あたらしい眼科オンラインジャーナル » 角膜上皮細胞

プロスタグランジン関連薬のウサギ角膜上皮細胞に対する影響

admin — Wed, 29 Jun 2011 15:29:18 +0000

886（13あ4）たらしい眼科Vol.28，No.6，20110910-1810/11/\100/頁/JC（O0P0Y）《原著》あたらしい眼科28（6）：886.890，2011c〔別刷請求先〕井上順：〒216-8511川崎市宮前区菅生2-16-1聖マリアンナ医科大学眼科学教室Reprintrequests：JunInoue,M.D.,DepartmentofOphthalmology,St.MariannaUniversitySchoolofMedicine,2-16-1Sugao,Miyamae-ku,Kawasaki-shi,Kanagawa216-8511,JAPANプロスタグランジン関連薬のウサギ角膜上皮細胞に対する影響井上順＊1岡美佳子＊2井上恵理＊1徳田直人＊1竹鼻眞＊2上野聰樹＊1＊1聖マリアンナ医科大学眼科学教室＊2慶應義塾大学薬学部分子機能生理学講座EffectofProstaglandinAnaloguesonRabbitCornealEpithelialCellsJunInoue1）,MikakoOka2）,EriInoue1）,NaotoTokuda1）,MakotoTakehana2）andSatokiUeno1）1）DepartmentofOphthalmology,St.MariannaUniversitySchoolofMedicine,2）DepartmentofMolecularFunctionandPhysiology,KeioUniversityFacultyofPharmacyプロスタグランジン（PG）関連薬の角膜への影響を検討するため，ウサギ角膜上皮細胞を用いて細胞毒性および細胞増殖に対する抑制作用を比較した．96ウェルプレートにウサギ角膜上皮細胞を5,000cells/mlで播種し，24時間培養後2倍希釈系列（2.512倍）になるように希釈したPG関連薬（ラタノプロスト0.005％，トラボプロスト0.004％，タフルプロスト0.0015％，ビマトプロスト0.03％）を各ウェルに分注し，一定時間培養後LDH（lactatedehydrogenase）assay法またはMTT〔3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazoliumbromide〕assay法を行い，各薬剤の細胞障害率および細胞増殖抑制率を算出した．薬剤濃度を横軸に，細胞増殖抑制率または細胞障害率を縦軸にとり近似曲線を求めた．LDHassay法による細胞障害率50％となる希釈濃度はラタノプロスト（12.2倍）＞タフルプロスト（7.1倍）＞ビマトプロスト（3.7倍）＞トラボプロスト（1.2倍）の順で高く，MTTassay法による細胞増殖抑制率50％となる希釈濃度はラタノプロスト（25.5倍）＞タフルプロスト（21.8倍）＞ビマトプロスト（10.6倍）＞トラボプロスト（1.1倍）の順で高かった．培養ウサギ角膜上皮細胞に対する影響はラタノプロスト，タフルプロスト，ビマトプロスト，トラボプロストの順で強かった．Thecytotoxicityandinhibitoryeffectsofvariousprostaglandin（PG）analogueeyedropsoncornealepithelialcellgrowthwerecomparedinculturedrabbitcornealepithelialcells.Thecellswerespreadona96-wellplate.Afterincubation,thePGanalogues（0.005％latanoprost,0.004％travoprost,0.0015％tafluprost,and0.03％bimatoprost）weredilutedtoprepareserial2-folddilutions（2-512fold）,andeachwaspouredintoeachwell.LDH（lactatedehydrogenase）assayor3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazoliumbromide（MTT）assaywereperformed,andthecytotoxicityrateandcellgrowthinhibitionratewerecalculatedforeachdrug.Anapproximatecurvewasobtainedforeachdrugandcomparativeinvestigationwasconductedbyplottingtheconcentrationofeachdrugonthehorizontalaxisandthegrowthinhibitionrateorcytotoxicityrateonthelongitudinalaxis.Thecytotoxicityrate,asdeterminedbyLDHassay,washighest（50％）forthe12.2-folddilutionoflatanoprost,followedinorderbythe7.1-folddilutionoftafluprost,the3.7-folddilutionofbimatoprostandthe1.2-folddilutionoftravoprost.Thegrowthinhibitionrate,asdeterminedbyMTTassay,washighestforthe25.5-folddilutionoflatanoprost,followedinorderbythe21.8-folddilutionoftafluprost,the10.6-folddilutionofbimatoprostandthe1.1-folddilutionoftravoprost.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）28（6）：886.890,2011〕Keywords：角膜上皮細胞，プロスタグランジン関連薬，LDHassay法，MTTassay法．cornealepithelialcell,prostaglandinanalogues,LDHassay,MTTassay.（135）あたらしい眼科Vol.28，No.6，2011887はじめに緑内障治療では，一般的にまず点眼薬治療が行われる．現在では多くの抗緑内障点眼薬が登場し，治療の選択肢が増えてきている．そのなかでも，プロスタグランジン（PG）関連薬は強力な眼圧下降効果を有し，しかも全身的な副作用が少ないことから，緑内障薬物療法の第一選択薬となっている．一方，緑内障は疾患の性質上，一度，抗緑内障点眼薬が投与されると長期にわたり投与が継続される場合や，眼圧コントロールを得るために複数の薬剤が同時に併用投与される場合もある．点眼薬が最初に接触するのは角膜，結膜などのオキュラーサーフェスであり，この部位での副作用発現の可能性があり，考慮する必要がある．実際に点眼薬の眼局所副作用として角膜上皮障害が多く報告されており，さらに長期連用により重篤化することもある1）．