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レバミピド点眼液の角膜上皮に対する安全性に関する検討

admin — Wed, 30 Oct 2013 15:31:16 +0000

《原著》あたらしい眼科30（10）：1467.1471，2013cレバミピド点眼液の角膜上皮に対する安全性に関する検討福田正道＊1中嶋英雄＊2春田淳平＊2柴田伸亮＊1柴田奈央子＊1長田ひろみ＊1関祐介＊1三田哲大＊1佐々木洋＊1＊1金沢医科大学眼科学講座＊2大塚製薬株式会社赤穂研究所SafetyofRebamipideOphthalmicSuspensionforCornealEpithelialCells：InVitroandInVivoStudyMasamichiFukuda1）,HideoNakashima2）,JunpeiHaruta2）,ShinsukeShibata1）,NaokoShibata1）,HiromiOsada1）,YusukeSeki1）,NorihiroMita1）andHiroshiSasaki1）1）DepartmentofOphthalmology,KanazawaMedicalUniversity,2）AkoResearchInstitute,OtsukaPharmaceuticalCo.,Ltd.レバミピド点眼液（商品名：ムコスタR点眼液UD2％，防腐剤フリー）の角膜上皮に対する安全性について塩化ベンザルコニウム（benzalkoniumchloride：BAK）を対照に用いて評価した．①培養ヒト角膜上皮細胞（humancornealepithelialcellline：HCE-T）に0.001％，0.002％，0.005％，0.01％BAK溶液またはレバミピド点眼液を0，5，15，30，60分間接触させた後に細胞生存率を測定した．②家兎に0.002％，0.005％，0.01％BAK溶液またはレバミピド点眼液を単回点眼し1分後に涙液を回収してlactatedehydrogenase（LDH）活性を測定した．③また家兎に0.01％BAKまたはレバミピド点眼液を5分ごとに5回点眼し，最終点眼の2分後に角膜抵抗（cornealresistance：CR）を測定した．BAKは濃度および時間依存的に角膜上皮細胞の生存率を低下させたのに対し，レバミピド点眼液では細胞生存率の低下はみられなかった．BAKは濃度依存的に涙液LDH活性を増加させたのに対し，レバミピド点眼液群でのLDH活性は生理食塩液と同程度であった．また，BAK群ではレバミピド点眼液群と比較して有意にCR比が低値を示した．今回の結果からレバミピド点眼液は角膜上皮障害をひき起こすことはないと考えられ，安全面に優れたドライアイ治療薬である．Thisstudyevaluatedthesafetyofrebamipideophthalmicsuspension（MucostaRophthalmicsuspensionUD2％）,usingbenzalkoniumchloride（BAK）ascontrol.①Culturedhumancornealepithelial（HCE-T）cellswereincubatedwith0.001％,0.002％,0.005％or0.01％BAKsolution,orrebamipideophthalmicsuspensionfor0,5,15,30and60minutes；thecellswerecountedateachtimepointtocalculatethecellsurvivalrate（％）.②Rabbiteyeswereinstilledwith50μLof0.002％,0.005％or0.01％BAKsolution,orrebamipideophthalmicsuspension,andlactatedehydrogenase（LDH）inthetear.uidwasmeasuredat1minuteafterinstillation.③Rabbiteyesweretheninstilledwith50μLof0.01％BAKsolutionorrebamipideophthalmicsuspension5timesat5-minuteintervals；cornealresistance（CR）wasmeasuredat2minutesafterthelastinstillation.BAKsolutioncausedaconcentration-andtime-dependentdecreaseincellsurvivalrate,whereastherewasnocellsurvivalratedecreaseintherebamipideophthalmicsuspensiongroup.InstillationofBAKsolutionincreasedtearLDHactivityinacon-centration-dependentmanner；however,LDHactivityintherebamipideophthalmicsuspensiongroupwasatthesamelevelasthatinthesalinegroup.Also,BAKinstillationresultedinsigni.cantCRratiodecreasecomparedtorebamipideophthalmicsuspension.Theresultsoftheseinvitroandinvivostudiessuggestthatamongdryeyetherapeuticagents,rebamipideophthalmicsuspensionispotentiallysaferforpatients.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）30（10）：1467.1471,2013〕Keywords：レバミピド点眼液，塩化ベンザルコニウム（BAK），細胞生存率，涙液LDH活性，角膜抵抗．rebam-ipideophthalmicsuspension,benzalkoniumchloride（BAK）,cellviability,tearLDHactivity,cornealresistance.〔別刷請求先〕福田正道：〒920-0293石川県河北郡内灘町大学1-1金沢医科大学眼科学講座Reprintrequests：MasamichiFukuda,Ph.D.,DepartmentofOphthalmology,KanazawaMedicalUniversity,1-1Daigaku,Uchinada-machi,Kahoku-gun,Ishikawa920-0293,JAPAN0910-1810/13/\100/頁/JCOPY（123）1467はじめにドライアイの治療はこれまで人工涙液やヒアルロン酸ナトリウム点眼液による点眼治療が主流であり，一部重症例に対しては外科的治療が行われてきたが，最近，ジクアホソルナトリウム点眼液ならびにレバミピド点眼液が相ついで上市された．ジクアホソルナトリウム点眼液は結膜からの水分分泌促進作用1），角結膜からのムチン分泌促進作用2）を有することが報告されている．また，レバミピド点眼液については角結膜のムチン増加作用3,4）に加えて，結膜ゴブレット細胞の増加作用4）や角結膜上皮微細構造の修復作用5）などが報告されている．このように，さまざまな薬理作用を持ったドライアイ治療用点眼薬が複数開発されたことでドライアイの治療法は多様化し，その選択肢は広がっている．一般的に点眼薬には薬理作用に関与する主剤に加えて種々の添加物が含有されており，特に塩化ベンザルコニウム（benzalkoniumchlo-ride：BAK）に代表される防腐剤は優れた防腐効力を示す一方で，涙液が減少し角結膜に障害を有するドライアイ患者においてはその細胞障害性による悪影響が懸念される6.8）．このため薬理作用の違いだけでなく防腐剤の有無に関してもドライアイ治療用点眼薬の選択における重要な判断材料となる可能性がある．レバミピド点眼液は防腐剤フリーのユニットドーズ製剤であることから，防腐剤を含有する他のドライアイ治療用点眼薬に比べて細胞障害性に対する懸念は比較的少ないと推測される．