387,196613）RogersSW,GillelandHEJr,EagonRG：Characterizationofaprotein-lipopolysaccharidecomplexreleasedfromcellwallsofPseudomonasaeruginosabyethylenediaminetetraaceticacid.CanJMicrobiol15：743-748,1969＊＊＊（101）あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016861

眼感染症由来Staphylococcus aureusの In Viroバイオフィルム形成に及ぼすグルコースの影響と抗菌点眼薬の殺菌効果

admin — Tue, 29 Apr 2014 15:27:31 +0000

《第50回日本眼感染症学会原著》あたらしい眼科31（4）：571.580，2014c眼感染症由来StaphylococcusaureusのInVitroバイオフィルム形成に及ぼすグルコースの影響と抗菌点眼薬の殺菌効果神鳥美智子＊1井上幸次＊1池田欣史＊1藤原弘光＊2高畑正裕＊3髙倉真理子＊3＊1鳥取大学医学部視覚病態学＊2鳥取大学医学部附属病院検査部＊3富山化学工業株式会社綜合研究所InfluenceofGlucoseonInVitroBiofilmFormationbyStaphylococcusaureusIsolatedfromOcularInfection；BactericidalActivityofAntibacterialOphthalmicSolutionMichikoKandori1）,YoshitsuguInoue1）,YoshifumiIkeda1）,HiromitsuFujiwara2）,MasahiroTakahata3）andMarikoTakakura3）1）DivisionofOphthalmologyandVisualScience,FacultyofMedicine,TottoriUniversity,2）3）ResearchLaboratoriesToyamaChemicalCo.,Ltd.TottoriUniversityHospital,目的：糖尿病患者の涙液中グルコース濃度は健常人に比べ高く，結膜.常在菌に影響している可能性がある．そこで，眼感染症由来Staphylococcusaureus（S.aureus）のinvitroバイオフィルム形成に及ぼすグルコースの影響を調べるとともに，バイオフィルム形成菌に対する抗菌点眼薬の殺菌効果を検討した．方法：鳥取大学医学部附属病院の眼感染症患者から分離されたキノロン感受性S.aureus3株を用い，メンブレンフィルター（MF）上のバイオフィルム形成に及ぼすグルコースの影響をMF静置寒天平板培地にこれを添加することで検討した．また，トスフロキサシン，レボフロキサシン，セフメノキシムの各点眼液を最小発育阻止濃度（minimuminhibitoryconcentration：MIC）の30倍濃度（30MIC）でバイオフィルム形成菌に24時間作用させ，生菌数変化，さらに走査型電子顕微鏡による形態観察で殺菌効果を評価した．結果：S.aureusバイオフィルムの成熟度はグルコース濃度（0％，0.01％，0.1％および1.0％）に比例し増大した．0.1％グルコース存在下，バイオフィルム形成菌に対するトスフロキサシン点眼液30MIC作用時の殺菌効果は，いずれの場合も比較点眼液より有意に強かった．結論：S.aureusによるバイオフィルムの成熟度はグルコース濃度の影響を受けることから，糖尿病患者に対する抗菌点眼薬の選択においては，バイオフィルムにより効果のある薬剤を考慮する必要があると考えられた．Purpose：Tearglucoseconcentrationishigherindiabeticpatientsthaninhealthysubjectsandmayinfluenceconjunctivalflora.TheinfluenceofglucoseoninvitrobiofilmformationwasexaminedusingStaphylococcusaureusisolatedfrompatientswithocularinfection.Alsoinvestigatedwerethebactericidaleffectsofantibacterialophthalmicsolutionsagainstbiofilmbacteria.MaterialsandMethods：Usingthreequinolone-susceptibleS.aureusisolatesfrompatientswithocularinfectionatTottoriUniversityHospital,weexaminedtheinfluenceofglucoseonbiofilmformationonmembranefilter（MF）byaddingglucosetotheagarplateontheMF.Bactericidalactivitiesoftosufloxacin（TFLX）,levofloxacin（LVFX）andcefmenoxime（CMX）ophthalmicsolutionswereexaminedbycountingviablecellsremainingafterexposureofS.aureusbiofilmtothoseagentsatconcentrations30-foldtheirrespectiveminimuminhibitoryconcentrations（MIC）,andbyobservationunderascanningelectronmicroscope（SEM）Results：ThedegreeofS.aureusbiofilmmaturationincreasewasdependentontheglucoseconcentration（0％,(.)0.01％,0.1％and1.0％）.With0.1％glucose,thebactericidaleffectofthetosufloxacinophthalmicsolutionwassignificantlymorepotentthantheotherophthalmicsolutions.Conclusion：SincethedegreeofS.aureusbiofilmmaturationwasaffectedbyglucoseconcentration,itissuggestedthattheantibacterialophthalmicsolutionmostpotentagainstbiofilmbeselectedfordiabeticpatients.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）31（4）：571.580,2014〕〔別刷請求先〕井上幸次：〒683-8504米子市西町36-1鳥取大学医学部視覚病態学教室Reprintrequests：YoshitsuguInoue,M.D.,Ph.D.,DivisionofOphthalmologyandVisualScience,FacultyofMedicine,TottoriUniversity,36-1Nishi-cho,Yonago,Tottori683-8504,JAPAN0910-1810/14/\100/頁/JCOPY（93）571Keywords：黄色ブドウ球菌，グルコース，バイオフィルム，トスフロキサシン，点眼薬，殺菌効果．Staphylococcusaureus,glucose,biofilm,tosufloxacin,ophthalmicsolution,bactericidaleffect.はじめにグラム陽性菌のStaphylococcusaureus（S.aureus）は眼感染症の代表的な疾患である結膜炎や角膜炎の主要な起因菌である1）．また，発症頻度は低いものの，急性術後眼内炎の起因菌としてもStaphylococcusepidermidis（S.epidermidis）を含むコアグラーゼ陰性ブドウ球菌やS.aureusの割合が高い2,3）．S.epidermidisやS.aureusはヒトの結膜.内細菌叢に常在しており，このことが多くの眼感染症の起因菌になる理由と考えられる．分離比率はS.epidermidisが常に最も高いが，糖尿病患者ではS.epidermidisに次ぐS.aureusの比率が健常人より高いとの報告がある4）．眼感染症では周術期創部などから常在菌が侵入し，縫合糸などへの菌の定着の後，バイオフィルムを形成するケースや，治療に用いられる眼内レンズなどのバイオマテリアルに形成されたバイオフィルム菌などが発症に関与している場合がある5.7）．バイオフィルム形成後の菌の生育はslow-growingあるいはnondividinggrowthの状態にあると同時に，菌体を覆うexopolysaccharidematrixの薬剤低透過性などにより，抗菌薬の殺菌作用を回避すること，また，その成熟度が増した場合，抗菌薬の殺菌作用はさらに減弱されるので，治療の難渋化を招いていることが報告されている5,8,9）．筆者らは先に，メチシリンおよびキノロン感受性S.epidermidisを用いてinvitroで作製したバイオフィルム形成菌に対するフルオロキノロン系点眼薬とb-ラクタム系点眼薬の殺菌効果を検討した．その結果，いずれの薬剤もバイオフィルム形成菌に対する殺菌効果は浮遊菌（planktonic菌）の場合より減弱すること，また，バイオフィルム形成菌に対する殺菌効果はb-ラクタム系点眼薬よりフルオロキノロン系点眼薬が強いが，その作用はフルオロキノロン系点眼薬間でも差異が認められるとの成績を得た10）．眼感染症起因菌においてS.epidermidisと並び分離頻度の高いS.aureusでは，バイオフィルム形成時，生育環境に存在するグルコースによりバイオフィルム成熟度が変化することが報告されている11,12）．