また，その角膜上皮障害の程度も点眼薬により異なる．この角膜上皮障害は一旦発症すると，点眼治療を中止しなければならない場合や，自覚症状のためにアドヒアランス低下の原因となる場合もあり，治療を行ううえで大きな影響を及ぼす可能性がある．本研究では，PG関連薬の角膜上皮細胞に対する影響について培養ウサギ角膜上皮細胞を用いて，細胞障害性をLDH（lactatedehydrogenase；乳酸脱水素酵素）活性を指標に検討し，さらにはMTT〔3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazoliumbromide〕assay法により，細胞増殖に及ぼす影響について検討した．I実験材料および方法1.実験材料培養細胞は凍結正常ウサギ角膜上皮細胞（NRCE2）（クラボウ），培地はM-StarA（KeratinocyteGrowthMedium）（アルブラスト）を用いた．LDH活性測定には，LDH-細胞毒性テストキット（和光純薬）を使用した．MTTassay法は，MTT（SIGMA）をPBS（phosphate-bufferedsaline）にて最終濃度5mg/mlになるように調製し，呈色液として用いた．MTT溶解液には0.04NHCl-isopropanol液（和光純薬）を用いた．PG関連薬はラタノプロスト0.005％（ファイザー），トラボプロスト0.004％（日本アルコン），タフルプロスト0.0015％（参天製薬），ビマトプロスト0.03％（千寿製薬）の市販製品を使用した2）．いずれも2009年11月に購入したもので，タフルプロストについては2010年1月の防腐剤濃度変更以前のものを用いた（表1）．2.実験方法a.ウサギ角膜上皮細胞の培養法凍結正常ウサギ角膜上皮細胞を60mmペトリディッシュに播種し，37℃インキュベーターで5％CO2の条件下で培養した．細胞がサブコンフルエント（80％）になった時点で，1.0×105cells/mlの細胞浮遊液を作製し，96ウェルプレートに細胞浮遊液50μl（5,000cells/ml）を分注した．各ウェルに培養液を加え全量100μlとした．b.LDH活性の測定96ウェルプレートに播種したウサギ角膜上皮細胞は24時間培養後，培養液で洗浄し，最後に培養液50μlを各ウェルに分注した．各PG関連薬を2倍希釈系列（2.512倍）になるように培養液で希釈したものを各ウェルに50μlずつ分注した．15分間室温で放置後，各ウェルから50μlとり，別のプレートに移し，発色液（ニトロブルーテトラゾリウム）50μlを分注し，45分間室温で放置した．反応停止液（0.04NHCl）100μlを各ウェルに加え，マイクロプレートリーダーを用いて570nm波長の吸光度を測定した．各薬剤とも各希釈濃度について4サンプルずつ吸光度を測定した．検体（S），ネガティブコントロール（NC；PBS），およびポジティブコントロール（PC；PBSで溶解した0.2％Tween20）の平均吸光度から，以下に示す計算式で細胞障害率を算出した．細胞障害率（％）＝（S.N/P.N）×100各PG関連薬の細胞障害作用に有意差があるか否かは，ANOVA（analysisofvariance；分散分析法）検定後，Bonferroni/Dunn法の多重検定を行い，危険率p＜0.05をもって有意差ありとした．50％細胞障害希釈倍率は，各薬剤の濃度を横軸にとり，細胞障害率を縦軸にとって各薬剤についてプロットし対数の近似曲線を求めることによって算出した．c.細胞増殖抑制率の測定96ウェルプレートを24時間培養後，培養液を取り除き，各PG関連薬をそれぞれ2倍希釈系列（2.512倍）になるように培養液で希釈したものを各ウェルに100μlずつ分注し，48時間培養した．各ウェルにMTT溶液（5mg/ml）10μlを加え，37℃で4時間インキュベートした．MTT溶解溶液100μlを加え，マイクロプレートリーダー（LabsystemsMultiskanMS；Labsystems）を用いて570nm波長の吸光度を測定した．各薬剤とも各希釈濃度について4サンプルずつ吸光度を測定した．薬剤無添加のウェルを対照とし，以下に示す計算式で細胞増殖抑制率を算出した．細胞増殖抑制率（％）＝100.（薬剤添加ウェルの平均吸光度／薬剤無添加ウェルの平均吸光度）×100各PG関連薬の細胞増殖抑制作用に有意差があるか否か表1各種プロスタグランジン関連薬の主剤濃度と防腐剤濃度主剤防腐剤ラタノプロスト0.005％ベンザルコニウム塩化物0.02％トラボプロスト0.004％sofZiaRタフルプロスト0.0015％ベンザルコニウム塩化物0.01％ビマトプロスト0.03％ベンザルコニウム塩化物0.005％888あたらしい眼科Vol.28，No.6，2011（136）は，ANOVA検定後，Bonferroni/Dunn法の多重検定を行い，危険率p＜0.05をもって有意差ありとした．50％増殖抑制希釈倍率は，各薬剤の濃度を横軸にとり，細胞増殖抑制率を縦軸にとって各薬剤についてプロットし，対数近似曲線を求めることによって算出した．II結果1.LDH活性の測定LDH検出法を用いて測定した吸光度から細胞障害率を算出し，細胞障害に対するPG関連薬の影響を検討した．Bonferroni/Dunn法による多重検定を行った結果，各薬剤間に有意差は認めなかったが，最も高い細胞障害性を認めたのはラタノプロスト0.005％であり，細胞障害率は2倍希釈で114％，4倍希釈で66％であった．ついでタフルプロスト0.0015％において，2倍希釈で100％，4倍希釈で48％の細胞障害を認めた．ビマトプロスト0.03％の細胞障害率は，2倍希釈で95％，4倍希釈で37％であった．細胞障害性が最も低かったのがトラボプロスト0.004％であり，細胞障害率は2倍希釈で60％と他の3剤と比較し細胞障害率は低値であり，4倍希釈で35％であった．256倍希釈ではいずれの薬剤も細胞障害率は10％以下となり，512倍希釈では，細胞障害はほとんど認めなかった（図1）．各薬剤の濃度を横軸にとり，細胞障害率を縦軸にとって各薬剤についてプロットし対数近似曲線を求めることによって50％細胞障害希釈倍率を算出した．50％細胞障害時希釈倍率は，ラタノプロスト12.2倍，タフルプロスト7.1倍，ビマトプロスト3.7倍，トラボプロスト1.2倍であった（図2）．2.細胞増殖抑制率の測定MTTassay法を用いて測定した吸光度から細胞増殖抑制率を算出し，細胞増殖に対するPG関連薬の影響を検討した．細胞増殖抑制率は，ラタノプロストにおいて8倍希釈まで80％以上，32倍希釈でも49％であり，いずれの希釈倍率でも最も抑制率は高かった．ついでタフルプロストにおいて，4倍希釈で83％，16倍希釈で65％，32倍希釈で45％と高い細胞増殖抑制率を認めた．ビマトプロストの細胞増殖抑制率は，4倍希釈で72％，16倍希釈で53％，32倍希釈で30％であった．最も低い細胞増殖抑制率を示したのはトラボプロストであり，抑制率は4倍希釈で66％，16倍希釈で35％，32倍希釈で28％となった（図3）．Bonferroni/Dunn法による多重検定を行った結果，トラボプロストは，4倍希釈および8倍希釈濃度で他の薬剤に対して，細胞増殖抑制率は有意に低値を示した．