本研究では培養ヒト角膜上皮細胞を用いた評価系（invitro試験）に加え，家兎での涙液中lactatedehydrogenase（LDH）量の測定ならびに角膜抵抗測定装置による評価法（invivo試験）によりBAKを対照としてレバミピド点眼液の角膜上皮に対する安全性を評価した．I実験材料1.使用薬剤2％レバミピド点眼液は，市販の商品名ムコスタR点眼液UD2％（大塚製薬）および塩化ベンザルコニウム（東京化成）を使用した．2.使用動物ニュージーランド成熟白色家兎（NZW；体重2.0.3.5kg）を本実験に使用した．動物の使用にあたり，金沢医科大学の動物使用倫理委員会の使用基準および「大塚製薬株式会社動物実験指針」を遵守して実施した．また，実験はARVO（TheAssociationforResearchinVisionandOphthalmolo-gy）のガイドラインに従って動物に負担がかからないように配慮して行った．3.使用細胞株細胞株はSV40不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T，購入元：理化学研究所）を使用し，10％fetalbovineserum（FBS）添加Dulbecco’sModi.edEagleMedium：Nutrient1468あたらしい眼科Vol.30，No.10，2013MixtureF-12（DME/F-12）培地で37℃，5％CO2下で培養した．4.角膜抵抗測定装置角膜抵抗（cornealresistance：CR）値の測定には，角膜抵抗測定装置（cornealresistancedevice，CRDFukudamodel2007）を用いた9,10）．本装置は角膜コンタクトレンズ（CL）電極（メイヨー製）とファンクション・ジェネレータ（Dagatron,Seoul，Korea），アイソレーター（BSI-2；BAKElectronicsInc.,USA）およびPowerLabシステム（ADInstruments，Australia）から構成されている．角膜CL電極はアクリル樹脂製で家兎角膜形状に対応する直径とベースカーブとを有している．弯曲凹面に設けられた関電極および不関電極の材質はいずれも金で，その外径（直径）はそれぞれ12mm，4.8mm，および幅が0.8mm，0.6mmである．測定条件は交流，周波数：1,000Hz，波形：duration，矩形波：5ms，電流：±50μAで設定した．II実験方法1.培養ヒト角膜上皮細胞によるレバミピド点眼液およびBAK溶液の安全性評価（invitro）HCE-Tを96wellプレートに播種し，10％FBS含有DME/F-12培地で37℃，5％CO2下で一昼夜培養した．FBS非含有培地で洗浄した後，培地（コントロール）またはBAK溶液（0.001％，0.002％，0.005％，0.01％；培地で希釈），レバミピド点眼液を0，5，15，30，60分間接触させた．培地で洗浄後，CellCountingKit-8（同仁化学）を添加し，37℃で3時間インキュベートした後，マイクロプレートリーダー（日本モレキュラーデバイス）で450nmにおける吸光度を測定した．培地接触0分における細胞数を100％として各被験液接触後の細胞生存率を求めた．また，各時間の細胞生存率を用いて回帰分析により50％細胞障害時間（50％celldamagetime：CDT50）値を算出した．各値は4例の平均値±標準誤差を示す．2.涙液LDHassayによるレバミピド点眼液およびBAK溶液の安全性評価（invitro）成熟白色家兎にBAK溶液（0.002％，0.005％，0.01％）またはレバミピド点眼液50μLを両眼に単回点眼し，1分後にマイクロキャピラリー（Drummond）で涙液を1μL回収した．生理食塩液で60μLにボリュームアップした後，LDH-細胞毒性テストワコー（和光純薬）を使用してLDH活性を測定した．なお，標準曲線の作成には精製LDH（オリエンタル酵母）を用いた．各値は8例の平均値±標準誤差を示す．3.角膜抵抗測定法によるレバミピド点眼液およびBAK溶液の安全性評価（invivo）成熟白色家兎に生理食塩液または0.01％BAK溶液，レバミピド点眼液50μLを5分ごとに両眼に5回点眼し，5回目（124）点眼終了の2分後にCRを測定した．CRの測定には角膜抵抗測定装置を用い，CR値（Ω）とCR比（％）の算出はつぎのように行った6,7）．CR値（Ω）＝電圧（V）/電極（A）CR比（％）＝点眼後のCR値/点眼前のCR値×100各値は4.6例の平均値±標準誤差を示す．4.統計解析コントロール群に対する各群の細胞生存率をTwo-wayrepeatedmeasuresANOVA（analysisofvariance）により検定するとともに，各測定時間でコントロール群に対するDunnett’stest（Two-tail）を実施した．LDH活性値は対数変換により正規化した後でBAK溶液については生理食塩液を含めてWilliams’test（Upper-tail）を行い，レバミピド点眼液については生理食塩液に対するStudent’st-testを行った．各群のCR比はStudent’st-testで解析した．いずれの検定も5％を有意水準とした．III結果1.培養ヒト角膜上皮細胞によるレバミピド点眼液およびBAK溶液の安全性評価（invitro）培地接触0分における細胞生存率（100％）に対する各被験液接触後の細胞生存率（平均値±標準誤差）を図1に示す．BAK溶液群の細胞生存率は濃度および時間依存的に低下し，Two-wayrepeatedmeasuresANOVAによる解析ではいずれの濃度のBAK溶液群においても細胞生存率は有意に低値を示した．0.001％BAK溶液群では30分後以降で有意に低値を示し，細胞生存率は30分で72.0±6.3％，60分で38.6140：Control（培地）：0.001％BAK溶液：0.005％BAK溶液：レバミピド点眼液：0.002％BAK溶液：0.01％BAK溶液120±6.9％であった．0.002％BAK溶液群の細胞生存率は15分後以降で有意に低値を示し，その値は15分後に28.7±6.0％，30分後に3.7±3.0％であった．0.005％および0.01％BAK溶液群の細胞生存率は接触5分後でそれぞれ4.9±1.6％および3.9±0.2％であった．一方，レバミピド点眼液群では60分後まで細胞生存率が低下することはなく，統計学的にもコントロール群に対して差は認められなかった（Two-wayrepeatedmeasuresANOVA）．細胞生存率から算出したCDT50値を表1に示す．BAK溶液群のCDT50（分）はBAK濃度に依存して短縮した（0.001％BAK溶液：49.88分，0.002％BAK溶液：13.91分，0.005％BAK溶液：2.63分，0.01％BAK溶液：2.60分）のに対して，レバミピド点眼液群ではコントロールと同様に60分以上であった．2.涙液LDHassayによるレバミピド点眼液およびBAK溶液の安全性評価（invitro）各被験液点眼後の涙液LDH活性値（平均値±標準誤差）を図2に示す．BAK溶液は濃度依存的にLDH活性を増加させ，生理食塩液群が474.0±62.0Unit/Lであったのに対し，0.002％BAK溶液群が1220.1±322.9Unit/L，0.005％BAK溶液群が4371.8±1502.2Unit/L，0.01％BAK溶液群表1培養ヒト角膜上皮細胞におけるレバミピド点眼液およびBAK溶液のCDT50（分）点眼液CDT50（分）Control（培地）＞60レバミピド点眼液＞600.001％BAK溶液0.002％BAK溶液0.005％BAK溶液0.01％BAK溶液49.8813.912.632.606040＊＊＃＃100,000＊＊＊＊細胞生存率（％）100涙液LDH活性（Unit/L）＊10,000NS1,000100＊＊＃＃10＊＊＃＃＊＊＃＃1時間（分）生理食塩液レバミピド0.002％0.005％0.01％点眼液BAK溶液BAK溶液BAK溶液図1培養ヒト角膜上皮細胞によるレバミピド点眼液およびBAK溶液の安全性評価（invitro）図2涙液LDHassayによるレバミピド点眼液およびBAK##p＜0.01vs.Control（培地）；Two-wayrepeatedmeasures溶液の安全性評価（invitro）ANOVA.