ヒト涙液にはグルコース（tearglucose）が正常人で0.004.0.008％含まれているが，糖尿病患者ではこれより高く13.15），眼表面や眼内におけるS.aureusのバイオフィルム形成は正常人の場合と異なるものと考えられる．このため，定着したS.aureusが形成したバイオフィルムに対する抗菌点眼薬の殺菌作用も何らかの影響を受けている可能性が推察される．現在，眼感染症におけるバイオフィルム形成菌について，涙液中のグルコースの影響や生理的なグルコース濃度存在下での，抗菌点眼薬の殺菌効果についての報告は見当たらない．そこで，今回，眼感染症由来S.aureusのinvitroバイオフィルム形成に及ぼすグルコースの影響を調べるとともに，先回報告10）したS.epidermidisに引き続き，S.aureusバイオフィルム形成菌に対する抗菌点眼薬の殺菌効果を検討した．すなわち，2011年から2012年に鳥取大学医学部附属病院の眼感染症患者から分離されたS.aureusのうち，icaA,D遺伝子，薬剤感受性などを検討した3株を用いてinvitroバイオフィルム形成に及ぼすグルコースの影響を調べるとともに，トスフロキサシン，レボフロキサシンおよびセフメノキシム各点眼液の殺菌効果を検討した．I実験材料および方法1.使用菌株鳥取大学医学部附属病院の眼感染症患者から2011.2012年に分離されたS.aureus31株を用いた．これら分離株すべてについて，各種薬剤に対する感受性，キノロン薬耐性決定領域（quinoloneresistant-determiningregion：QRDR）遺伝子の変異およびicaA,D遺伝子の有無を調べた．2.QRDR遺伝子およびicaA，icaD遺伝子の解析DNAジャイレースおよびトポイソメラーゼIV蛋白のそれぞれのsubunitA蛋白，GyrAならびにGrlAのQRDR部位をcodeするgyrA，grlA遺伝子の主要な変異部位の解析（GyrA：Ser84,Ser85,Glu88.GrlA：Ser80,Glu84）をSreedharanら16），Ferreroら17）の報告に基づいたPCR（polymerasechainreaction）法で行った．また，バイオフィルム形成に関連するslimeの主要成分，polysaccharideintercellularadhesin（PIA）の生合成に関わるicaA，icaD遺伝子の有無をArciolaら18）の方法に基づき検討した．3.使用薬剤薬剤感受性の測定にはトスフロキサシン（富山化学工業株式会社），レボフロキサシン（LKTLaboratories,Inc），セフメノキシム（ベストコールR静注用，武田薬品工業株式会社）を用いた．また，S.aureusのメチシリン耐性の判別のため，オキサシリン（シグマアルドリッチジャパン株式会社）を使用した．Invitroバイオフィルム形成菌およびplanktonic菌に対する殺菌効果の検討には市販のトスフロキサシン点眼液（オゼックスR点眼液0.3％，大塚製薬株式会社），レボフロキサシン点眼液（クラビットR点眼液0.5％，参天製薬株式会社），セフメノキシム点眼液（ベストロンR点眼用0.5％，千寿製薬株式会社）を目的の作用濃度になるよう25％cation-572あたらしい眼科Vol.31，No.4，2014（94）adjustedMueller-Hintonbroth（CAMHB；日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）で適宜希釈し用いた．いずれの薬剤も純度あるいは含量が明らかなものを使用し，濃度は活性本体の値として示した．4.薬剤感受性の測定抗菌薬に対する感受性の測定にはCAMHBを用い，ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute（CLSI）の微量液体希釈法に基づき行った19）．メチシリンに対する感受性/耐性はCLSIの判定基準に基づき，オキサシリンに対する最小発育阻止濃度（MIC）（≦2μg/ml：感受性，≧4μg/ml：耐性）によって分類した20）．また，キノロン薬に対する感受性/耐性は同判定基準に基づき，レボフロキサシンに対するMIC（≦1μg/ml：感受性，≧4μg/ml：耐性）によって分類した．5.Planktonic菌に対する抗菌点眼薬の殺菌効果今回使用の臨床分離S.aureus31株のうち，キノロン感受性でicaA,icaD遺伝子を保有するメチシリン感受性S.aureus（methicillin-susceptibleS.aureus：MSSA）のF5820およびF-5829株，メチシリン耐性S.aureus（methicillin-resistantS.aureus：MRSA）のF-5809株を用いた（表1）．CAMHBにて37℃で一夜培養した菌を新鮮なCAMHBに接種し，さらに4時間前培養した菌液0.5mlに，リン酸緩衝液（PB：1/15mol/l,pH7.0）で5倍濃度に調整した各薬液1ml（終濃度，30MIC），10％グルコース溶液5μlまたは50μl（グルコース終濃度，0.01％または0.1％）を加え，PBで全量5mlにした培養液（CAMHB濃度：通常の10％濃度）を作製した．37℃で振盪培養し，24時間後に生菌数測定を行った（n＝1）．対照として薬剤不含の同様な10％CAMHB5mlを用い，生菌数を測定した．6.Invitroバイオフィルムの作製とグルコースの影響Planktonic菌に対する殺菌効果の試験に用いたMSSAのF-5820およびF-5829とMRSAのF-5809株の3株で検討した．Websterら21）の方法に基づき，CAMHBで一夜培養したS.aureusの菌液100μlを新鮮なCAMHB10mlに接種し，さらに3.5時間培養した．本菌液100μlを0.01％または0.1％グルコースを含み，通常の10％培地成分濃度になるよう作製したCAMHB10mlに懸濁した．その25μlを0.01％および0.1％のグルコースを含んだ10％培地成分濃度のMueller-Hintonagar（MHA,日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）を平板上に置いたmembranefilter（MF,DuraporeRMembraneFilter0.45μmHV；Millipore）に滴下した（n＝3）．グルコース濃度0.01％は健常人涙液中濃度，0.1％は糖尿病患者涙液中に含まれるグルコース濃度に近似すると考え検討した13.15）．なお，別にバイオフィルム形成に及ぼす詳細なグルコース濃度（0，0.01，0.1および1％）の影響はMSSAF-5820株を用い調べた．（95）37℃，48時間培養後，走査型電子顕微鏡（SEM：HITACHIS-3400）を用いてバイオフィルム像を観察した．SEM像の観察に当たっては，試料を1.5％glutaraldehyde（和光純薬工業株式会社）にて1時間，さらに1％osmiumtetroxide（TAABLaboratories）に18時間浸漬し固定した．アルコール脱水-酢酸イソアミル（和光純薬工業株式会社）置換を経た後，臨界点乾燥を行った試料を白金-パナジウム蒸着した．7.Invitroバイオフィルム形成菌に対する抗菌点眼薬の殺菌効果0.01％あるいは0.1％グルコースを含む10％培地成分濃度のMHA上に静置したMFに菌液を滴下し，37℃，24時間培養した後，MFを各薬剤30MICを含む新しいMHA上に移した．さらに37℃，24時間培養した後，生菌数を測定した．作用濃度（30MIC）はトスフロキサシン頻回反復点眼時の結膜.内濃度などを参考にした22）．なお，MRSAF-5809株の場合はセフメノキシム点眼液の溶解必要濃度が高すぎることから薬剤含有MHAが作製できず，トスフロキサシン点眼液とレボフロキサシン点眼液のみで殺菌効果を検討した．生菌数の測定に当たっては上述のMFをMulti-BeadsShockerR（安井器械株式会社）で破砕，ホモジナイズした試料を適宜希釈し，MHA平板に塗布し，生育コロニー数を計測した．得られた生菌数は各比較群間でパラメトリックDunnett型多重比較による有意差検定を行った．また，SEMでバイオフィルムに対する薬剤作用像を観察した．II結果1.使用菌株の各種抗菌薬に対する感受性，GyrAおよびGrlA蛋白におけるQRDR部位のアミノ酸変異，icaA，icaD遺伝子の解析S.aureus31株に対するトスフロキサシンとレボフロキサシン，またはセフメノキシムとのMIC相関図を図1に示す．トスフロキサシンは試験株すべてに対し，レボフロキサシンおよびセフメノキシムと同等か，2.512倍以上強い抗菌活性を示した．31株中，MRSAは22株（71.0％），キノロン耐性S.aureusは18株（58.1％）であった．また，キノロン耐性S.aureus18株のQRDR部位における最も頻度の高い変異株はGyrAのSer84Leu,Glu88Gly変異およびGrlAのSer80Tyr,Glu84Lys変異を同時に保有する株であった（7株/18株，38.9％）．icaA,icaD遺伝子については今回使用した眼由来臨床分離株は31株すべて両遺伝子を保有していた．バイオフィルム形成菌に対する殺菌効果の検討に使用した3菌株の各遺伝子の解析および薬剤感受性の結果を表1に示す．GyrA，GrlAのQRDR主要部位に変異は認められず，キノロン薬に感受性で，MICはトスフロキサシンが0.0313あたらしい眼科Vol.31，No.4，2014573トスフロキサシMIC（μg/ml）≧1684210.50.250.1250.06≦0.03111136311114315533≦0.030.1250.528≦0.030.1250.5280.060.2514≧160.060.2514≧16レボフロキサシンMIC（μg/ml）セフメノキシムMIC（μg/ml）図1Staphylococcusaureus31株に対するトスフロキサシンとレボフロキサシン，またはセフメノキシムとのMIC相関図相関図中の数値は株数．いずれの株もトスフロキサシンのMICはレボフロキサシン，セフメノキシムのMICと同等か，低かった．