さらにトラボプロストは，4倍希釈から64倍希釈濃度でラタノプロストに対して，細胞増殖抑制率は有意に低値を示し，16倍希釈160140120100806040200－20512256128643216842希釈濃度（倍）細胞障害率（％）：ラタノプロスト0.005％：タフルプロスト0.0015％：ビマトプロスト0.03％：トラボプロスト0.004％図1PG関連薬のウサギ角膜上皮細胞に対する細胞障害率の比較LDH検出法を用いて各種薬剤の細胞障害率を算出した．各希釈系列における薬剤間の有意差は認めなかった．細胞障害性はトラボプロスト0.004％が最も低かった．n＝4，平均±標準偏差．希釈濃度（倍）00.10.20.30.40.50.6細胞障害率（％）：ラタノプロスト0.005％（LAT）：タフルプロスト0.0015％（TAF）：ビマトプロスト0.03％（BIM）：トラボプロスト0.004％（TRA）120100806040200LATy＝0.1582Ln（x）＋0.8959TAFy＝0.1458Ln（x）＋0.7855BIMy＝0.1227Ln（x）＋0.6619TRAy＝0.0899Ln（x）＋0.5147図2各種PG関連薬のウサギ角膜上皮細胞障害率の近似曲線100806040200－20251625612864321684希釈濃度（倍）細胞増殖抑制率（％）＃＃＃＊＊＃＃＃＊＊＃＃＃＊＊＊＃＃＃＃＃＃＃＊＊＊：ラタノプロスト0.005％：タフルプロスト0.0015％：ビマトプロスト0.03％：トラボプロスト0.004％図3PG関連薬のウサギ角膜上皮細胞に対する細胞増殖抑制率の比較MTTassay法を用いて各種薬剤の細胞増殖抑制率を算出した．ラタノプロスト0.005％で最も強い細胞増殖抑制効果を認めた．細胞増殖抑制効果はトラボプロスト0.004％が最も弱かった．n＝4，平均±標準偏差．#p＜0.05ラタノプロストvsトラボプロスト．＊p＜0.05タフルプロストvsトラボプロスト．##p＜0.05ビマトプロストvsトラボプロスト．＊＊p＜0.05タフルプロストvsラタノプロスト．###p＜0.05ラタノプロストvsビマトプロスト．＊＊＊p＜0.05タフルプロストvsビマトプロスト．（ANOVAおよびBonferroni/Dunn法）（137）あたらしい眼科Vol.28，No.6，2011889から64倍希釈濃度でタフルプロストに対しても，細胞増殖抑制率は有意に低値を示した．タフルプロストは，32倍希釈濃度でラタノプロストに対して，細胞増殖抑制率は有意に低値を示した．ビマトプロストは，16倍希釈および32倍希釈濃度でラタノプロストに対して，細胞増殖抑制率は有意に低値を示し，64倍希釈濃度でタフルプロストに対しても，細胞増殖抑制率は有意に低値を示した．各薬剤の希釈濃度を横軸にとり，細胞増殖抑制率を縦軸にとって各薬剤についてプロットし対数近似曲線を求めることによって50％細胞増殖抑制希釈倍率を算出した．50％増殖抑制希釈倍率は，ラタノプロスト25.5倍，タフルプロスト21.8倍，ビマトプロスト10.6倍，トラボプロスト1.1倍であった（図4）．III考按緑内障の薬物治療は長期にわたることが多い．そのため，眼圧下降効果のみならず，副作用や使用感，経済的負担などを考慮し，患者に応じた最適な薬剤の選択が望まれる．薬剤の選択肢が広がることは，より最適な薬剤処方の実現に寄与するとともに，近年，わが国における薬剤の選択肢は大きな変化を示している．イソプロピルウノプロストン点眼液およびラタノプロスト点眼液が発売されて以降，これらのPG関連薬が薬物治療のおもな第一選択薬として使用されてきた．近年にはトラボプロスト点眼液，タフルプロスト点眼液およびビマトプロスト点眼液が登場し，PG関連薬の選択肢が大きく広がった．さらに最近，一部のPG関連薬とチモロールマレイン酸塩の配合点眼液が発売され，さらに薬剤の選択肢が広がっている．各種のPG関連薬の眼圧下降効果については多くの報告がある3.6）．また，副作用については緑内障患者のアドヒアランスへの影響が大きいとされる結膜充血に関する報告が多い7,8）．その一方で，緑内障患者が角膜疾患を併発しているケースも少なくないなかで，わが国で使用されているPG関連薬を使用した角膜障害性に関する報告はほとんどない．そこで，今回は4種のPG関連薬の角膜障害性についてウサギ角膜上皮細胞を使用して比較検討することにした．本研究では，各種PG関連薬およびその希釈液を使用して，細胞死の指標であるLDHassay法9.11）と細胞増殖の指標であるMTTassay法12）で角膜上皮細胞に対する障害性を調べた．その結果，各種PG関連薬でウサギ角膜上皮細胞に対する影響に差が認められ，さらにLDHassay法およびMTTassay法ともに同様の傾向が認められた．ウサギ角膜上皮細胞に対して最も強い毒性を示したのはラタノプロスト点眼液で，続いてタフルプロスト点眼液，ビマトプロスト点眼液であり，トラボプロスト点眼液はウサギ角膜上皮細胞に対して最も影響が少ない薬剤であることが明らかとなった．点眼薬は主薬のほかに等張化剤，緩衝剤，可溶化剤，安定化剤，防腐剤，粘稠化剤などが含まれており，点眼薬による角膜上皮障害を考えるうえで，これら添加剤の影響も十分に考慮する必要がある．特に防腐剤のなかではベンザルコニウム塩化物（benzalkoniumchloride：BAK）による角膜上皮障害については多くの報告があり13.16），今後，抗緑内障点眼薬中の薬効成分以外の成分に関する検討も必要であると考えられる．各種PG関連薬の主薬の細胞障害性については，Guenounらがヒト結膜上皮細胞を使用した結果を報告している17）．その結果では，ラタノプロスト，トラボプロスト，ビマトプロストの順で障害性が高かったことを示している（タフルプロストは非使用）．本研究に用いたPG関連薬に含まれる主薬の濃度は，ビマトプロスト：0.03％，ラタノプロスト：0.005％，トラボプロスト：0.004％，タフルプロスト：0.0015％の順で高いが，BAKを含まないトラボプロストが最も細胞毒性が少なく，BAKを含む薬剤のなかでは主薬の濃度が最も高いビマトプロストが最も細胞毒性が少なかった．Guenounらの主薬の細胞障害性の報告と，今回筆者らが実施した製剤の細胞障害性の結果が相関しなかった理由については，BAKの影響が少なからず関与している可能性があると考えられた．BAKは陽イオン界面活性剤であり，その作用は細菌の細胞膜を溶解し，細胞質の変成を起こすことである．本研究で用いたわが国で発売となっているPG関連薬のなかで，BAKを含有するものは，ラタノプロスト点眼液，タフルプロスト点眼液，ビマトプロスト点眼液であり，BAKの含有量2）はラタノプロスト点眼液が0.02％，タフルプロスト点眼液は0.01％，ビマトプロスト点眼液は0.005％と報告されている．一方，トラボプロスト点眼液に含まれる防腐剤はsofZiaRである．sofZiaRはホウ酸/ソルビトール存在下で塩希釈濃度（倍）0.10.20.30.40.50.6細胞障害率（％）100806040200－20：ラタノプロスト0.005％（LAT）：タフルプロスト0.0015％（TAF）：ビマトプロスト0.03％（BIM）：トラボプロスト0.004％（TRA）LATy＝0.1721Ln（x）＋1.0575TAFy＝0.157Ln（x）＋0.9837BIMy＝0.1466Ln（x）＋0.8467TRAy＝0.1112Ln（x）＋0.5078図4各種PG関連薬のウサギ角膜上皮細胞増殖抑制率の近似曲線890あたらしい眼科Vol.28，No.6，2011（138）化亜鉛が保存効果を示す防腐剤であり，BAKよりも細胞障害性が低いことが報告されている18.21）．