＊p＜0.05，＊＊p＜0.01；Williams’test（Upper-tail）.＊＊p＜0.01vs.Control（培地）；Dunnett’stest（Two-tail）.NS：Notsigni.cant；Unpairedt-test.（125）あたらしい眼科Vol.30，No.10，20131469CR比（％）NSNS＊1201101009080生理食塩液レバミピド0.01％点眼液BAK溶液図3角膜抵抗測定法によるレバミピド点眼液およびBAK溶液の安全性評価（invivo）＊p＜0.05,NS：Notsigni.cant；Unpairedt-test.が21562.2±4801.4Unit/Lを示し，生理食塩液に対し0.002％BAK溶液で2.6倍，0.005％BAK溶液で9.22倍，0.01％BAK溶液で45.5倍に増加した．一方，レバミピド点眼液群のLDH活性は327.8±74.0Unit/Lを示し，生理食塩液群と同程度であった．3.角膜抵抗測定法によるレバミピド点眼液およびBAK溶液の安全性評価（invivo）角膜抵抗測定法におけるCR比（平均値±標準誤差）を図3に示す．0.01％BAK溶液群のCR比（91.7±2.9％）は生理食塩液群（101.1±3.3％）およびレバミピド点眼液群（111.1±5.8％）のいずれに対しても低値を示し，レバミピド群に対しては有意に低値であった．IV考按わが国ではドライアイ治療用点眼薬としてヒアルロン酸ナトリウム点眼液およびジクアホソルナトリウム点眼液に加えてレバミピド点眼液が上市され，近年点眼治療の選択肢が広がっており，これに伴い涙液の層別治療（tear.lmorientedtherapy：TFOT）の概念11）が提唱され，それぞれの点眼薬の薬理作用に基づいた治療が行われている．一般的に点眼薬には有効成分以外にもさまざまな添加物が含有されており，特にBAKおよび塩化ベンゼトニウム，グルコン酸クロルヘキシジンなどの防腐剤が角膜上皮に与える影響は無視できない6.8）．そこで今回レバミピド点眼液の角膜上皮に対する安全性についてBAKを対照にinvitroおよびinvivo試験系で評価した．まずinvitro試験として培養ヒト角膜上皮細胞を用いて細胞生存率を指標に検討した．BAK溶液は濃度および接触時間依存的に細胞生存率を低下させ細胞障害作用を示したのに対して，レバミピド点眼液ではコントロールと同様に1470あたらしい眼科Vol.30，No.10，2013CDT50は60分以上を示し，BAK溶液で検出されたような細胞障害性は認められなかった．この試験系は被験液の細胞障害作用を検出する方法としては非常に感度の高い評価系ではあるが，涙液による希釈が考慮されていない点，また重層化された角膜上皮とは異なり単層細胞である点において生体とは大きく異なる．そこで，生体での影響を推察するためにLDHassayおよび角膜抵抗測定法を用いたinvivo試験系にてさらなる検討を実施した．涙液中のLDH量はCLの装用12）やBAKの点眼11）により上昇することが報告されており，オキュラーサーフェスの障害を定量的に評価することのできる指標であることから本研究でもLDHassayにより細胞障害性を評価した．その結果，BAK溶液単回点眼後の涙液LDH活性は生理食塩液に対して0.002％BAK溶液で2.6倍，0.005％BAK溶液で9.22倍，0.01％BAK溶液で45.5倍を示し，BAKの濃度依存的に涙液中のLDH量が増加した．これは細胞膜が傷害されてLDHが涙液中に放出されたことを意味し，BAKは単回点眼でも細胞に障害を与えることが示唆された．これに対してレバミピド点眼液群のLDH活性は生理食塩液と同程度を示したことから，レバミピド点眼液の単回点眼によるオキュラーサーフェスへの影響はほとんどないと推測された．また，筆者らはこれまでに角膜抵抗測定法を用いて種々の点眼液の細胞障害性について検討してきた6,9,13,14）．そこで，本研究でもこの角膜抵抗測定法を用いて評価したところ，BAKが角膜抵抗を低下させる傾向を示したのに対して，レバミピド点眼液では角膜抵抗の低下を認めなかった．以上のことから，BAKが角膜上皮を含むオキュラーサーフェスに対して細胞障害性を示す可能性があること，ならびに防腐剤フリーのレバミピド点眼液は潜在的に安全面に優れたドライアイ治療薬であることが示唆された．今回明らかとなったBAKの細胞障害作用が臨床においてどの程度問題となるのかについては不明であるものの，ドライアイ患者では涙液が減少していることに加え，角結膜上皮に障害を有していることから正常眼と比較してBAKの影響を受けやすいと考えられ，BAKを含有するドライアイ治療薬を点眼することによって角結膜上皮障害が発症/増悪する可能性は否定できない．ドライアイ治療用点眼薬を選択する際には，個々の点眼薬の持つ薬理作用だけでなく，防腐剤の有無やその種類による角膜上皮障害の発症/増悪のリスクについても十分に考慮することが重要であると考える．文献1）FujiharaT,MurakamiT,FujitaHetal：ImprovementofcornealbarrierfunctionbytheP2Y2agonistINS365inaratdryeyemodel.InvestOphthalmolVisSci42：96-100,2001（126）2）FujiharaT,MurakamiT,NaganoTetal：INS365sup-presseslossofcornealepithelialintegritybysecretionofmucin-likeglycoproteininarabbitshort-termdryeyemodel.JOculPharmacolTher18：363-370,20023）UrashimaH,OkamotoT,TakejiYetal：Rebamipideincreasestheamountofmucin-likesubstancesontheconjunctivaandcorneaintheN-acetylcysteine-treatedinvivomodel.Cornea23：613-619,20044）UrashimaH,TakejiY,OkamotoTetal：Rebamipideincreasesmucin-likesubstancecontentsandperiodicacidSchi.reagent-positivecellsdensityinnormalrabbits.JOculPharmacolTher28：264-270,20125）中嶋英雄，浦島博樹，竹治康広ほか：ウサギ眼表面ムチン被覆障害モデルにおける角結膜障害に対するレバミピド点眼液の効果．あたらしい眼科29：1147-1151,20126）福田正道，矢口祐基，藤田信之ほか：ヒアルロン酸ナトリウム点眼液の角膜細胞に対する影響の検討．あたらしい眼科28：549-552,20117）Uema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ヒアルロン酸ナトリウム点眼液の角膜細胞に対する影響の検討

admin — Fri, 29 Apr 2011 15:24:24 +0000