表1使用菌株の各種抗菌薬に対する感受性，icaA，icaD遺伝子の有無，およびGyrA，GrlAのアミノ酸変異菌株トスフロキサシンMIC（μg/ml）レボフロキサシンセフメノキシムオキサシリンicaA，icaD遺伝子の有無icaAicaDQRDRアミノ酸変異GyrASer84,Ser85,Glu88GrlASer80,Glu84F-58200.06250.2520.5＋＋──F-58290.03130.12521＋＋──F-58090.06250.25832＋＋──＋/─：検出/非検出．μg/mlあるいは0.0625μg/ml，レボフロキサシンは0.125μg/mlあるいは0.25μg/mlであった．また，F-5820およびF-5829株はMSSA，F-5809株はMRSAであり，セフメノキシムのMICは前2株が2μg/ml，F-5809株は8μg/mlであった（表1）．2.Planktonic菌に対する抗菌点眼薬の殺菌効果Planktonic菌に対する薬剤30MIC，24時間作用後の生菌数を図2に示す．いずれの薬剤も30MIC作用後の生菌数は薬剤無添加の場合に比べ，10.6以上減少し，検出限界以下（LogCFU/ml：≦1.30）であった（図2）．3.Invitroバイオフィルム形成に及ぼすグルコースの影響MSSAF-5820株において，培地にグルコースを0.01％，0.1％，1％濃度になるよう添加し，バイオフィルム形成能をグルコース無添加の場合と比較した結果，培養48時間後の成熟度は濃度依存的に増大した．バイオフィルム形成能は0.01％添加から影響がみられたが，0.1％，1％添加時にはMF構造に沿って多くのslime様物質が付着し，これらに覆われた球菌の数も多かった（図3）．4.Invitroバイオフィルム形成菌に対する抗菌点眼薬の殺菌効果バイオフィルムを形成した各株に対する抗菌点眼薬30MIC，24時間作用後の生菌数を図4に示す．グルコース0.01％存在下，MSSAF-5820株におけるトスフロキサシン点眼液30MICの24時間作用時の殺菌効果は，同MIC濃度のレボフロキサシン点眼液と同等，セフメノキシム点眼液より有意（p＜0.001）に強かった．グルコース0.1％存在下での24時間作用時の殺菌効果は，同MIC濃度のレボフロキサシンおよびセフメノキシム点眼液より有意（p＜0.001）に強かった．また，グルコース0.01％と0.1％存在下での殺菌効果を比較すると，トスフロキサシンおよびセフメノキシム点眼液では差異がみられなかったが，レボフロキサシン点眼液では，0.1％存在下の殺菌効果は0.01％の場合より有意（p＜0.001）に弱かった．グルコース0.01％存在下，MSSAF-5829株におけるトスフロキサシン点眼液30MICの24時間作用時の殺菌効果は，同MIC濃度のレボフロキサシン点眼液およびセフメノキシム点眼液より有意（p＜0.001）に強かった．また，グルコース0.1％存在下での24時間作用時の殺菌効果は，同MIC濃574あたらしい眼科Vol.31，No.4，2014（96）Glucose0.01％Glucose0.1％Viablecellscount（LogofCFU/ml）108642010864201086420F-5820MSSAF-5829MSSAF-5809MRSANT108642010864201086420F-5820MSSAF-5829MSSAF-5809MRSANT検出限界（≦1.30）ControlトスフロキサシンレボフロキシサンセフメノキシムControlトスフロキサシンレボフロキシサン点眼液点眼液点眼液点眼液点眼液図2Staphylococcusaureusのplanktonic菌に対する各種抗菌点眼薬の殺菌効果NT：試験せず．Planktonic菌に対してはいずれの点眼液も強い殺菌効果を示した．セフメノキシム点眼液度のレボフロキサシンおよびセフメノキシム点眼液より有意（p＜0.001）に強かった．また，グルコース0.01％あるいは0.1％存在下での殺菌効果はセフメノキシム点眼液では差異がなかったが，トスフロキサシンおよびレボフロキサシン点眼液では，0.1％存在下のほうが0.01％の場合より有意（p＜0.01，p＜0.001）に弱かった．グルコース0.01％および0.1％存在下，MRSAF-5809株におけるトスフロキサシン点眼液30MICの24時間作用時の殺菌効果は，同MIC濃度のレボフロキサシン点眼液より有意（p＜0.01）に強かった．また，トスフロキサシンおよびレボフロキサシン点眼液ともに，グルコース0.1％での殺菌効果は0.01％の場合より有意（p＜0.01，p＜0.001）に弱かった．5.MSSAF.5820株が形成したinvitroバイオフィルムに対する抗菌点眼薬の作用像0.1％グルコース存在下，invitroでMSSAF-5820株が形成したバイオフィルムに対する各点眼液30MIC作用時のSEM像を図5に示す．セフメノキシム点眼液作用後のバイオフィルム像（図5G，図5H）は薬剤無添加群（図5A，図5B）とほぼ同様であった．トスフロキサシン点眼液作用時（図5C，図5D）では，バイオフィルム構造の消失や，これを構成する菌塊構造の軽度化が観察された．レボフロキサシ（97）ン点眼液の場合は薬剤無添加群に比べ，低倍でバイオフィルム構造が若干消失した像が観察されたが，バイオフィルム上部の菌塊構造の厚みの変化はトスフロキサシン点眼液作用時より小さかった（図5E，図5F）．なお，今回の試験では，他の2株でもMSSAF-5820株と同様なバイオフィルム形成像，また各抗菌点眼薬作用像がSEMで観察された（データ示さず）．III考按結膜.における検出菌の分離比率はS.epidermidisが最も高いが，糖尿病患者では本菌種に次いでS.aureusの比率が健常人より高いとの報告がある4）．眼感染症ではバイオフィルム形成菌がその発症に関与することが報告されており，S.aureusやS.epidermidisもコンタクトレンズ，眼内レンズ，手術時縫合糸，涙道形成用チューブ等の医療材料に付着してバイオフィルムを形成することが知られている5,6）．近年，眼感染症においては，Staphylococcus属以外にも，Pseudomonasaeruginosa（P.aeruginosa）などによるバイオフィルム形成が臨床的に問題となっているが，さまざまな菌種でバイオフィルム形成菌はその成熟度によって抗菌薬の殺菌作用が影響を受けることが報告されている8,9）．S.aureusではバイオフィルムの成熟度は生育環境に存在するグルコーあたらしい眼科Vol.31，No.4，2014575ABCDEFGHIJKLIJKABCDEFGHIJKLIJK図3StaphylococcusaureusF.5820株のバイオフィルム形成に及ぼすグルコースの影響培養時間：48時間，A,E,I：glucose0％，×100,×3,000,×10,000，B,F,J：glucose0.01％，×100,×3,000,×10,000，C,G,K：glucose0.1％，×100,×3,000,×10,000，D,H,L：glucose1％，×100,×3,000,×10,000．グルコース0.1％，1％添加時には多くのslime様物質が産生され，これに覆われた球菌の数も多かった．スの影響を受け，濃度依存的にその成熟度が増大するとの報告がある11,12）．糖尿病患者の涙液中グルコース（tearglucose）濃度は健常人に比べ高く，正常人では0.004.0.008％であるのに対し，糖尿病患者ではこれより5.10倍以上高く，0.03.0.13％以上含まれると報告されている13.15）．また，糖尿病患者では急性結膜炎を含む各種細菌感染症のリスクが高いこと，網膜症，白内障など，さまざまな眼の組織における病態に高血糖が悪影響を与えるとの報告がある23,24）．これらのことから，糖尿病患者では眼表面や眼内に定着したS.aureusがバイオフィルムを形成する場合，その成熟度が増し，抗菌点眼薬の殺菌作用が何らかの影響を受ける可能性が考えられ，今回の検討を行った．眼感染症由来S.aureusのバイオフィルム形成に及ぼすグルコースの影響をSEMで形態観察した報告や，バイオフィルム形成菌に対する抗菌点眼薬の殺菌効果などを検討した報告はこれまでなかった．今回，眼感染症由来S.aureusのinvitroバイオフィルム形成に及ぼすグルコースの影響を調べた結果，これまでの報告11,12）に記述されているようにその成熟度はグルコース濃度の影響を受けており，糖尿病患者の涙576あたらしい眼科Vol.31，No.4，2014液中グルコース濃度に想定した0.1％添加時では，無添加時に比べ，slime様物質が多く産生され，これらがMF構造や菌体表面に付着したバイオフィルム像が観察された．S.epidermidisではPIAの生合成はica遺伝子locusが関連し，icaA,DはN-acetylgulcosaminetransferase，icaBはPIAdeacetylase，icaCはPIAのexporter遺伝子とされ25），ソフトコンタクトレンズ装用者における急性結膜炎患者から分離されたブドウ球菌ではicaA，D遺伝子保有率が高いとの報告がある26）．しかしながら，S.aureusではicaA，D遺伝子はほとんどすべての株が保有しており，本遺伝子のバイオフィルム形成時における意義は両菌種で異なる可能性が考えられた．Izanoら27）はブドウ球菌属のバイオフィルムにおける主要な2つの構成ポリマーはPIAとextracellularDNA（ecDNA）であり，S.aureusではPIAがバイオフィルムの主要な構成成分ではなく，ecDNAがその主成分としている．また，別の報告でS.aureusの臨床株ではグルコースが調節するバイオフィルム形成はicaADBC遺伝子の発現に関係しないとされ，同じブドウ球菌属ながら，バイオフィルム形成，発現様式について違いが存在する可能（98）Glucose0.01％Glucose0.1％Viablecellscount（LogofCFU/MF）109876510987651098765F-5820MSSA10＊＊＊98765＊＊＊NS†††＊＊＊F-5820MSSA＊＊＊＊＊＊F-5829MSSA†††††＊＊＊1098765F-5829MSSA＊＊＊F-5809MRSAF-5809MRSA10＊＊＊＊98†††††76NTNT5ControlトスフロキサシンレボフロキシサンセフメノキシムControlトスフロキサシンレボフロキシサンセフメノキシム点眼液点眼液点眼液点眼液点眼液点眼液図4Staphylococcusaureusのinvitroバイオフィルム形成菌に対する各種抗菌点眼薬の殺菌効果薬剤作用時間：24時間，n＝3,有意差：＊＊＊：p＜0.001，＊＊：p＜0.01vs.