今回の筆者らの結果では，製剤の細胞障害性がトラボプロスト点眼液を除くとBAKの含有濃度に依存すること，また既報のとおりBAKよりもsofZiaRが細胞障害性を誘発しにくいことが示唆された．以上，各種PG関連薬についてinvitroでウサギ角膜上皮細胞障害性について検討した．実際の臨床では個々の症例について，涙液動態，角膜知覚，糖尿病などの基礎疾患を併発する場合など，角膜および点眼薬にまつわる環境はさまざまであり，薬剤そのものの細胞障害性だけでは副作用の発現を予測できない場合もある．しかし，本研究のモデルは，PG関連薬の臨床で用いられている製品を，ウサギ角膜上皮細胞に接触させたときの細胞障害性を比較したものであり，各薬剤の細胞障害性のポテンシャルを把握するうえでは有用であると考える．ただし，本試験系では製剤中の主薬および添加物の代謝などの要因が加味されないため，実際の緑内障患者における点眼時の各々の眼表面の挙動とは相違すること，さらにタフルプロスト点眼液が最近，BAKの濃度を低減していることも併せて考慮する必要がある．緑内障治療は，その患者にとってほぼ生涯にわたり治療が継続されることが多いことから，各点眼薬の特性，眼圧下降効果および副作用などを十分理解したうえで，その患者に最も適した薬剤を選択することは不可欠である．そのことが患者のアドヒアランスの向上に繋がり，継続可能でより効果的な治療が行えることになるであろうと考える．文献1）HerrerasJM,PastorJC,CalongeMetal：Ocularsurfacealterationafterlong-termtreatmentwithanantiglaucomatousdrug.Ophthalmology99：1082-1088,19922）青山裕美子：緑内障点眼薬の基剤と防腐剤．臨眼63（増刊）：252-259,20093）ChengJW,CaiJP,LiYetal：Ameta-analysisoftopicalprostaglandinanalogsinthetreatmentofchronicangleclosureglaucoma.JGlaucoma18：653-657,20094）ParrishRK,PalmbergP,SheuWP：Acomparisonoflatanoprost,bimatoprost,andtravoprostinpatientswithelevatedintraocularpressure：A12-week,randomized,masked-evaluatormulticenterstudy.AmJOphthalmol135：688-703,20035）StewartWC,KonstasAGP,NelsonLAetal：Meta-analysisof24-hourintraocularpressurestudiesevaluatingtheefficacyofglaucomamedicines.Ophthalmology115：1117-1122,20086）OrzalesiN,RossettiL,BottoliAetal：Comparisonoftheeffectsoflatanoprost,travoprost,andbimatoprostoncircadianintraocularpressureinpatientswithglaucomaorocularhypertension.Ophthalmology113：239-246,20067）AptelF,CucheratM,DenisP：Efficacyandtolerabilityofprostaglandinanalogs：ameta-analysisofrandomizedcontrolledclinicaltrials.JGlaucoma17：667-673,20088）EyawoO,NachegaJ,LefebvrePetal：Efficacyandsafetyofprostaglandinanaloguesinpatientswithpredominantlyprimaryopen-angleglaucomaorocularhypertension：ameta-analysis.ClinOphthalmol3：447-456,20099）DeckerT,Lohmann-MatthesML：Aquickandsimplemethodforthequantitationoflactatedehydrogenasereleaseinmeasurementsofcellularcytotoxicityandtumornecrosisfactor（TNF）activity.JImmunolMethods115：61-69,198810）KorzeniewskiC,CallewaertDM：Anenzyme-releaseassayfornaturalcytotoxicity.JImmunolMethods64：313-320,198311）MurphyTH,MaloufAT,SastreAetal：Calcium-dependentglutamatecytotoxicityinaneuronalcellline.BrainRes444：325-332,198812）HansenMB,NielsenSE,BergK：Re-examinationandfurtherdevelopmentofapreciseandrapiddyemethodformeasuringcellgrowth/cellkill.JImmunolMethods119：203-210,198913）PfisterRR,BursteinN：Theeffectsofophthalmicdrugs,vehicles,andpreservativesoncornealepithelium：ascanningelectronmicroscopestudy.InvestOphthalmolVisSci15：246-259,197614）BursteinNL,KlyceSD：Electrophysiologicandmorphologiceffectsofophthalmicpreparationsonrabbitcorneaepithelium.InvestOphthalmolVisSci16：899-911,197715）LiangH,BaudouinC,FaureMOetal：Comparisonoftheoculartolerabilityofalatanoprostcationicemulsionversusconventionalformulationsofprostaglandins：aninvivotoxicityassay.MolVis15：1690-1699,200916）WhitsonJT,CavanaghHD,LakshmanNetal：Assessmentofcornealepithelialintegrityafteracuteexposuretoocularhypotensiveagentspreservedwithandwithoutbenzalkoniumchloride.AdvTher23：663-671,200617）GuenounJM,BaudouinC,RatPetal：Invitrostudyofinflammatorypotentialandtoxicityprofileoflatanoprost,travoprost,andbimatoprostinconjunctiva-derivedepithelialcells.InvestOphthalmolVisSci46：2444-2450,200518）HorsleyMB,KahookMY：Effectsofprostaglandinanalogtherapyontheocularsurfaceofglaucomapatients.ClinOphthalmol3：291-295,200919）KahookMY,NoeckerRJ：ComparisonofcornealandconjunctivalchangesafterdosingoftravoprostpreservedwithsofZia,latanoprostwith0.02％benzalkoniumchloride,andpreservative-freeartificialtears.Cornea27：339-343,200820）YeeRW,NorcomEG,ZhaoXC：Comparisonoftherelativetoxicityoftravoprost0.004％withoutbenzalkoniumchlorideandlatanoprost0.005％inanimmortalizedhumancorneaepitherialcellculturesystem.AdvTher23：511-519,200621）BaudouinC,RianchoL,WarnetJMetal：Invitrostudyofantiglaucomatousprostaglandinanalogues：travoprostwithandwithoutbenzalkoniumchlorideandpreservedlatanoprost.InvestOphthalmolVisSci48：4123-4128,2007

培養角膜上皮細胞のサイトカイン遺伝子発現に対するマルチパーパスソリューションの影響

admin — Sun, 30 Nov 2008 09:04:40 +0000

———————————————————————-Page1（97）15670910-1810/08/\100/頁/JCLSあたらしい眼科25（11）：15671572，2008cはじめに最近，ソフトコンタクトレンズ（SCL）ユーザーでの細菌性角膜炎の発症が問題になっており1），マルチパーパスソリューション（MPS）の使用との関連性が議論されている2）．細菌性角膜炎の原因としては，MPSの不十分な殺菌効力3）やユーザーのコンプライアンスの低さ4）などが想定されるが，MPSの細胞毒性が角膜上皮細胞に及ぼす影響も考慮に入れる必要がある．柳井ら5）は14種類の市販MPSを比較し，主成分が同じポリヘキサメチルビグアニド（PHMB）であっても，添加剤の種類によって細胞毒性や殺菌効力が大きく異なることを報告した．一方，角膜上皮細胞は外傷を受けるなどのストレス状態にさらされると炎症性細胞を誘導するためにサイトカインを分泌することが知られている6）．毒性の強いMPSの使用は角膜にストレスを与えると考えられる〔別刷請求先〕今安正樹：〒487-0032愛知県春日井市高森台5-1-10（株）メニコン総合研究所Reprintrequests：MasakiImayasu,Ph.D.,CentralR&DLab.,MeniconCo.,Ltd.,5-1-10Takamoridai,Kasugai-shi,Aichi-ken487-0032,JAPAN培養角膜上皮細胞のサイトカイン遺伝子発現に対するマルチパーパスソリューションの影響今安正樹＊1,3白石敦＊2大橋裕一＊2島田昌一＊3＊1（株）メニコン総合研究所＊2愛媛大学医学部眼科学教室＊3名古屋市立大学医学部第2解剖学講座EectsofMultipurposeSolutionsonCytokineGeneExpressionofCornealEpithelialCellsMasakiImayasu1,3）,AtsushiShiraishi2）,YuichiOhashi2）andShoichiShimada3）1）CentralR&DLab.,MeniconCo.,Ltd.,2）DepartmentofOphthalmology,SchoolofMedicine,EhimeUniversity,3）DepartmentofAnatomy,NagoyaCityUniversityMedicalSchool目的：コンタクトレンズ用マルチパーパスソリューション（MPS）の角膜への影響を明確にするため，角膜上皮細胞を市販MPSまたは配合成分で処理したときのサイトカイン遺伝子発現量および産生量を解析する．方法：培養ヒト角膜上皮細胞を用い，7種のMPSまたは配合成分を添加した培養液で3，6，24時間培養した．RNAを抽出し，サイトカイン遺伝子〔インターロイキン（IL）-8，トランスフォーミング増殖因子（TGF）-b2，IL-18，IL-1b，IL-6〕発現量をreal-timepolymerasechainreaction（PCR）法で，培養上清中のサイトカイン産生量を抗体アレイで定量した．結果：ホウ酸を含むMPSではIL-8，TGF-b2，IL-18，IL-6の発現量が36時間後に増加し，その後減少した．これらのMPSでは24時間後のIL-8産生量も増加した．配合成分のなかでは，ホウ酸のみがサイトカイン遺伝子発現量を増加させた．結論：MPSの配合成分であるホウ酸が炎症性サイトカインの産生に関与している可能性が示された．Inordertoclarifytheeectsofmultipurposesolutions（MPS）onthecornea,weanalyzedthecytokinegeneexpressionandproteinlevelofcornealepithelialcellstreatedwithMPSoringredients.Humancornealepithelialcellswereculturedfor3,6or24hoursinmediumcontainingcommerciallyavailableMPSoringredients.AfterRNAextraction,geneexpressionsofinterleukin（IL）-8,transforminggrowthfactor（TGF）-b2,IL-18,IL-1bandIL-6wereanalyzedbyreal-timepolymerasechainreaction（PCR）.Proteinlevelsweredeterminedbyantibodyarray.MPScontainingboricacidcausedup-regulationofIL-8,TGF-b2,IL-18andIL-6after3and6hours,whichthendecreasedat24hours.TheMPSalsopromotedIL-8productionduring24hour-incubation.Oftheingredientstested,onlyboricacidhadsignicanteectsongeneandproteinexpressionsofinammatorycyto-kines.Theseresultsdemonstratethatboricacidmayhavesignicanteectoninammatorycytokineproductionincornealepithelialcells.