0910-1810/11/\100/頁/JCOPY（93）549《原著》あたらしい眼科28（4）：549.552，2011c〔別刷請求先〕福田正道：〒920-0293石川県河北郡内灘町大学1-1金沢医科大学眼科学Reprintrequests：MasamichiFukuda,Ph.D.,DepartmentofOphthalmology,KanazawaMedicalUniversity,1-1Daigaku,Uchinadamachi,Kahoku-gun,Ishikawa920-0293,JAPANヒアルロン酸ナトリウム点眼液の角膜細胞に対する影響の検討福田正道矢口裕基藤田信之稲垣伸亮長田ひろみ柴田奈央子佐々木洋金沢医科大学眼科学EffectofSodiumHyaluronateEyedropsonCornealCellsMasamichiFukuda,HiromotoYaguchi,NobuyukiFujita,ShinsukeInagaki,HiromiOsada,NaokoShibataandHiroshiSasakiDepartmentofOphthalmology,KanazawaMedicalUniversity目的：市販のヒアルロン酸ナトリウム点眼液0.1％の角膜上皮細胞に対する安全性を従来の培養家兎由来角膜細胞株（SIRC）による評価法（invitro）および角膜抵抗測定装置を用いた評価法（invivo）により評価した．方法：SIRCにヒアレインR点眼液0.1％（以下，ヒアレイン），アイケアR点眼液0.1％（以下，アイケア），ティアバランスR点眼液0.1％（以下，ティアバランス）およびベンザルコニウム塩化物0.02％溶液（以下，BAK）を0，5，10，15，30および60分接触した際の細胞数を測定し，各測定時点の細胞数から細胞生存率（％）を算出した．また，角膜抵抗測定法では家兎の結膜.内に各点眼液およびBAKを5分ごと5回点眼し，点眼終了2分後の角膜抵抗（CR）を測定した．結果：Invitroによる評価ではヒアレインは接触時間の増加に伴い，生存率は徐々に減少し，接触60分後では64.3％まで減少した．一方，アイケアでは接触60分後で89.2％，ティアバランスでは92.7％とほぼ同程度の生存率を示し，細胞障害性はほとんど認められなかった．なお，BAKでは接触8分後で24.2％まで生存率は減少した．Invivoで一般的に汎用されている角膜染色による障害性評価ではBAK以外のいずれの製剤にも障害性は認められなかった．角膜抵抗測定法（CR比）による評価においても点眼前に対するCR比はヒアレインでは105.4±5.0％，アイケアでは110.8±16.4％，ティアバランスでは110.8±2.1％，BAKでは67.0±10.3％であった．結論：今回，従来から汎用されている角膜染色による障害性評価およびCR比によるinvivoでの評価においてはBAK以外のヒアルロン酸点眼液で角膜障害性は認められなかったものの，invitro試験の結果から，ティアバランスとアイケアの角膜障害性はほとんどなく，角膜障害はBAK＞ヒアレイン＞ティアバランス＝アイケアの順であった．Purpose：Theeffectofcommerciallyavailableeyedropscontaining0.1％sodiumhyaluronateoncornealepithelialcellswasevaluatedinvitrobyaconventionalmethodusingculturedstatensseruminstitutrabbitcornea（SIRC）cells,andinvivobycornealresistance（CR）measurement.Methods：CulturedSIRCcellswereincubatedwithHyaleinR0.1％eyedrops（Hyalein）,EyecareR0.1％eyedrops（Eyecare）,TearbalanceR0.1％eyedrops（Tearbalance）or0.2％benzalkoniumchloridesolution（BAK）for0,5,10,15,30and60min；thecellswerethencountedateachtimepointtocalculatethecellsurvivalrate（％）.TomeasureCR,eachoftheeyedropsandBAKwereadministeredtotheconjunctivalsacsoftherabbits5timesevery5min；CRwasmeasured2minafteradministration.Results：TheinvitroevaluationshowedthatcellsurvivalratesgraduallydecreasedascellcontacttimewithHyaleinincreased.After60minofcellcontactwithHyalein,theratedecreasedto64.3％.Ontheotherhand,cellsurvivalratesafter60minofcontactwithEyecareandTearbalancewere89.2％and92.7％,respectively,almostcomparablerates；almostnocelldamagewasobservedaftercontactwithEyecareandTearbalance.Incontrast,BAKdecreasedthecellsurvivalrateto24.2％after8minofcontactwiththecells.Thecornealstainingexaminationwidelyusedforinvivoassessmentofcornealinjuriesdisclosednodifferencesbetweentheeyedrops,exceptingBAK.CRratio,asdeterminedbyCRmeasurementbeforeandaftereyedropadministration,was105.4±5.0％forHyalein,110.8±16.4％forEyecare,110.8±2.1％forTearbalanceand67.0±10.3％forBAK.Conclusion：Inthisstudy,cornealinjuryinvivoevaluationbywidelyusedconventionalcornealstainingandCRratiomeasurementdisclosednocornealinjuriescausedbysodiumhyaluronateeyedrops,exceptingBAK.TheresultsofinvitroexaminationindicatedthatTearbalanceandEyecaredidnotcausecornealcelldamage.Resultsshowedthatthe550あたらしい眼科Vol.28，No.4，2011（94）はじめにヒアルロン酸ナトリウム点眼液はSjogren症候群，Stevens-Johnson症候群，眼球乾燥症候群（ドライアイ）などの内因性疾患および術後，薬剤性，外傷，コンタクトレンズ（CL）装用などによる外因性疾患に伴う角膜上皮障害治療用点眼薬として，わが国では1995年から発売されている．その作用機序はヒアルロン酸ナトリウムが自身の保水性とともに，フィブロネクチンと結合し，その作用を介して上皮細胞の接着，伸展を促進するといわれている1～4）．本剤の眼科臨床での貢献度は大きく，先発品のヒアレインRに加えて後発品が多数開発され市販されている．筆者らは先にヒアレインRおよび各後発品について培養家兎由来角膜細胞（SIRC）株による評価法（invitro）を用いて角膜上皮細胞に対する安全性を評価し，各点眼液に含まれる添加物の違いにより角膜上皮細胞に対する影響が異なることを確認している5）．今回，SIRCによる評価法（invitro）に加え，角膜抵抗測定装置による評価法（invivo）を用いて，各ヒアルロン酸ナトリウム点眼液の角膜上皮への影響を検討した．I実験材料1.試験薬剤（表1）ヒアルロン酸ナトリウム点眼液0.1％にはヒアレインR点眼液0.1％（以下，ヒアレイン）〔参天製薬（株）〕，アイケアR点眼液0.1％（以下，アイケア）〔科研製薬（株）〕，ティアバランスR点眼液0.1％（以下，ティアバランス）〔千寿製薬（株）〕および，ベンザルコニウム塩化物0.02％溶液（以下，BAK）〔東京化成（株）〕を使用した．2.使用動物ニュージーランド成熟白色家兎（NZW；体重3.0～3.5kg，雄性，16羽）を本実験に使用した．動物の使用にあたり，金沢医科大学動物使用倫理委員会の使用基準に従うとともにARVO（TheAssociationforResearchinVisionandOphthalmology）のガイドラインに従い，動物への負担配慮を十分に行い施行した．