トスフロキサシン点眼液，†††：p＜0.001，††：p＜0.01vs.0.1％glucose,NS：notsignificant,（Dunnetttest），NT：試験せず，MF：membranefilter0.1％グルコース存在下では，いずれの場合もトスフロキサシン点眼液は同じ30MIC濃度で比較したレボフロキサシンあるいはセフメノキシム点眼液より有意に強い殺菌効果を示した．性があり，現在，詳細は明らかでない28）．眼感染症由来S.aureusはレボフロキサシン，セフメノキシムに対する感受性が高い1）．今回の使用菌株に対する抗菌活性はトスフロキサシンがレボフロキサシン，セフメノキシムと同等か，2.512倍以上強く，2009年分離の外眼部感染症由来S.aureusの成績とほぼ同様であった29）．現在S.aureusのバイオフィルム形成菌に対するこれら抗菌点眼薬の殺菌効果に関する成績は見当たらない．そこでinvitroバイオフィルムを作製し，汎用されている市販抗菌点眼薬，トスフロキサシン，レボフロキサシンおよびセフメノキシム各点眼液の殺菌効果を検討した．トスフロキサシンについては健康成人男子を対象に1回1滴，1日8回14日間点眼し，結膜.内濃度を測定した成績があり，点眼14日目の初回点眼24時間後の濃度は2.0±2.69μg/mlであったとの報告がある22）．この24時間値（約2.0μg/ml）は今回invitroでバイオフィルムを作製したS.aureus3株に対するトスフロキサシンのMIC値（0.0313μg/mlおよび0.0625μg/ml）の約32あるいは64倍に相当する．このことから，作用濃度および作用時間はいずれの点眼液も30MIC，24時間とした．その結果，0.01％グルコース存在下では，invitroでバイ（99）オフィルムを形成したS.aureusに対し，トスフロキサシン点眼液はMSSAF-5820株では，レボフロキサシン点眼液と同等，MSSAF-5829株，MRSAF-5809株ではレボフロキサシンあるいはセフメノキシム点眼液より有意に強い殺菌効果を示した．0.1％グルコース存在下では，いずれの場合もトスフロキサシン点眼液は同MIC濃度で比較したレボフロキサシンあるいはセフメノキシム点眼液より有意に強い殺菌効果を示し，SEMによる形態観察でも，MSSAF-5820株のバイオフィルム形成菌に対し，トスフロキサシン点眼液作用時，強い殺菌像が観察された．また，フルオロキノロン系抗菌点眼薬の殺菌効果はMSSAF-5820株バイオフィルムに対するトスフロキサシン点眼液の場合を除き，いずれも糖尿病患者の涙液中グルコース濃度を想定した0.1％グルコース存在下のほうが0.01％グルコース存在下より弱く，バイオフィルムの成熟度がフルオロキノロン系抗菌点眼薬の殺菌効果に影響を及ぼす可能性が考えられた．バイオフィルムを形成した細菌がplanktonic菌に比べ抗菌薬抵抗性を示すこと，また，その抵抗性には薬剤系統差があることが知られている8）．S.aureusにおいてフルオロキノロン系抗菌薬レボフロキサシンはplanktonic菌よりバイあたらしい眼科Vol.31，No.4，2014577ABCDEFGHABCDEFGHABCDEFGHABCDEFGH図5StaphylococcusaureusF.5820株が形成したinvitroバイオフィルム形成菌に対する各種抗菌点眼薬作用時の走査型電子顕微鏡像A,B：control,×100,×3,000，C,D：トスフロキサシン点眼液，×100,×3,000，E,F：レボフロキサシン点眼液，×100,×3,000，G,H：セフメノキシム点眼液，×100,×3,000．低倍率でもトスフロキサシン点眼液の作用により，バイオフィルム構造の大部分が消失している像が観察された．オフィルム形成菌に対する殺菌効果が弱いとの報告があム形成菌に対する殺菌作用では，フルオロキノロン系抗菌る30）．今回の試験でもplanktonic菌に比べ，バイオフィル薬，アミノ配糖体系抗菌薬，b-ラクタム系抗菌薬の順に強ムを形成した菌に対する殺菌作用はいずれの薬剤も弱かっいことも報告されている8）．さらに，S.aureusのバイオフィた．薬剤系統差については，P.aeruginosaのバイオフィルルムにおける薬剤透過性はb-ラクタム系抗菌薬のオキサシ578あたらしい眼科Vol.31，No.4，2014（100）リン，セフォタキシム，またグリコペプチド薬であるバンコマイシンより，アミノ配糖体のアミカシンやフルオロキノロン系抗菌薬のシプロフロキサシンのほうが良好との報告がある31）．これらのことから，S.aureusのバイオフィルム形成菌に対しては，b-ラクタム系抗菌薬よりもフルオロキノロン系抗菌薬を，また，そのなかでも目標とする菌種に対して，より強い抗菌活性を示すフルオロキノロン系抗菌薬を選択すべきと考えられた．今回の成績は，先に報告10）したS.epidermidisのバイオフィルム形成菌における結果と近似しており，殺菌効果はb-ラクタム系点眼薬よりフルオロキノロン系点眼薬が強いが，その効果はフルオロキノロン系点眼薬間でも差異が認められる点では同様の成績が得られた．術後感染症としての眼内炎の起因菌は60％以上をStaphylococcus属が占める．S.epidermidisの比率が最も高いものの，MRSAを含むS.aureusが起因菌の場合も多い3）．眼内炎は重篤な感染症であり，手術前後に眼瞼および結膜.内を十分殺菌することが重要である．フルオロキノロン系点眼薬の周術期における無菌化率は高く，トスフロキサシン点眼液の場合も手術14日後に判定した術後感染症の発症は全例（108例）において認めず，また，術後無菌化率は95.1％で，類薬と同程度であった32,33）．これらの成績におけるバイオフィルム形成菌関与の程度は不明であるが，そのような場合にも殺菌効果が十分期待できる抗菌点眼薬の使用が望ましいことから，その選択には十分な配慮が必要と考えられた．以上，トスフロキサシン点眼液はレボフロキサシン点眼液およびb-ラクタム系のセフメノキシム点眼液より，バイオフィルムを形成したS.aureusに強い殺菌効果を示した．トスフロキサシン点眼液はバイオフィルムを形成したキノロン感受性S.aureusによる眼感染症の治療，予防において有用と考えられた．利益相反：高畑正裕（カテゴリーE：富山化学工業株式会社社員），髙倉真理子（カテゴリーE：富山化学工業株式会社社員）文献1）小早川信一郎，井上幸次，大橋裕一ほか：細菌性結膜炎における検出菌・薬剤感受性に関する5年間の動向調査（多施設共同研究）．あたらしい眼科28：679-687,20112）DurandML：Endophthalmitis.ClinMicrobiolInfect19：227-234,20133）薄井紀夫，宇野敏彦，大木孝太郎ほか：白内障に関連する術後眼内炎全国症例調査．眼科手術19：73-79,20064）BilenH,AtesO,AstamNetal：Conjunctivalflorainpatientswithtype1ortype2diabetesmellitus.AdvTher24：1028-1035,20075）亀井裕子：眼感染症とバイオフィルム．臨床と微生物36：439-444,20096）BehlauI,GilmoreMS：Microbialbiofilmsinophthalmologyandinfectiousdisease.ArchOphthalmol126：15721581,20087）KodjikianL,BurillonC,LinaGetal：Biofilmformationonintraocularlensesbyaclinicalstrainencodingtheicalocus：ascanningelectronmicroscopystudy.InvestOphthalmolVisSci44：4382-4387,20038）SpoeringAL,LewisK：BiofilmsandplanktoniccellsofPseudomonasaeruginosahavesimilarresistancetokillingbyantimicrobials.JBacteriol183：6746-6751,20019）AmorenaB,GraciaE,MonzonMetal：AntibioticsusceptibilityassayforStaphylococcusaureusinbiofilmsdevelopedinvitro.JAntimicrobChemother44：43-55,199910）井上幸次，池田欣史，藤原弘光ほか：眼感染症由来Staphylococcusepidermidisが形成したInVitroバイオフィルムに対するトスフロキサシン点眼液の殺菌効果．