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）25（11）：15671572,2008〕Keywords：角膜上皮細胞，サイトカイン，マルチパーパスソリューション，コンタクトレンズ．cornealepithelialcells,cytokine,multipurposesolution,contactlens.———————————————————————-Page21568あたらしい眼科Vol.25，No.11，2008（98）ため，サイトカイン遺伝子の発現量が増加する可能性が想定される．角膜上皮細胞のサイトカイン遺伝子発現を解析することにより，角膜へのストレスを高感度で定量的に評価できる方法が構築できると思われる．そこで本論文では，ヒト角膜上皮細胞を，種々のMPS製品または配合成分を添加した培養液で培養し，MPSまたは配合成分を添加しない培養液で培養した場合とのサイトカイン遺伝子の発現量の差をreal-timepolymerasechainreac-tion（PCR）法により定量的に解析した．また，蛋白質レベルでの評価のため，培養液中のサイトカイン産生量を抗体アレイで定量した．I実験材料および方法1.実験材料実験に使用したMPSとおもな配合成分を表1に示す．MPS-AからMPS-Gまでの7種類の市販MPSを用いた．主成分の殺菌剤にはPHMB，AlexidineまたはPolyquadが使用されている．このなかでMPS-AとMPS-B以外は緩衝剤としてホウ酸を含む．配合成分単独での実験に使用した成分名，濃度などを表2に示す．MPSに一般的に使用されている界面活性剤，殺菌剤，緩衝剤を実際の配合濃度に近い濃度で使用した．2.実験方法a.培養細胞の準備培養細胞として，SV40ウイルス感染により不死化したヒト角膜上皮細胞（以下，HCET細胞）7）を理化学研究所細胞バンクより購入して使用した．HCET細胞を6cm組織培養用ディシュにコンフルエントになるまで培養した．培養液はDMEM/F12（GIBCO）＋5％ウシ胎仔血清（FBS）（GIBCO）を用いた．血清無添加の培養液に各種MPSまたは配合成分を10％添加した試験液を準備し，組織培養用ディシュに4ml添加して37℃，5％CO2で3，6，24時間培養した．b.培養細胞からのRNAの抽出および定量組織培養用ディシュの培養液を捨て，冷PBS（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄後，1mlのTRIZOLR試薬（invitrogen）を添加した（氷冷下）．セルスクレーパーを用いてディシュ表面に付着している細胞を離させた（氷冷下）．20ゲージの注射針を取り付けた2.5mlのシリンジで，TRIZOLR試薬の吸引を20回程度くり返した後，1.5mlのマイクロチューブに回収した．以下，TRIZOLR試薬の取扱説明書に従ってtotalRNAを精製し，30μlのDEPC（diethylpyrocarbonate）処理水に溶解させた．c.逆転写反応およびrealtimereversetranscription（RT）PCRパーソナルスペクトルモニター（AmershamBiosciences，GeneQuantpro）で260nmの吸光度を測定することによりRNA濃度を定量し，サンプル濃度を800ng/μlに調整した．PrimeScriptTMRTreagentsKit（TaKaRa）の取扱説明書に従い，50μlの反応系にてcDNAに変換した．つぎに，SYBRRPremixExTaqTM（TaKaRa）の取扱説明書に従い，25μlの反応系にてreal-timePCRを行った（TaKaRa，表2実験に使用したMPS配合成分配合成分種類濃度製造元HCO界面活性剤1.0％日光ケミカルズTetronic1107界面活性剤1.0％BASFJapanPoloxamer407界面活性剤1.0％BASFJapanAlexidine殺菌剤1ppmTrontoResearchPHMB殺菌剤1ppmアーチケミカルズホウ酸（Boricacid）緩衝剤0.5％日興製薬1.0％表1実験に使用した市販MPSMPS殺菌剤界面活性剤ホウ酸の有無MPS-APHMB＊HCO＊＊MPS-BPHMBPoloxamerMPS-CPHMBTetronic＋MPS-DAlexidinePoloxamer/Tetronic＋MPS-EPolyquadTetronic＋MPS-FPolyquadTetronic＋MPS-GPHMB不明＋＊PHMB：polyhexamethylbiguanid.＊＊HCO：PEGhydrogenatedcastoroil.表3RealtimeRTPCRに使用したプライマーペアの塩基配列ヒト遺伝子F/Rプライマー塩基配列b-actinFATTGCCGACAGGATGCAGARGAGTACTTGCGCTCAGGAGGAIL-8FAAGGAACCATCTCACTGTGTGTAAACRATCAGGAAGGCTGCCAAGAGTGF-b2FGGATGCGGCCTATTGCTTTARCATTTCCACCCTAGATCCCTCTTIL-18FGCCACCTGCTGCAGTCTACARATCTGGAAGGTCTGAGGTTCCTTIL-1bFCCTCTGGATGGCGGCARTGCCTGAAGCCCTTGCTGIL-6FAAAAAGGCAAAGAATCTAGATGCAARGTCAGCAGGCTGGCATTTGTFはセンス，Rはアンチセンスを示す．———————————————————————-Page3あたらしい眼科Vol.25，No.11，20081569（99）TP800）．サイトカインとしてIL-8，TGF-b2，IL-18，IL-1b，IL-6の5種類の遺伝子の発現量を解析した．ハウスキーピング遺伝子としては，角膜上皮細胞での発現量が安定なb-actinを選択し（予備実験で確認），b-actin発現量に対する各遺伝子の相対発現量を求めた．さらに，各遺伝子について，MPS（または配合成分）処理群に対するPBS（＋）処理群の相対発現量の比を求め，これを指標とした．なお，各サイトカイン遺伝子およびb-actinのreal-timePCR用プライマーはNCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation）の遺伝子データベースよりmRNAの塩基配列を検索し，PrimerExpress（AppliedBio）でプライマーペア候補を検索し，イントロンをはさんだ配列を選択して，SigmaGenosys社に合成を依頼した．プライマーペアの塩基配列を表3に示す．