3.使用細胞株使用細胞株はSIRC（ATCCCCL60），10％fetalbovineserum（FBS）添加Dulbecco’smodifiedEagle’smedium（DME）培地で37℃，5％CO2下で培養した．4.角膜抵抗測定装置角膜電極は弯曲凹面に関電極および不関電極を同心円状に配設し，両電極が測定時に家兎の角膜表面に接するようにした．電気抵抗計装置から関電極および不関電極間に電流を通電し，その電気抵抗を測定することで角膜の電気抵抗を測定した6）．角膜抵抗値（CR）の測定にはつぎのような筆者らが開発した角膜抵抗測定装置〔CRD（Cornealresistancedevice）Fukudamodel2007〕を用いた6）．角膜CL電極（メイヨー製）とファンクション・ジェネレータ（Dagatron,Seoul,Korea），アイソレーター（BSI-2；BAKElectronics,INC.USA）およびPowerLabシステム（ADInstruments,Australia）を使用した．角膜CL電極はアクリル樹脂製でウサギ角膜形状に対応すcornealepithelialdamageobservedwas,intheorderofdecreasingseverity,BAK＞Hyalein＞Tearbalance＝Eyecare.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）28（4）：549.552,2011〕Keywords：角膜抵抗，培養家兎由来角膜細胞株，ヒアルロン酸ナトリウム点眼液，角膜上皮障害，生体眼．cornealresistance,culturedstatensseruminstitutrabbitcorneacells,sodiumhyaluronateeyedrops,cornealepithelialdamage,livingeyes.表1試験製剤とその添加物製品名ヒアレインティアバランスアイケア（処方変更前）アイケア（処方変更後）添加物防腐剤ベンザルコニウム塩化物クロルヘキシジングルコン酸塩ベンゼトニウム塩化物クロルヘキシジングルコン酸塩液その他イプシロン-アミノカプロン酸，エデト酸ナトリウム，塩化カリウム，塩化ナトリウム，pH調節剤ホウ酸，ホウ砂，塩化ナトリウム，塩化カリウムリン酸二水素カリウム，リン酸水素ナトリウム水和物，塩化ナトリウム，エデト酸ナトリウム水和物，ポリソルベート80トロメタモール，pH調節剤，等張化剤pH6.0～7.06.5～7.56.0～7.06.8～7.8浸透圧比0.9～1.10.9～1.10.9～1.10.9～1.1製造販売元参天製薬㈱千寿製薬㈱科研製薬㈱科研製薬㈱（95）あたらしい眼科Vol.28，No.4，2011551る直径とベースカーブを有している．弯曲凹面に設けられた関電極および不関電極の材質はいずれも金で，その外径（直径）は，それぞれ12mm，4.8mm，幅が0.8mm，0.6mmである．測定条件は，交流周波数：1,000Hz，波形：duration，矩形波：5ms，電流：±50μAで設定した．II実験方法1.SIRCによる評価（invitro）SIRC（2×105cells）を35mmdishで10％FBS添加DME培地37℃，5％CO2下でコンフルエント状態になるまで5日間培養後，各点眼液（1,000μl）あるいはBAKを0～60分間接触後，細胞数をコールターカウンター法で測定した．薬剤非接触細胞での細胞数を100として，細胞生存率（％）を算出した．2.角膜抵抗測定法による評価（invivo）（図1）成熟白色家兎の結膜.内に各点眼液あるいはBAKを5分ごと5回（1回50μl）点眼し，点眼終了2分後の角膜抵抗（CR）を測定した．1群に家兎4眼を使用した．CRの測定法には角膜抵抗測定装置を用い，CR値（W）とCR比（％）の算出はつぎのように行った．CR（W）＝電圧（V）/電流（A）＝（mV×10.3）/（100μA×10.6）CR比（％）＝点眼後のCR×100/点眼前のCR3.フルオレセイン染色法による角膜障害の評価各点眼薬による角膜上皮障害の有無は点眼終了2分，30分，60分後に1％フルオレセインナトリウム溶液2μlを結膜.内に点眼し，細隙灯顕微鏡下で観察した．4.統計学的処理検定法はStudent’st-testで行い，有意水準は0.05未満とした．III結果1.SIRCによる評価（invitro）ヒアレインでは接触時間の経過とともに，徐々に生存率は減少し，接触60分後では64.3％まで減少した．一方，アイケアでは接触60分後で89.2％，ティアバランスでは92.7％とほぼ同程度の生存率を示し，細胞障害性はほとんどみられなかった．薬剤と培養細胞の接触時間が30分以上経過するとヒアレインと2種点眼液の細胞障害の程度に有意な差が生じた（p＜0.05）．BAKの接触8分後では24.2％まで生存率は減少した（図2）．2.角膜抵抗測定法による評価（invivo）角膜抵抗測定法によるCR比は，ヒアレインが105.4±5.0％（平均±標準偏差）であったのに対して，アイケアでは110.8±16.4％，ティアバランスでは110.8±2.1％であった．3種点眼液間には有意差はなく，いずれも角膜抵抗測定法によるCR比の低下はなかった．BAKでは67.0±10.3％まで低下した（表2）．3.フルオレセイン染色法による角膜障害の評価（invivo）フルオレセイン染色によるAD分類では，どの点眼薬においても，A0D0であった．BAKでは溶液接触2分後ではA2D2程度の障害がみられた．IV考按ヒアルロン酸ナトリウム点眼液は1995年にヒアレインが発売になり，その後後発品が多数発売されている．いずれの後発品も先発品のヒアレインとの生物学的同等性試験により表2角膜抵抗測定法による評価（invivo）試験製剤角膜抵抗（CR）比（％）アイケアR点眼液0.1％110.8±16.4ティアバランスR点眼液0.1％110.8±2.1ヒアレインR点眼液0.1％105.4±5.0ベンザルコニウム塩化物0.02％溶液67.0±10.3図1角膜抵抗測定装置（Current＝±50μA，Frequency＝1,000Hz）IsolatorPowerLabTrigger(Functiongenerator)ContactlenselectrodesComputer＋－図2培養家兎由来角膜細胞による評価（invitro）100120806040200020406080生存率（％）時間（分）＊＊：アイケア（0.1％）：ヒアレイン（0.1％）：ティアバランス（0.1％）：BAK（0.02％）＊：p＜0.05％552あたらしい眼科Vol.28，No.4，2011（96）効果に差がないことは認められているが，主成分であるヒアルロン酸ナトリウム以外の添加物（防腐剤，溶解補助剤，界面活性剤，他）が異なるために，安全性，特に点眼液で重要な角膜障害性については同一とはいえない．そこで，すでに筆者らはSIRCに対する影響に関する検討を行い，先発品ヒアレインおよびヒアレインミニ，後発品（アイケア，ヒアール，ヒアロンサン，ティアバランス）のヒアルロン酸ナトリウム点眼液0.1％の安全性を評価した結果，配合されている防腐剤の影響が大きく，ベンザルコニウム塩化物とベンゼトニウム塩化物は角膜障害性が大きく，エデト酸ナトリウムの関与が考えられ，クロルヘキシジングルコン酸塩やパラベン類の角膜への影響は比較的小さいものと考えられた5,8,9）．今回使用したアイケアは前回使用のアイケア中の防腐剤であるベンゼトニウム塩化物をクロルヘキシジングルコン酸塩液に変更した．変更理由としては，アイケアが角膜上皮障害の治療薬であるため，点眼液に必要な保存効力を維持しながら，さらに，細胞障害性を軽減させることである．対照点眼液としてティアバランス，ヒアレインを用いて比較検討した．その結果，処方変更後のアイケアを接触させたときの細胞生存率はティアバランスとほぼ同等で，角膜上皮障害はほとんどみられなかった．処方変更後のアイケアとリン酸緩衝液を比較検討したところ，ほぼ同等の結果が得られた．さらにこの結果を，すでに筆者らが報告したベンゼトニウム塩化物を含む処方変更前のアイケアの結果と比較すると，有意に角膜障害性が軽減されていた．先発品であるヒアレインでは既報とほぼ一致する細胞障害性を示したことは，ベンゼトニウム塩化物やベンザルコニウム塩化物はクロルヘキシジングルコン酸塩に比べ細胞障害性が強いことを示すものであった5）．Invivoの実験ではいずれの点眼液においても生体眼でのCR値の低下はみられず，フルオレセイン染色においても角膜上皮障害は確認されなかった．この点はinvitroの成績とは大きく異なり，invivoでは細胞障害を生じにくい傾向がみられたが，この原因は涙液や角膜上皮細胞の生理的条件が異なるためと推測している．しかし，ヒアルロン酸ナトリウム点眼液はドライアイなどすでに角膜に障害がある患者に使用される薬剤であり，本実験で行った正常家兎眼での結果をそのまま適応して考えることはできない．ドライアイ患者などのハイリスク群では，添加剤の角膜障害性の影響はより大きくなることが予想されるため，十分注意が必要である．今回，市販の各種ヒアルロン酸ナトリウム点眼液の角膜障害性をSIRC細胞で評価した結果，薬剤と培養細胞の接触時間が30分以上経過すると各点眼液の細胞障害の程度に有意な差が生じた．検討した点眼液の角膜障害性はクロモグリク酸ナトリウム点眼液やジクロフェナクナトリウム点眼液あるいはマレイン酸チモロール点眼液に比べて少なかった7,8）が，治療の対象となる疾患が角膜障害を有する点でこれらの薬剤での結果と同一レベルの安全基準で評価することはできない．ヒアルロン酸ナトリウム点眼液の障害性は配合されている添加物，特にベンザルコニウム塩化物やベンゼトニウム塩化物などの第四アンモニウム塩による影響が大きいと考えられた．正常な生理的条件下であれば，これらの防腐剤を含むヒアルロン酸ナトリウム点眼液であっても角膜障害は発症しにくいと考えるが，涙液量が少なく角膜上皮の状態が悪い症例においては，より角膜障害を生じにくい薬剤の選択が重要であると考える．文献1）LaurentTC：Biochemistryofhyaluronan.ActaOtolaryngolSuppl442：7-24,19872）GoaKL,BenfieldP：Hyaluronicacid.Areviewofitspharmacologyanduseasasurgicalaidinophthalmology,anditstherapeuticpotentialinjointdiseaseandwoundhealing.Drugs47：536-566,19943）北野周作，大鳥利文，増田寛次郎：0.3％ヒアルロン酸ナトリウム点眼液の重症角結膜上皮障害に対する効果．あたらしい眼科10：603-610,19934）NishidaT：Extracellularmatrixandgrowthfactorsincornealwoundhealing.CurrOpinOphthalmol4：4-13,19935）福田正道，山本佳代，佐々木洋：ヒアルロン酸ナトリウム点眼液の培養家兎角膜細胞に対する障害性．医学と薬学56：385-388,20066）福田正道，山本佳代，高橋信夫ほか：角膜抵抗測定装置による角膜障害の定量化の検討．あたらしい眼科24：521-525,20077）福田正道，佐々木洋：オフロキサシン点眼薬とマレイン酸チモロール点眼薬の培養角膜細胞に対する影響と家兎眼内移行動態．あたらしい眼科26：977-981,20098）福田正道，佐々木洋：ニューキノロン系抗菌点眼薬と非ステロイド抗炎症点眼薬の培養家兎由来角膜細胞に対する影響．あたらしい眼科26：399-403,20099）福田正道，村野秀和，山代陽子ほか：グルコン酸クロルヘキシジン液の培養角膜上皮細胞に対する影響．眼紀56：754-759,2005＊＊＊

角膜抵抗測定装置によるプロスタグランジン関連点眼薬の角膜障害の評価

admin — Mon, 29 Nov 2010 15:28:19 +0000

0910-1810/10/\100/頁/JCOPY（99）1581《原著》あたらしい眼科27（11）：1581.1585，2010c〔別刷請求先〕福田正道：〒920-0293石川県河北郡内灘町大学1-1金沢医科大学眼科学Reprintrequests：MasamichiFukuda,Ph.D.,DepartmentofOphthalmology,KanazawaMedicalUniversity,1-1Daigaku,Uchinadamachi,Kahoku-gun,Ishikawa-ken920-0293,JAPAN角膜抵抗測定装置によるプロスタグランジン関連点眼薬の角膜障害の評価福田正道＊1佐々木洋＊1高橋信夫＊1吉川眞男＊4北川和子＊1佐々木一之＊1,2,3＊1金沢医科大学眼科学＊2金沢医科大学総合医学研究所環境原性視覚病態研究部門＊3東北文化学園大学医療福祉学部リハビリテーション学科視覚機能学＊（4有）メイヨーEvaluationofCornealDisordersCausedbyProstaglandinDerivativeOphthalmicSolutionsUsingaCornealResistanceMeasuringDeviceMasamichiFukuda1）,HiroshiSasaki1）,NobuoTakahashi1）,MasaoYoshikawa4）,KazukoKitagawa1）andKazuyukiSasaki1,2,3）1）DepartmentofOphthalmology,KanazawaMedicalUniversity,2）DivisionofVisionResearchforEnvironmentalHealth,MedicalResearchInstitute,KanazawaMedicalUniversity,3）VisualScienceCourse,DepartmentofRehabilitation,FacultyofMedicalScienceandWelfare,TohokuBunkaGakuenUniversity,4）MayoCorporation目的：角膜抵抗測定装置を用いて，4種類のプロスタグランジン関連薬の家兎眼の角膜上皮に対する安全性（invivo）を評価し，さらに培養兎由来角膜細胞障害性（invitro）との相関性を検討した．方法：培養兎由来角膜細胞株にキサラタンR点眼液（以下，キサラタン），ルミガンR点眼液（以下，ルミガン），トラバタンズR点眼液（以下，トラバタンズ）あるいはトラバタンR点眼液（以下，トラバタン）を0～60分間接触後の生存細胞数を測定し，各点眼薬の50％細胞致死時間（CDT50）を算出した．角膜抵抗測定法では，家兎の結膜.内に各点眼液を15分ごと3回点眼し，点眼終了2分，30分，60分後の角膜抵抗（CR）を測定した．結果：各点眼薬のCDT50（分）はトラバタンズ51.0分，ルミガン50.5分，トラバタン25.3分，およびキサラタン11.6分の順であった．CR測定ではトラバタンの［点眼後CR×100/点眼前CR］（CR比）は点眼終了で30分後81.0％，キサラタンは点眼終了2分後で82.0％でいずれも有意に低下した（p＜0.05）．一方，トラバタンズおよびルミガンではCR比の低下はみられなかった．結論：角膜抵抗測定装置で得た結果は培養角膜細胞による結果と相関性がみられ，生体眼でのプロスタグランジン関連薬の角膜障害性を評価するうえで有用であった．また，いずれの方法においても，角膜障害は，キサラタン＞トラバタン＞トラバタンズ＝ルミガンであった．