あたらしい眼科29：1681-1688,201211）LimY,JanaM,LuongTTetal：Controlofglucose-andNaCl-inducedbiofilmformationbyrbfinStaphylococcusaureus.JBacteriol186：722-729,200412）CroesS,DeurenbergRH,BoumansMLetal：StaphylococcusaureusbiofilmformationatthephysiologicglucoseconcentrationdependsontheS.aureuslineage.BMCMicrobiol9：229,200913）SenDK,SarinGS：Tearglucoselevelsinnormalpeopleandindiabeticpatients.BrJOphthalmol64：693-695,198014）DaumKM,HillRM：Humantearglucose.InvestOphthalmolVisSci22：509-514,198215）ChatterjeePR,DeS,DattaHetal：Estimationoftearglucoselevelanditsroleasapromptindicatorofbloodsugarlevel.JIndianMedAssoc101：481-483,200316）SreedharanS,OramM,JensenBetal：DNAgyrasegyrAmutationsinciprofloxacin-resistantstrainsofStaphylococcusaureus：closesimilaritywithquinoloneresistancemutationsinEscherichiacoli.JBacteriol72：72607262,199017）FerreroL,CameronB,ManseBetal：CloningandprimarystructureofStaphylococcusaureusDNAtopoisomeraseIV：aprimarytargetoffluoroquinolones.MolMicrobiol13：641-653,199418）ArciolaCR,BaldassarriL,MontanaroL：PresenceoficaAandicaDgenesandslimeproductioninacollectionofstaphylococcalstrainsfromcatheter-associatedinfections.JClinMicrobiol39：2151-2156,200119）ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute：MethodsforDilutionAntimicrobialSusceptibilityTestsforBacteriaThatGrowAerobically；ApprovedStandard-EighthEditionM07-A8,ClincalandLaboratoryStandardsInstitutes,Wayne,PA,200920）ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute：PerformanceStandardsforAntimicrobialSusceptibilityTesting；NineteenthInformationalSupplementM100-S22,201221）WebsterP,WuS,GomezGetal：Distributionofbacterialproteinsinbiofilmsformedbynon-typeableHaemophilusinfluenzae.JHistochemCytochem54：829-842,2006（101）あたらしい眼科Vol.31，No.4，201457922）北野周作，宮永嘉隆，東純一：新規ニューキノロン系抗菌点眼薬トシル酸トスフロキサシン点眼液の臨床薬理試験（単回・反復および頻回反復点眼試験）．あたらしい眼科23（別巻）：47-54,200623）KruseA,ThomsenRW,HundborgHHetal：Diabetesandriskofacuteinfectiousconjunctivitis─apopulation-basedcase-controlstudy.DiabetMed23：393-397,200624）SkarbezK,PriestleyY,HoepfMetal：Comprehensivereviewoftheeffectsofdiabetesonocularhealth.ExpertRevOphthalmol5：557-577,201025）OttoM：Staphylococcalbiofilms.CurrTopMicrobiolImmunol322：207-228,200826）CatalanottiP,LanzaM,DelPreteAetal：Slime-producingStaphylococcusepidermidisandS.aureusinacutebacterialconjunctivitisinsoftcontactlenswearers.NewMicrobiol28：345-354,200527）IzanoEA,AmaranteMA,KherWBetal：Differentialrolesofpoly-N-acetylglucosaminesurfacepolysaccharideandextracellularDNAinStaphylococcusaureusandStaphylococcusepidermidisbiofilms.ApplEnvironMicrobiol74：470-476,200828）FitzpatrickF,HumphreysH,O’GaraJP：EvidenceforicaADBC-independentbiofilmdevelopmentmechanisminmethicillin-resistantStaphylococcusaureusclinicalisolates.JClinMicrobiol43：1973-1976,200529）末信敏秀，石黒美香，松崎薫ほか：細菌性外眼部感染症分離菌株のGatifloxacinに対する感受性調査．あたらしい眼科28：1321-1329,201130）MurilloO,DomenechA,GarciaAetal：Efficacyofhighdosesoflevofloxacininexperimentalforeign-bodyinfectionbymethicillin-susceptibleStaphylococcusaureus.AntimicrobAgentsChemother50：4011-4017,200631）SinghR,RayP,DasAetal：PenetrationofantibioticsthroughStaphylococcusaureusandStaphylococcusepidermidisbiofilms.JAntimicrobChemother65：1955-1958,201032）秦野寛，大野重昭，北野周作：トスフロキサシン点眼液による眼科周術期の無菌化療法．眼科手術23：314-320,201033）大橋裕一，秦野寛，張野正誉ほか：ガチフロキサシン点眼液の眼科周術期の無菌化療法．あたらしい眼科22：267-271,2005＊＊＊580あたらしい眼科Vol.31，No.4，2014（102）

各種抗アレルギー点眼薬の含水性ソフトコンタクトレンズの含水率に及ぼす影響

admin — Thu, 29 Nov 2012 15:24:07 +0000

《原著》あたらしい眼科29（11）：1545.1547，2012c各種抗アレルギー点眼薬の含水性ソフトコンタクトレンズの含水率に及ぼす影響佐野研二＊1,2工藤寛之＊3三林浩二＊3望月學＊2＊1あすみが丘佐野眼科＊2東京医科歯科大学大学院医歯学総合研究科眼科学分野＊3東京医科歯科大学生体材料工学研究所センサ医工学分野InfluencesofAnti-AllergyEyedropsonWaterContentofHydrophilicSoftContactLensesKenjiSano1,2）,HiroyukiKudo3）,KohjiMitsubayashi3）andManabuMochizuki2）1）AsumigaokaSanoEyeClinic,2）DepartmentofOphthalmologyandVisualScience,TokyoMedicalandDentalUniversity,3）DepartmentofBiomedicalDevicesandInstrumentation,InstituteofBiomaterialsandBioengineering,TokyoMedicalandDentalUniversityソフトコンタクトレンズ（SCL）上からの点眼の影響について調べるため，イオン性SCLと非イオン性SCLを抗アレルギー点眼薬に浸漬した後の含水率の変化を測定した．クロモグリク酸ナトリウム，トラニラスト，アシタザノラスト，塩酸レボカバスチン点眼薬への浸漬後の含水率は，イオン性SCL（含水率58％）の場合，それぞれ，61.6±0.2％，67.1±0.3％，47.8±1.0％，53.3±0.4％で，非イオン性SCL（含水率69％）では，68.3±0.5％，61.9±0.3％，68.8±0.5％，67.5±0.5％であった．含水率の変化には点眼薬のpHや浸透圧が関係していた．SCL，特にイオン性SCLの上からの点眼は，レンズの形状，すなわちフィッティングに影響を与える可能性が示唆された．Toassesstheinfluenceofeyedropapplicationwithahydrophilicsoftcontactlens（SCL）inplace,wemeasuredchangesinwatercontentofionicandnon-ionicSCLsaftertheyweresoakedinanti-allergyeyedrops.Aftersoakinginsodiumcromoglicate,tranilast,levokabastinehydrochlorideoracitazanolasthydrateeyedrops,SCLwatercontentwas61.6±0.2％,67.1±0.3％,47.8±1.0％and53.3±0.4％inthecaseoftheionicSCLs（watercontent：58％）,and68.3±0.5％,61.9±0.3％,68.8±0.5％and67.5±0.5％inthecaseofthenon-ionicSCLs（watercontent：69％）,respectively.ThevariationsinwatercontentcanbeassociatedwitheyedroppHandosmoticpressure.TheseresultssuggestthateyedropinstillationwithSCLinplacemaychangeSCLshapeandfitting.