なお，実験は独立して3回くり返し，平均値と標準偏差を求めた．d.抗体アレイによる培養上清のサイトカイン産生量の定量24時間培養した細胞については培養液を回収し，そのままサイトカイン産生量定量に供試した．アレイ基板としてBS-X1324（住友ベークライト）を使用し，抗ヒトIL-8マウスモノクローナル抗体（BIOSORCE），抗ヒトIL-6マウスモノクローナル抗体（ENDOGEN），抗ヒトTGF-b2マウスモノクローナル抗体（RDS）のプロットを住友ベークライトに依頼した．抗体アレイチャンバー（GenTel，12well）に抗体アレイを固定し，培養液を50μl添加して室温で1時間振盪した．PBSで洗浄後，3種類のサイトカインに対するビオチン化抗体混合液〔抗ヒトIL-8ビオチン化抗体（BIO-SOURCE），抗ヒトIL-6ビオチン化抗体（ENDOGEN），抗ヒトTGF-b2ビオチン化抗体（RDS）〕を調整し，50μl添加して室温で1時間振盪した．PBSで洗浄後，Cy5標識ストレプトアビジン（JacksonImmunoResearch）50μlを添加し，室温で1時間振盪した．PBSで洗浄後，乾燥させ，アレイスキャナー（GSILuminocs，ScanArray5000）でCy5蛍光画像を取得した．各プロットの蛍光強度をアレイ用画像処理ソフト（ScanAlyze）で数値化した．各サイトカインの標準液としてヒトIL-8（Acris），ヒトIL-6（Acris），ヒトTGF-b2（Acris）を5，10，20，40，80pg/mlに調整して用いた．なお，実験は独立して3回くり返し，平均値と標準偏差を求めた．II結果a.サイトカイン遺伝子発現に対するMPSの影響MPSで3，6および24時間処理したときの対照〔PBS（＋）〕に対するサイトカイン遺伝子発現比を図1a，bおよびcに示す．MPS処理3時間後ではMPS-CGでIL-8が35.030.025.020.015.010.05.00.0MPS-AMPS-BMPS-CMPS-DMPS-EMPS-FMPS-GExpressionratio：IL-8：TGF-b2：IL-18：IL-1b：IL-6図1aMPSで3時間処理したHCET細胞のサイトカイン遺伝子発現比対照〔PBS（＋）〕に対する発現比を示す．25.020.015.010.05.00.0MPS-AMPS-BMPS-CMPS-DMPS-EMPS-FMPS-GExpressionratio：IL-8：TGF-b2：IL-18：IL-1b：IL-6図1cMPSで24時間処理したHCET細胞のサイトカイン遺伝子発現比対照〔PBS（＋）〕に対する発現比を示す．45.040.035.030.025.020.015.010.05.00.0MPS-AMPS-BMPS-CMPS-DMPS-EMPS-FMPS-GExpressionratio：IL-8：TGF-b2：IL-18：IL-1b：IL-6図1bMPSで6時間処理したHCET細胞のサイトカイン遺伝子発現比対照〔PBS（＋）〕に対する発現比を示す．———————————————————————-Page41570あたらしい眼科Vol.25，No.11，2008（100）約1025倍に増加した．TGF-b2およびIL-6も増加した．一方，MPS処理6時間後においても，MPS-CGではIL-8が高いレベルを維持したが，特にMPS-EGが約20倍高い発現量を示した．MPS-EおよびMPS-FではIL-6が約2030倍に増加した．MPS処理24時間後においては，全体的にサイトカイン発現比はかなり回復し，特にMPS-Cではほぼ正常レベルになった．MPS-DGではIL-8は回復したが，IL-18とIL-6が約510倍高いレベルを維持していた．すべての処理時間において，MPS-AおよびBではすべてのサイトカイン遺伝子に関し，発現量の増加は認められなかった．すべてのMPS処理において，IL-1bの発現量増加は認められず，IL-8の発現量増加をもたらしたMPS-CGではむしろ発現量が減少する傾向を示した．b.サイトカイン産生量に対するMPSの影響培養24時間で産生されたサイトカイン（IL-8，TGF-b2およびIL-6）を抗体アレイで定量した結果を図2に示す．対照のPBS（＋）でのサイトカイン産生量はIL-8が0.5±0.2pg/ml，TGF-b2が4.3±1.3pg/ml，IL-6が0.3±0.2pg/mlであった．対照と比較してMPS-Aではサイトカイン産生量の増加は認められなかったが，MPS-BおよびCではTGF-b2の増加が認められた．MPS-D，EおよびGでは3種のサイトカインすべてが増加した．MPS-FではIL-8が増加した．全体的にサイトカイン産生量が最も大きく増加したのはMPS-Eであった．c.サイトカイン遺伝子発現に対する配合成分の影響図1で示されたMPSによるサイトカイン遺伝子発現量の増加がMPSのどの配合成分によるかを明確にするため，配合成分単独での遺伝子発現に対する影響を検討した．配合成分処理3時間および24時間後の結果を図3aおよび3bに示す．3時間処理では，配合成分のなかでホウ酸のみがIL-8，TGF-b2，IL-6発現量を増加させ，1％濃度ではそれぞれ約45倍，5倍，15倍となった．24時間後では1％ホウ酸の効果は3時間と比較してかなり回復したが，IL-8およびIL-6はまだ高いレベルを維持しており，IL-18発現量への影響もみられた．1％HCOは0.5％ホウ酸と同程度の効果を示した．d.サイトカイン産生量に対する配合成分の影響配合成分単独で24時間作用させたときのサイトカイン産生量への影響を検討した結果を図4に示す．界面活性剤60.050.040.030.020.010.00.0：IL-8：TGF-b2：IL-6pg/m?MPS-APBS（＋）MPS-BMPS-CMPS-DMPS-EMPS-FMPS-G図2MPSで24時間処理したHCET細胞のサイトカイン産生量b2：IL-18：IL-1b：IL-6図3a配合成分で3時間処理したHCET細胞のサイトカイン遺伝子発現比対照〔PBS（＋）〕に対する発現比を示す．20.015.010.05.00.0Expressionratio1％HCO1％Tetronic1％Poloxamer1ppmAlexidine1ppmPHMB0.5％Boricacid1.0％Boricacid：IL-8：TGF-b2：IL-18：IL-1b：IL-6図3b配合成分で24時間処理したHCET細胞のサイトカイン遺伝子発現比対照〔PBS（＋）〕に対する発現比を示す．———————————————————————-Page5あたらしい眼科Vol.25，No.11，20081571（101）（HCO，TetronicおよびPoloxamer）および殺菌剤（Alexi-dineおよびPHMB）はTGF-b2産生量を有意に増加させた．ホウ酸は濃度依存的にIL-8産生量を増加させ，1％濃度では約70pg/mlにも達した．TGF-b2産生量への影響も認められた．III考按今回，ヒト角膜上皮細胞へのMPS投与で変化する可能性のあるサイトカイン遺伝子としてIL-8，TGF-b2，IL-18，IL-1b，IL-6を採択した．予備実験においてはその他のサイトカインとしてIL-1a，IFN-g，TNF-aなども検討したが，変化が少なかったため対象から除外した．