Objectives：Safetyof4prostaglandinderivativepreparationsforrabbitcornealepitheliumwasevaluatedinvivo,usingacornealresistancemeasuringdevice.Correlationwithcytotoxicityagainstculturedrabbitcornealcellsevaluatedinvitrowasalsoanalyzed.Methods：Culturedcellsofarabbit-derivedcornealcelllinewereexposedtotheophthalmicsolutionsXalatanR,LumiganR,TravatanzRorTravatanRfor0-60minutesandviablecellswerecounted,followedbycalculationofexposuretimecausing50％celldamage（CDT50）foreachsolution.Cornealresistance（CR）wasmeasuredat2,30and60minutesaftercompletionof3eyedropdoses（instilledatintervalsof15minutes）totheconjunctivalsacofeachrabbit.Results：CDT50was51.0minuteswithTravatanzR,50.5minuteswithLumiganR,25.3minuteswithTravatanRand11.6minuteswithXalatanR.CRratio（post-treatmentCR×100/pre-treatmentCR）was81.0％withTravatanR（30minutesafterendoftreatment）and82.0％withXalatanR（2minutesafterendoftreatment）,indicatingsignificantreductionofCRtreatmentwiththesetwopreparations（p＜0.05）.CRdidnotdecreaseaftertreatmentwithTravatanzRorLumiganR.Conclusion：Theseresultssuggestthatthecytotoxiceffectswere：XalatanRophthalmicsolution＞TravatanRophthalmicsolution＞TravatanzRophthalmicsolution＝LumiganRophthalmicsolution.Thedataoncornealresistancecorrelatedwiththedatafromculturedcornealcells,reflectingtheusefulnessofcornealresistanceasanindicatorofcornealinjurybyprostaglandinderivativesinvivo.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）27（11）：1581.1585,2010〕1582あたらしい眼科Vol.27，No.11，2010（100）はじめに一般に点眼薬には，有効性，安全性，安定性，さし心地という4つの条件が求められ，そのために主薬のほか種々の添加剤が加えられている．抗菌薬，抗ウイルス薬，抗真菌薬，非ステロイド薬，抗緑内障薬および表面麻酔薬などさまざまな点眼薬で比較的高頻度に発現する副作用である角膜上皮障害は，頻回点眼，多剤併用および長期連用ではさらにその発症頻度が高くなる．角膜上皮障害の原因として，添加剤である防腐剤が注目されている．筆者らはこれまでに，培養兎由来角膜細胞による評価法（invitro）や角膜抵抗測定装置による評価法（invivo）を用いて，種々の点眼薬の角膜上皮細胞に対する安全性を評価している1,2）．本研究では4種類のプロスタグランジン関連薬の角膜上皮への影響を，invitroおよびinvivoの実験系で評価し，薬剤により異なる原因，および評価系の相関について検討した．I実験材料1.試験薬剤つぎの点眼薬について検討した．また，これらの製剤のおもな成分については表1に示した．・キサラタンR点眼液0.005％（ファイザー）：主成分ラタノプロスト（プロスタグランジンF2a誘導体）（以下，キサラタンと略す）・トラバタンズR点眼液0.004％（日本アルコン）：主成分トラボプロスト（プロスタグランジンF2a誘導体）（以下，トラバタンズと略す）・トラバタンR点眼液（アルコン）：主成分トラボプロスト（プロスタグランジンF2a誘導体）（以下，トラバタンと略す）・ルミガン点眼液0.03％（千寿製薬）：主成分ビマトプロスト（プロスタマイド誘導体）（以下，ルミガンと略す）を用いた．2.使用動物ニュージーランド成熟白色家兎（NZW；体重3.0～3.5kg）（雄性，16羽）を本実験に使用した．動物の使用にあたり，金沢医科大学の動物使用倫理委員会の使用基準に従い，そのうえ，実験はARVO（TheAssociationforResearchinVisionandOphthalmology）のガイドラインに従って，動物に負担が掛らないように，配慮して行った．3.使用細胞株細胞株は家兎由来角膜細胞（ATCCCCL60）（以下，SIRCと略す）を使用し，10％fetalbovineserum（FBS）添加Dulbecco’smodifiedEagle（DME）培地で37℃，5％CO2下で培養した．4.角膜抵抗測定装置角膜電極は湾曲凹面に関電極および不関電極を同心円状に配設し，両電極が測定時に家兎の角膜表面に接するようにした．さらに，電気抵抗計装置から関電極および不関電極間に電流を通電し，その電気抵抗を測定することで角膜の電気抵抗を測定する3）．角膜抵抗値（以下，CRと略す）の測定には図1に示した角膜抵抗測定装置（Cornealresistancedevice,CRDFukudamodel2007）を用いた．本装置は角膜CL電極（メイヨー製）とファンクション・ジェネレータ（Dagatron,Seoul,Korea），アイソレーター（BSI-2；BAKElectronics,Inc.USA），およびPowerLabシステム（ADInstruments,Australia）から構成されている．角膜CL電極はアクリル樹脂製でウサギ角〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）27（11）：1579.1583,2010〕Keywords：角膜抵抗，培養角膜細胞株，プロスタグランジン関連薬，角膜上皮障害，生体眼．cornealresistance,culturedcornealcellline,prostaglandinderivatives,cornealepithelialinjury,eyeinvivo.表14種のプロスタグランジン系緑内障点眼剤の組成点眼液トラバタンR点眼液0.004％トラバタンズR点眼液0.004％キサラタンR点眼液ルミガンR点眼液0.03％有効成分トラボプロスト40μg（1ml中）トラボプロスト40μg（1ml中）ラタノプロスト50μg（1ml中）ビマトプロスト300μg（1ml中）添加物ベンザルコニウム塩化物ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油40，トロメタノール，ホウ酸，マンニトール，pH調整剤2成分，EDTA（エチレンジアミン四酢酸）ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油40，プロピレングリコール，ホウ酸，D-ソルビトール，塩化亜鉛，pH調整剤2成分ベンザルコニウム塩化物リン酸水素二ナトリウム，リン酸二水素ナトリウム，等張化剤ベンザルコニウム塩化物リン酸水素ナトリウム水和物，塩化ナトリウム，クエン酸水和物，塩酸，水酸化ナトリウム（101）あたらしい眼科Vol.27，No.11，20101583膜形状に対応する直径とベースカーブとを有している．湾曲凹面に設けられた関電極および不関電極の材質はいずれも金で，その外径（直径）は，それぞれ，12mm，4.8mmおよび，幅が0.8mm，0.6mmである．測定条件は交流，周波数：1,000Hz，波形：矩形波，duration：5ms，電流：±50μAで設定した．II実験方法1.培養兎由来角膜細胞による評価（invitro）SIRC（2×105cells）を10％FBS添加DME培地37℃，5％CO25日間培養後，各点眼液（200μl）を0～60分間接触後，細胞数をコールターカウンター法で測定した．薬剤非接触細胞での細胞数を100として，細胞生存率（％）を算出した．その後，各種点眼薬の50％細胞致死時間（以下，CDT50）を算出した．