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）29（11）：1545.1547,2012〕Keywords：イオン性ソフトコンタクトレンズ，非イオン性ソフトコンタクトレンズ，含水率，点眼薬，pH．ionichydrophilicsoftcontactlens,non-ionichydrophilicsoftcontactlens,watercontent,eyedrop,pH.はじめに以前，筆者らはイオン性ソフトコンタクトレンズ（SCL）の含水率が，消毒システムのソリューションのpHによって変化することを報告した1）．そこで，今回は，点眼薬によって，SCLの含水率がどのように変化するかを調べ，若干の知見を得たので報告する．I対象および方法点眼薬は，市販されている，クロモグリク酸ナトリウム2％点眼薬，トラニラスト0.5％点眼薬，0.1％アシタザノラスト水和物点眼薬，0.025％塩酸レボカバスチン点眼薬を用いた．つぎに，含水率58％のヒドロキシエチルメタクリレートとメタクリル酸の共重合体からなるイオン性SCL，および含水率69％のポリビニルアルコール製非イオン性SCLを生理的食塩水に浸した後，それぞれの点眼薬2.5mlに8時間浸漬し，ATAGO社製SCL用含水率計CL-2HおよびCL-2Lを用いて浸漬前後の含水率を3回ずつ測定した．また，それぞれの点眼薬のpHをHORIBA社製pHメーターtwinpHB-212を使用して3回測定した．〔別刷請求先〕佐野研二：〒267-0066千葉市緑区あすみが丘1-1-8あすみが丘佐野眼科Reprintrequests：KenjiSano,M.D.,Ph.D.,AsumigaokaEyeClinic,1-1-8Asumigaoka,Midori-ku,ChibaCity267-0066,JAPAN0910-1810/12/\100/頁/JCOPY（95）15451020607080前ムト物ン10206070801020607080前ムト物ン1020607080含水率（%）含水率（%）50504040303000図1イオン性SCLと点眼薬浸漬後の含水率II結果点眼薬浸漬前のSCLの含水率は，イオン性SCL（メーカー公表含水率58％）が59.0±0.2％，非イオン性SCL（メーカー公表含水率69％）が69.9±0.2％であった．イオン性SCLの点眼薬浸漬後の含水率は，クロモグリク酸ナトリウムで61.6±0.2％，トラニラストで67.1±0.3％と有意に上昇し，アシタザノラストと塩酸レボカバスチンでは，それぞれ47.8±1.0％，53.3±0.4％と有意に低下した（図1）（MannWhitneyのU検定p＜0.05）．一方，非イオン性SCLでは，クロモグリク酸ナトリウム，トラニラスト，アシタザノラスト，塩酸レボカバスチン点眼薬の順に68.3±0.5％，61.9±0.3％，68.8±0.5％，67.5±0.5％で，トラニラスト点眼薬で有意に低下した（図2）（Mann-WhitneyのU検定p＜0.05）．また，クロモグリク酸ナトリウム点眼薬，トラニラスト点眼薬，アシタザノラスト水和物点眼薬，塩酸レボカバスチン点眼薬のpHの実測値は，それぞれ，5.5±0，7.5±0，5.5±0，7.1±0であった．III考按以前，SCL消毒システムにおいて，消毒中のSCL含水率の経時変化を測定した際，今回と同じ材料のイオン性SCLにおいて，溶液が酸性時に含水率が下降し，アルカリ性時には含水率が上昇したため，この含水率の変化はイオン性材料内のメタクリル酸同士の帯電による反発の程度がpHに敏感に反応したためと考察した（図3）1）．今回の結果も，イオン性SCLにおけるアルカリ性のトラニラストでの含水率上昇，酸性のアシタザノラストの含水率低下，また，非イオン性SCLでのクロモグリク酸ナトリウム，アシタザノラスト，塩酸レボカバスチンで含水率が，ほとんど変わらなかったこ1546あたらしい眼科Vol.29，No.11，2012図2非イオン性SCLと点眼薬浸漬後の含水率ポアサイズCH3CH2CCH2CCH3COO－H＋反発COO－H＋図3メタクリル酸含有材料イオン性SCLによく使用されるメタクリル酸は，カルボキシル基同士が水素イオンを電離し，マイナスに帯電することにより反発しあって含水率を稼いでいる．酸性では電離の割合が低くなって反発が小さくなり，アルカリ性では電離の割合が高くなって反発が大きくなる．とは，メタクリル酸含有の有無と，そのpHによる帯電の程度の変化によるためと説明できた．しかし，その一方で，点眼薬のpHだけでは説明のできない結果もいくつか見受けられた．まず，イオン性SCLにおける酸性のクロモグリク酸ナトリウムにおける含水率上昇とアルカリ性の塩酸レボカバスチンにおける含水率低下についてであるが，クロモグリク酸ナトリウム，トラニラスト，アシタザノラスト水和物点眼薬，塩酸レボカバスチン点眼薬の生理的食塩水に対するメーカー公表浸透圧比が，それぞれ0.25，0.9.1.1，約1，2.8.3.8で，クロモグリク酸ナトリウムが低張方向に，また，塩酸レボカバスチンが高張方向に大きく外れており，浸透圧が含水率に影響を与えた可能性があった．高分子材料は架橋レベルを上げるほど硬くなり2），そのフレキシビリティは同じ材料であってもバラエティに富んでいる．今回，実験に用いたイオン性SCL材料は非常にフレキシビリティが高く，また，日常装用などで含水率が変化した後，マルチパーパスソリューションによる含水率回復が（96）図4アシタザノラスト水和物点眼薬浸漬後のイオン性SCL直径14.2mm（白矢印）から13.3mm（黒矢印）へ変化した．遅いことが報告されており3），硬く，高分子構造上しっかりとした非イオン性のポリビニルアルコール製SCLに比べて，浸透圧による含水率変化の後も，その影響が残ったためと考えた．つぎに，非イオン性SCLにおいて，浸透圧比が約1.0であるトラニラスト点眼薬で有意に低下したことについては，この点眼薬に添加されているホウ酸とポリビニルアルコールの親和性によるものと考えた．ポリビニルアルコールでは，その機械的性質や耐水性向上を目的として少量のホウ酸添加がしばしば行われ，ここでホウ酸は架橋剤として働き，この分子を介してポリマー同士が連結されることが報告されている4）．今回の実験は，SCL消毒システムのソリューションへの浸漬試験1）にならって行ったため，実際のSCL上からの点眼に比べると非常に厳しい条件下のものといえる．しかしながら，SCL材料と点眼薬の相互作用によっては，SCLの含水率変化，すなわち形状変化を起こす可能性が示唆され（図4，5），今後，筆者らは臨床上，SCL上からの点眼がフィッ図5トラニラスト点眼薬浸漬後のイオン性SCL直径14.2mm（白矢印）から15.2mm（黒矢印）へ変化した．ティングに影響を与えるか否かについて，詳細に検討していく必要がある．本論文の内容は第110回日本眼科学会総会で発表した．文献1）佐野研二：イオン性素材─何が問題なのか─．あたらしい眼科17：917-921,20002）佐野研二，所敬，鈴木禎ほか：フッ素系非含水性ソフトコンタクトレンズ用素材の研究．日コレ誌36：196200,19943）CabreraJV,VelascoMJ：Recoveryofthewatercontentofhydrogelcontactlensesafteruse.OphthalmicPhysiolOpt25：452-457,20054）山田和彦，安藤慎治，清水禎：高磁場固体NMR法を用いたポリビニルアルコールにおけるホウ酸架橋構造の解析．PolymerPreprints,JapanVol60,No1：654,2011＊＊＊（97）あたらしい眼科Vol.29，No.11，20121547

1.5％レボフロキサシン点眼薬と0.5％レボフロキサシン点眼薬のPostantibiotic Bactericidal Effect 比較

admin — Fri, 29 Jun 2012 15:33:57 +0000

《原著》あたらしい眼科29（6）：854.858，2012c1.5％レボフロキサシン点眼薬と0.5％レボフロキサシン点眼薬のPostantibioticBactericidalEffect比較砂田淳子＊1,2上田安希子＊1坂田友美＊1木村圭吾＊1松村美奈子＊1西功＊1豊川真弘＊1東口依子＊1大橋裕一＊3浅利誠志＊4岩谷良則＊2＊1大阪大学医学部附属病院医療技術部＊2大阪大学大学院医学系研究科保健学専攻生体情報科学講座＊3愛媛大学医学部眼科学教室＊4大阪大学医学部附属病院感染制御部ComparisonofPostantibioticBactericidalEffectof1.5％Levofloxacinand0.5％LevofloxacinEyedropsAtsukoSunada1,2）,AkikoUeda1）,TomomiSakata1）,KeigoKimura1）,MinakoMatsumura1）,IsaoNishi1）,MasahiroToyokawa1）,YorikoHigashiguchi1）,YuichiOhashi3）,SeishiAsari4）andYoshinoriIwatani2）1）DepartmentofMedicalTechnology,OsakaUniversityHospital,2）DepartmentofBiomedicalInformatics,DivisionofHealthSciences,OsakaUniversityGraduateSchoolofMedicine,3）DepartmentofOphthalmology,EhimeUniversitySchoolofMedicine,4）DepartmentofInfectionControlandPrevention,OsakaUniversityHospitalPharmacokinetic/Pharmacodynamic（PK/PD）理論に基づき新たに開発された高濃度ニューキノロン系抗菌点眼薬1.5％レボフロキサシン（LVFX）点眼薬および従来品である0.5％LVFX点眼薬と菌との短時間接触後の殺菌効果（postantibioticbactericidaleffect：PABE）の比較を行った．