MPSの影響としては，3時間後にIL-8が，6時間後にIL-8に加えてIL-6が，24時間後にはIL-6とTGF-b2の発現量増加が目立った．IL-8およびIL-6が増加したMPSでは，IL-1bの発現量が減少していた．Xueら8）が報告しているように，IL-1はIL-6やIL-8などの炎症性サイトカインの産生を促進する急性的サイトカインであるため，IL-6・IL-8の増加によるフィードバック制御によって，経時的に発現量が下がったと考えられる．TGF-b2は角膜上皮細胞の増殖，遊走，分化，接着制御など多くの生理作用をもつサイトカインであり，角膜上皮創傷治癒過程において発現量が増加することが知られている9）．また，IL-18はマウス角膜に緑膿菌を感染させたときに，24時間後以降に発現量が増加することが知られている10）．今回の実験においては，TGF-b2とIL-18は624時間と長時間作用させた場合に発現量が増加しており，外傷や細菌感染などの重篤な障害で初めて発現するサイトカインと考えられる．7種類のMPSを比較すると，MPS-AおよびMPS-Bではサイトカイン遺伝子の変化が認められなかったが，MPS-C，MPS-D，MPS-E，MPS-FおよびMPS-GではIL-8，TGF-b2，IL-6において顕著な発現量増加を示した．前2者のMPSがホウ酸を含まないのに対し，後5者がホウ酸を含むことより，ホウ酸がサイトカイン遺伝子発現に関与した可能性が考えられる．そこで，代表的なMPS配合成分7種類を選択してサイトカインへの影響を検討したところ，ホウ酸のみが顕著な影響を示し，IL-8，IL-6遺伝子発現量を増加させた．また，抗体アレイによるサイトカイン産生量の測定実験においても，ホウ酸を含むMPSおよび0.51.0％のホウ酸が24時間後のサイトカイン産生量を増加させることを確認した．ホウ酸が実使用濃度よりも低い0.1％で細胞毒性を有することは，Santodomingoら11）のV79細胞を用いたコロニー形成阻害試験により報告されている．今回の実験ではサイトカイン遺伝子発現および産生量の増加として細胞毒性が検出されたと考えられる．一方，筆者らは角膜上皮細胞のタイトジャンクション（特にZO-1）に対するMPSの影響を細胞生物学的および電気生理学的手法で検討し，配合成分にホウ酸を含むMPSのみがタイトジャンクションの構造を破壊することを報告している12）．サイトカイン遺伝子発現の増加がタイトジャンクションの構造破壊をひき起こすメカニズムの詳細は不明であるが，IL-1やIL-8などの炎症性サイトカインはストレス応答性のMAPK（mitogen-activatedproteinkinase）の活性化をひき起こすことが知られており，MAPKカスケードなどの細胞内シグナル伝達系の活性化を通してタイトジャンクションが破壊されたと考えられる13）．角膜上皮最表層細胞のタイトジャンクションは角膜のバリア機能においてきわめて重要な役割を担っているため，その構造破壊は緑膿菌などの病原菌の角膜への侵入を容易にし，細菌性角膜炎感染のリスクを増大させると考えられる1）．すなわち，コンタクトレンズ装用とケア用品（特にMPS）使用による細菌性角膜炎発症のリスクをなるべく低くするには，角膜上皮細胞のサイトカイン遺伝子発現への影響の少ないMPSを選択し，角膜バリア機能をなるべく健全に保つことが重要と考えられる．文献1）大橋裕一，鈴木崇，原祐子ほか：コンタクトレンズ関連細菌性角膜炎の発症メカニズム．日コレ誌48：60-67,20062）InoueN,ToshidaH,MamadaNetal：Contactlens-inducedkeratitisinJapan.EyeContactLens33：65-69,20073）LevyB,HeilerD,NortonS：ReportontestingfromaninvestigationofFusariumkeratitisincontactlenswear-90.080.070.060.050.040.030.020.010.00.0：IL-8：TGF-b2：IL-6pg/m?1％HCOPBS（＋）1％Tetronic1％Poloxamer1ppmAlexidine1ppmPHMB0.5％Boricacid1.0％Boricacid図4配合成分で24時間処理したHCET細胞のサイトカイン産生量———————————————————————-Page61572あたらしい眼科Vol.25，No.11，2008（102）ers,EyeContactLens32：256-261,20064）星合竜太郎，濱田いずみ：レンズケアに対するコンタクトレンズ使用者の意識．日コレ誌49：119-123,20075）柳井亮二，植田喜一，西田輝夫ほか：市販多目的剤の消毒効果と細胞毒性の比較．日コレ誌49（補遺）：S13-S18,20076）外園千恵，今西二郎：サイトカイン．眼科NewInsight5（木下茂編），p154-165,メジカルビュー社，19957）Araki-SasakiK,OhashiY,SasabeTetal：AnSV40-immortalizedhumancornealepithelialcelllineanditscharacterization.InvestOphthalmolVisSci36：614-621,19958）XueML,ZhuH,WillcoxMDP：TheroleofIL-1betaintheregulationofIL-8andIL-6inhumancornealepitheli-alcellsduringPseudomonasaeruginosacolonization.CurrEyeRes23：406-414,20019）山下英俊：トランスフォーミング増殖因子ベータ（TGF-b）スーパーファミリーの眼組織における作用．日眼会誌101：927-947,199710）HuangX,McClellanSA,BarrettRPetal：IL-18contrib-utestohostresistanceagainstinfectionwithPseudomo-nasaeruginosathroughinductionofIFN-gammaproduc-tion.JImmunol168：5756-5763,200211）Santodomingo-RubidoJ,MoriO,KawaminamiS：Cyto-toxicityandantimicrobialactivityofsixmultipurposesoftcontactlensdisinfectingsolutions.OphthalPhysiolOpt26：476-482,200612）ImayasuM,ShiraishiA,OhashiYetal：Eectsofmulti-purposesolutionsoncornealepithelialtightjunctions.EyeContactLens34：50-55,200813）WangY,ZhangJ,YiXetal：ActivationofERK1/2MAPkinasepathwayinducestightjunctiondisruptioninhumancornealepithelialcells.ExpEyeRes78：125-136,2004＊＊＊