被検菌は感染性角膜炎の患者より分離された臨床分離株30株（Staphylococcus属：10株，Streptococcus属：10株，Corynebacterium属：10株）を用い，両点眼薬のPABE測定および解析を行った．0.5％LVFX点眼薬に比し1.5％LVFX点眼薬がPABE評価値の1段階以上の上昇を認めたのは，Staphylococcus属で60％，Streptococcus属で60％およびCorynebacterium属で70％であった．今回測定した3菌種においてPABE評価値の分布パターンは菌種ごとに異なっていたが，3菌種のいずれにおいても0.5％LVFX点眼薬よりも1.5％LVFX点眼薬でより強い殺菌効果が認められたことより，1.5％LVFX点眼薬は0.5％LVFX点眼薬に比しPABEの優れた薬剤であることが確認された．Weconductedacomparisonstudyoflevofloxacin1.5％and0.5％eyedropsregardinginvitropostantibioticbactericidaleffect（PABE）.Levofloxacin1.5％isarecentlydevelopedhigh-concentrationantimicrobialquinoloneeyedropbasedonthePharmacokinetic/Pharmacodynamictheory.ThePABEsfor30clinicalbacteriaisolates（10isolateseachofStaphylococcusspp.,Streptococcusspp.andCorynebacteriumspp.）wereexaminedafter4minutesofexposuretobotheyedroptypes.Levofloxacin1.5％eyedrops,incomparisontolevofloxacin0.5％,showedariseofmorethanonePABEevaluationvaluein60％ofStaphylococcusspp.,60％ofStreptococcusspp.and70％ofCorynebacteriumspp.Inthisstudy,althougheachbacterialstrainhadadistinctdistributionpatternfortheevaluatedvalue,levofloxacin1.5％eyedropsexhibitedstrongereffectthanlevofloxacin0.5％eyedropsagainstthreestrains,confirmingthatlevofloxacin1.5％PABEissuperiortothatoflevofloxacin0.5％.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）29（6）：854.858,2012〕Keywords：レボフロキサシン（LVFX），postantibioticbactericidaleffect（PABE），postantibioticeffect（PAE），点眼薬．levofloxacin,postantibioticbactericidaleffect（PABE）,postantibioticeffect（PAE）,eyedrop.はじめに（Pharmacokinetic：PK）と抗菌薬の抗菌作用（Pharmaco近年，抗菌薬の適切な使用の観点から科学的なエビデンスdynamic：PD）とを組み合わせ，抗菌薬効果を検討するに基づく抗菌薬の使い分けが求められ，抗菌薬の体内動態PK/PD理論が広く用いられるようになった．眼感染症の治〔別刷請求先〕砂田淳子：〒565-0871吹田市山田丘2.15大阪大学医学部附属病院医療技術部Reprintrequests：AtsukoSunada,DepartmentofMedicalTechnology,OsakaUniversityHospital,2-15Yamadaoka,Suita,Osaka565-0871,JAPAN854854854あたらしい眼科Vol.29，No.6，2012（132）（00）0910-1810/12/\100/頁/JCOPY療においてもPK/PD理論を用いた解析が行われているが，眼科特有の指標としてのaqueousconcentrationmax（AQCmax）およびpostantibioticeffect（PAE）なども抗菌点眼薬選択のエビデンスとして用いられている．また，浅利らは新たな点眼薬選択のエビデンスとして以前筆者らが検討を行ったPABE（postantibioticbactericidaleffect）を紹介している1）．PABEとは抗菌薬が短時間細菌と接触した後，その抗菌薬を除去・希釈後も認められる殺菌効果のことである．PAEが抗菌薬と接触・除去後の持続的な増殖抑制効果を測定しているのに対し，PABEは殺菌効果を測定している点が異なっている．筆者らは，PK/PD理論に基づいて開発された1.5％レボフロキサシン（LVFX）点眼薬（クラビットR点眼薬1.5％）と従来品である0.5％LVFX点眼薬（クラビットR点眼薬0.5％）のPABEの比較を行ったので報告する．I対象および方法1.被検菌株対象は，2003年1月から12月に実施された感染性角膜炎サーベイランス参加24施設において角膜材料より分離された133株のうち，Staphylococcus属：10株（S.epidermidis：5株，S.aureus：5株），Streptococcus属：10株（S.pneumoniae：5株，S.pneumoniae以外のStreptococcus属：5株），Corynebacterium属：3株を用いた．Corynebacterium属については愛媛大学にて臨床眼科材料より分離された7株も用いた．2.被検菌の培養条件被検菌液は，Staphylococcus属をブレインハートインヒュージョン寒天平板（BHI-AP）にて18.24時間，Streptococcus属を血液寒天培地にて18.24時間，Corynebacterium属を血液寒天培地にて48時間培養した株を用い，滅菌生理食塩水にてStaphylococcus属とS.pneumoniae以外のStreptococcusはマックファーランド0.5に，S.pneumoniaeおよびCorynebacterium属はマックファーランド1.5に濁度計（550nm）を用い調製した．3.比較点眼薬点眼薬は，0.5％LVFX点眼薬（クラビットR点眼液0.5％）および1.5％LVFX点眼薬（クラビットR点眼液1.5％）の2種類を参天製薬より譲渡を受け用いた．4.PABE測定PABE測定は筆者らが以前行った方法に準拠し行った．すなわち，調整後の被検菌液を滅菌小試験管に10μl分注後，各点眼薬を50μl添加・撹拌し，4分間室温にて点眼薬と被検菌を接触させた．つぎに，滅菌生理食塩水にて10,000倍希釈した菌浮遊液50μlをスパイラルシステム（細菌定量測定装置：グンゼ産業）を用いBHI-APおよび血液寒天培地に表1PABE判定発育抑制率評価値0％01.25％126.50％251.75％376.100％4定量的に塗布し培養した．Staphylococcus属は35℃，24時間，Streptococcus属は炭酸ガス培養35℃，24時間，Corynebacterium属は炭酸ガス培養35℃，48時間培養後に発育したコロニー数を数え，コントロール（薬剤無添加）と比較しその殺菌率を求めた．レボフロキサシンによる殺菌効果は，表1に示すように0，1，2，3，4の5段階に分けPABE評価方法とした．コントロールの発育コロニー数に比し，まったく抑制されていない場合を0，1.25％抑制された場合を1，26.50％抑制された場合を2，51.75％抑制された場合を3，76.100％抑制された場合を4とした．5.PABE評価法有意差検定は，0.5％LVFXおよび1.5％LVFX点眼薬の比較にはWilcoxon検定を用い，メチシリン感受性ブドウ球菌（MSS）群とメチシリン耐性ブドウ球菌（MRS）群に対するPABEの比較およびLVFX感受性ブドウ球菌群とLVFX耐性ブドウ球菌群に対するPABEの比較にはMannWhitney検定を用いた．II結果各菌属における0.5％LVFX点眼薬および1.5％LVFX点眼薬のPABEを図1.3に示した．図中の①.⑩の番号はそれぞれの菌株に対応しており，0.5％LVFX点眼薬のPABE判定値と1.5％LVFX点眼薬でのPABE判定値の推移を矢印で示した．1.0.5％LVFX点眼薬および1.5％LVFX点眼薬のStaphylococcus属に対するPABE（図1）0.5％LVFX点眼薬ではPABE評価値2に6株，評価値3に4株と全株について殺菌効果を認めた．1.5％LVFX点眼薬では，評価値2に2株，評価値3に6株，評価値4に2株と全株について優れた殺菌効果を認めた．1.5％LVFX点眼薬では，0.5％LVFX点眼薬に比し10株中6株（60％）において評価値1の上昇を認め，4株（40％）では評価値に変化は認められなかった．Wilcoxon検定にて，0.5％LVFX点眼薬および1.5％LVFX点眼薬のPABE評価値の間に有意な差を認め，1.5％LVFX点眼薬は0.5％LVFX点眼薬に比べより強い殺菌効果を認めた（p＜0.05）．（133）あたらしい眼科Vol.29，No.6，20128552.0.5％LVFX点眼薬および1.5％LVFX点眼薬のStreptococcus属に対するPABE（図2）0.5％LVFX点眼薬ではPABE評価値0に2株，評価値1に3株，評価値2に1株，評価値3に2株，評価値4に2株と全体に広く分布した．1.5％LVFX点眼薬では，評価値1に4株，評価値2に1株，評価値3に1株，評価値4に4株と低発育抑制域と高発育抑制域の二峰性を示した．1.5％LVFX点眼薬では，0.5％LVFX点眼薬に比し10株中6株（60％）において評価値1の上昇を認め，4株では評価値に変化は認められなかった．Wilcoxon検定にて，0.5％LVFX点眼薬および1.5％LVFX点眼薬のPABE評価値の間に有意な差を認め，1.5％LVFX点眼薬は0.5％LVFX点眼薬に比べより強い殺菌効果を認めた（p＜0.05）．3.0.5％LVFX点眼薬および1.5％LVFX点眼薬のCorynebacterium属に対するPABE（図3）0.5％LVFX点眼薬ではPABE評価値1に4株，評価値3に5株，評価値4に1株と低発育抑制域と中等度発育抑制域の二峰性の分布を示した．1.5％LVFXでは評価値1に2株，評価値2に1株，評価値4に7株と低発育抑制域と高濃度発育抑制域の二峰性の分布を示した．1.5％LVFX点眼薬では，0.5％LVFX点眼薬に比し10株中6株（60％）において評価値1，1株（10％）において評価値3の上昇を認め，3株（30％）では評価値に変化は認められなかった．Wilcoxon検定にて，0.5％LVFX点眼薬および1.5％LVFX点眼薬のPABE判定発育抑制率（％）PABEの分布0.5％LVFX点眼薬1.5％LVFX点眼薬476.100①②351.75①②③④③④⑤⑥⑦⑧226.50⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑨⑩11.2500図1Staphylococcus属（10株）における0.5％LVFX点眼薬と1.5％LVFX点眼薬のPABE①，③，⑤.⑦，⑨はメチシリン感受性Staphylococcus属．②，④，⑧，⑩はメチシリン耐性Staphylococcus属．①，②，④，⑧，⑩はレボフロキサシン耐性Staphylococcus属．③，⑤.⑦，⑨はレボフロキサシン感受性Staphylococcus属．PABE判定発育抑制率（％）PABEの分布0.5％LVFX点眼薬1.5％LVFX点眼薬476.100①②①②③④351.75③④⑤226.50⑤⑥11.25⑥⑦⑧⑦⑧⑨⑩00⑨⑩図2Streptococcus属（10株）における0.5％LVFX点眼薬と1.5％LVFX点眼薬のPABE①.⑤はStreptococcuspneumoniae．⑥.⑩はS.pneumoniae以外のStreptococcus属．PABE判定発育抑制率（％）PABEの分布0.5％LVFX点眼薬1.5％LVFX点眼薬476.100①①②③④⑤⑥⑦351.75②③④⑤⑥226.50⑧11.25⑦⑧⑨⑩⑨⑩00図3Corynebacterium属（10株）における0.5％LVFX点眼薬と1.5％LVFX点眼薬のPABE856あたらしい眼科Vol.29，No.6，2012（134）PABEの間に有意な差を認め，1.5％LVFX点眼薬は0.5％LVFX点眼薬に比べより強い殺菌効果を認めた（p＜0.05）．4.MSS群とMRS群に対するPABE（図1）比較0.5％LVFX点眼薬において，MSS群ではPABE評価値2に4株，評価値3に2株，MRS群ではPABE評価値2に2株，評価値3に2株であった．1.5％LVFX点眼薬において，MSS群では評価値2に1株，評価値3に4株，評価値4に1株，MRS群では評価値2に1株，評価値3に2株，評価値4に1株であった．Mann-Whitney検定にて，0.5％LVFX点眼薬および1.5％LVFX点眼薬においてともにMSS群およびMRS群のPABE評価値の間に統計学的に差を認めなかった（p＜0.05）．5.LVFX感受性ブドウ球菌群とLVFX耐性ブドウ球菌群に対するPABE（図1）比較0.5％LVFX点眼薬において，LVFX感受性群ではPABE評価値2に4株，評価値3に1株，LVFX耐性群ではPABE評価値2に2株，評価値3に3株であった．1.5％LVFX点眼薬において，LVFX感受性群では評価値2に1株，評価値3に2株，評価値4に2株，LVFX耐性群では評価値2に1株，評価値3に4株であった．Mann-Whitney検定にて，0.5％LVFX点眼薬および1.5％LVFX点眼薬においてともにLVFX感受性群およびLVFX耐性群のPABE評価値の間に統計学的に差を認めなかった（p＜0.05）．III考按近年，PK/PD理論は，抗菌薬投与に関して副作用の発現や耐性菌の出現を最小限に抑え，より効果的な治療を行うために広く臨床に応用されている．眼感染症においてもPK/PD理論を用いた解析が行われているが，点眼薬の特性を考慮したAQCmaxやPAE，筆者らが考案したPABEなども用いられ抗菌点眼薬の選択が行われている．PABEとは実際の結膜.内での点眼薬の作用を想定しPAEの方法を改良したものであり，被検菌と抗菌薬を短時間接触させた後，invitroでの菌の殺菌効果を示したものである2）．一方，PAEは被検菌と抗菌薬を短時間接触させた後のinvitroでの持続増殖抑制効果を示している．PAEとPABEとは測定に関する考え方が酷似しているが，結果の捉え方が異なるため一定の相関関係を示すわけではない．1.5％LVFX点眼薬はPK/PD理論に基づき新たに開発された高濃度ニューキノロン系点眼薬である．McDonaldは，ResearchReviewにてウサギ眼における1.5％LVFX点眼薬，0.3％ガチフロキサシン（GFLX）およびモキシフロキサシン（MFLX）の組織移行性の比較を評価し，房水内と角膜組織内での薬物血中濃度-時間曲線下面積（AUC）0.∞がGFLXおよびMFLXのAUC0.∞より大きいこと，1.5％LVFX投与後の涙液濃度が多くの眼感染病原菌の90％発育（135）阻止濃度（MIC90）を上回っていることなどを示している3）．ニューキノロン系はアミノグリコシド系の薬剤と同様に濃度依存性であり，AUC/MICおよびCmax/MICが大きいほど抗菌効果が増強する薬剤であることより，PK/PDの観点より1.5％LVFX点眼薬は高い臨床効果と耐性菌発現抑制が期待されている．今回の実験において，1.5％LVFX点眼薬のPABEは，0.5％LVFX点眼薬に比べ評価値が1以上上昇した株が全30株中19株（63.3％）確認された．Wilcoxon検定において測定した3菌種すべてにおいて両点眼薬のPABEに有意差を認めたことより，1.5％LVFX点眼薬は0.5％LVFX点眼薬に比べPABEの優れた薬剤であることが確認され，眼感染症治療に対し高い有用性が期待される．ニューキノロン薬であるLVFXは濃度依存型薬剤であり，濃度に比例し抗菌力が上昇することが知られている．PABEにおいても高濃度LVFX点眼薬が低濃度LVFX点眼薬より抗菌効果が優れていることが示唆された．MSS群およびMRS群について，0.5％LVFX点眼薬および1.5％LVFX点眼薬ともにMSS群とMRS群の間でPABEに差を認めなかった．日常的に行われているLVFXの最小発育阻止濃度（MIC）測定において，MSSに比較しMRSは，MICの高い株が多く認められるが，被検菌とLVFXの高濃度薬剤との短時間接触ではメチシリン感受性および耐性に関係なく抗菌効果を示す可能性を示唆している．また，LVFX感受性ブドウ球菌群およびLVFX耐性ブドウ球菌群について，0.5％LVFX点眼薬および1.5％LVFX点眼薬ともにPABEに差を認めなかった．このことより，LVFXに対する薬剤感受性結果にかかわらず両点眼薬は抗菌効果を示す可能性を示唆している．Hoshiらは，LVFX高度耐性MRSA，LVFX中等度耐性MRSAおよびLVFX感受性MRSAを用いLVFXおよびGFLXに対するPAEを測定し，LVFX感受性群，LVFX中等度耐性群，LVFX高度耐性群の順にPAEが短くなることを報告している4）．したがって，菌株の耐性獲得（遺伝子変異）によってはLVFX点眼薬にて十分な抗菌効果が望めない可能性があるため，起因菌としてニューキノロン耐性菌が検出された場合は臨床効果判定に十分注意が必要であると考える．McDonaldらは，1998.2005年の7年間において眼科材料より分離されたS.pneumoniaeおよびHaemophilusinfluenzaeのLVFXに対する薬剤感受性率は99％以上であり新たな耐性化が起こっていないとしている3）．同様に小早川らは，2004.2009年の5年間の調査において細菌性結膜炎における検出菌のLVFXの薬剤感受性おいて急速な菌の変化や耐性化の進行は生じていない5）としている．しかし，浅利は，高濃度抗菌薬である点眼薬が涙液で希釈され，鼻腔・口腔内に流れ出ることにより上気道で常在細菌に「薬剤耐性のあたらしい眼科Vol.29，No.6，2012857場」を与えている6）としており，眼科材料からの耐性菌の動向のみでなく，上気道材料や糞便など全身から分離される耐性菌の動向にも留意し使用すべきであると考える．文献1）浅利誠志，井上幸次，大橋裕一：エビデンスに基づく点眼薬の使い分け．あたらしい眼科24：1631-1633,20072）砂田淳子，上田安希子，井上幸次ほか：感染性角膜炎全国サーベイランス分離株における薬剤感受性と市販点眼薬のpostantibioticeffectの比較．日眼会誌110：973-983,20063）McDonaldMB：ResearchReviewandUpdate：IQUIX（Levofloxacin1.5％）.IntOphthalmolClin46（4）：47-60,20064）HoshiS,KikuchiK,SasakiTetal：Postantibioticeffectandbactericidalactivitiesoflevofloxacinandgatifloxacinatconcentrationssimulatingthoseoftopicalophthalmicadministrationagainstfluoroquinolones-resistantandfluoroquinolones-sensitivemethicillin-resistantStaphylococcusaureusstrains.AntimicrobAgentsChemother52：2970-2973,20085）小早川信一郎，井上幸次，大橋裕一ほか：細菌性結膜炎における検出菌・薬剤感受性に関する5年間の動向調査（他施設共同研究）．あたらしい眼科28：679-687,20116）浅利誠志：多剤耐性菌の最近の動向について教えてください．あたらしい眼科17（臨増）：11-14,2000＊＊＊858あたらしい眼科Vol.29，No.6，2012（136）