CDT50（分）は生存率（％）をもとにして，2次方程式の解の公式，aX2＋bX＋c＝0（≠0），X＝.b±b2－4ac/2aにより求めた．Y軸に値が50％となるときのX軸値を2次方程式から求め，これをCDT50（分）値とした．2.角膜抵抗測定法による評価（invivo）成熟白色家兎の結膜.内にキサラタン，ルミガン，トラバタンズあるいはトラバタンを15分ごと3回（1回50μl）点眼し，点眼終了2分，30分，60分後のCRを測定した．家兎を4群に分けて，1群に4眼を使用した．CRの測定法には角膜抵抗測定装置を用い，CR値（W）とCR比（％）の算出はつぎのように行った．CR（W）＝電圧（V）/電流（A）＝（mV×10.3）/100μA×10.6CR比（％）＝点眼後のCR×100/点眼前のCR3.フルオレセイン染色法による角膜障害の評価各点眼薬による角膜上皮障害の有無は点眼終了2分，30分，60分後に1％fluoresceinsodium2μlを結膜.内に点眼し，細隙灯顕微鏡下で観察した．染色の程度はAD分類5）により評価した．4.統計学的処理検定はStudent’st-testを行い，有意水準は0.05％とした．III結果1.培養兎由来角膜細胞による評価（invitro）SIRCに対する評価では，トラバタンの生存率は接触30分後まではトラバタンズとほぼ同程度の生存率を示したが，接触60分時点では50.0％にまで減少しトラバタンズに比べて有意に減少した（p＜0.05）．ルミガンでは接触時間の経過とともに，徐々に生存率は減少した．一方，キサラタンでは接触時間とともに生存率は減少し，接触8分後では17.1％にまで減少した（図2）．各種点眼薬のCDT50はトラバタンズ51.0分，ルミガン50.5分，トラバタン25.3分，キサラタン11.6分の順であった．2.角膜抵抗測定法による評価（invivo）角膜抵抗測定法によるCR比は，トラバタン81.0％（点眼終了30分後），キサラタン82.0％（点眼終了2分後）とそれぞれ有意に低下した（p＜0.05）が，その後，時間の経過とともに回復した．一方，トラバタンズではどの時点もほとんど低下はみられなかった．ルミガンにおいても，CR（％）の低Trigger（Functiongenerator）IsolatorPowerLab（current＝±50μA，frequency＝1,000Hz）ComputerContactlenselectrodes図1角膜抵抗測定装置の図0生存率（％）10203040時間（分）50607080＊＊p＜0.001：トラバタン120100806040200：トラバタンズ：キサラタン：ルミガン図2培養兎由来角膜細胞による評価（invitro）010203040506070CR（％）時間（分）140120100806040200：トラバタン：トラバタンズ：キサラタン：ルミガン図3角膜抵抗測定法による評価（invivo）1584あたらしい眼科Vol.27，No.11，2010（102）下はみられず，むしろ，わずかに高い値を示す傾向がみられた（図3）．3.フルオレセイン染色法による角膜障害の評価（invivo）フルオレセイン染色によるAD分類では，トラバタンはA1D1（点眼終了30分後）（4眼中4眼），キサラタンはA1D2（点眼終了2分後）（4眼中4眼）であった．トラバタンズとルミガンでは各時点においてもA0D0（各4眼中4眼）であった（図4）．IV考按今回，実験に用いた角膜抵抗測定装置は，これまでにいくつかの改良を加えて，得られる値の信頼性，生体に対する安全性を確立した筆者らが開発した装置であり，薬剤の角膜上皮障害の評価方法として有用性が高いことを報告している3）．すなわち，本測定装置は，家兎眼の角膜上に電極を埋め込んだコンタクトレンズを装着して，交流電流を通電し，コンピュータ上に電圧を表示させ，電流と電圧の関係から抵抗値を算出するシステムで，invitroの実験系ではみることのできない角膜上皮バリア機能の回復過程を家兎眼でリアルタイムに定量的に確認することができる．培養角膜細胞（invitro）による実験系はSIRC細胞に各点眼薬を接触し，経時的に細胞数を測定して，CDT50（分）を算出するもので，筆者らはこれまでに，数多くの点眼薬の安全性の評価にこの方法を用いて行ってきた．この評価方法は測定感度が高いこと，データの再現性が良いこと，実験操作が簡便であることなどの長所を有する．一方，短所としては単層細胞系で生体眼での生理学的な現象と異なる環境であるため，得られたデータがどの程度，生体眼での影響を反映しているか不明の点がある．そこで，これらの異なる評価方法により，4種のプロスタグランジン系関連薬の角膜上皮細胞への影響の比較と合わせて，評価方法から得られた結果の相関性を明らかにする目的で検討を行った．その結果，CR比では，ベンザルコニウム塩化物（以下，BAKと略す）0.015％含有のトラバタンは81.0％（点眼終了30分後），BAK0.02％含有のキサラタンは82.0％（点眼終了2分後）にそれぞれ低下したが，時間の経過とともにいずれもCR値は上昇した．BAKを含まないトラバタンズとBAK0.005％含有のルミガンはいずれの時点でもCR比の低下はほとんどみられなかった．ルミガンでは点眼前に比べて，点眼後はわずかではあるが高値を示す傾向がみられたが，この原因は点眼薬中の添加剤であるクエン酸などが影響しているのではないかと考えている．このときの角膜上皮のフルオレセイン染色による評価ではキサラタンが最も障害がA1D2A0D0A0D0A1D1トラバタントラバタンズルミガン点眼終了30分後点眼終了30分後点眼終了30分後点眼終了2分後キサラタン図4フルオレセイン染色法による角膜障害例（103）あたらしい眼科Vol.27，No.11，20101585強く，ついでトラバタンで，トラバタンズとルミガンでは明らかな障害はみられず，角膜抵抗の結果と一致した．Invitro試験としてのSIRC細胞の60分接触の生存率では，トラバタンがトラバタンズに比べ有意に低下した（p＜0.05％）．また，CDT50についてもトラバタンズとルミガンに比べてキサラタンとトラバタンは短く，細胞障害を起こしやすい傾向がみられた．このようなトラバタンとトラバタンズの角膜障害の差は，おそらくBAKの有無によるものと考えられ，過去にもいくつかの報告がある5,6）．BAKを含まないトラバタンズでもinvitroの実験では細胞生存率が薬剤接触直後から30～40％の減少がみられたが，この原因は細胞死によるものではなく，点眼薬中のポリオキシエチレン硬化ヒマシ油40による細胞間の密着性の低下による細胞脱落が原因である可能性が高いと考えている．しかしinvivoの実験においては，涙液の存在のために角膜上のポリオキシエチレン硬化ヒマシ油40が希釈され，角膜上皮の構造が密で重層であることから影響が生じにくかったものと思われる．角膜上皮バリア機能の回復に関しては，Wolasinの家兎角膜細胞での報告によると，最表層1層のみの.離なら健常レベルに回復するまで1時間程度で，この程度では蛋白合成阻害の影響を受けない．一方，翼状細胞までの.離では健常レベルに回復するまでに8～10時間を要し，この過程では蛋白合成阻害の影響を受けることが知られている7）．今回の実験で得られた生体眼でのCR値はおそらく，角膜上皮障害の程度と回復状態を反映していると考える．以上の結果はinvitro（培養兎由来角膜細胞）とinvivo（角膜抵抗測定およびフルオレセイン染色）による評価法はよく相関していることを示したものと考えてよい．したがって，生理的条件が異なるため培養細胞での細胞障害の結果をそのまま臨床評価に結び付けることはできないが，培養細胞の評価は生体眼での成績を予測する有用な検討方法と考える．本研究から4種類のプロスタグランジン関連薬で角膜上皮への影響に差があることを改めて確認できた．ただし，正常な角膜に対する1日1回の単剤点眼であれば，BAK含有点眼薬であっても，細胞障害をひき起こすことはほとんどないと考えられる．しかし，角膜が脆弱なあるいは他の点眼薬の併用が必要な緑内障患者では，できる限り角膜障害の少ない点眼薬を使用したい．最近，配合剤が点眼コンプライアンスの向上および角膜上皮障害の低減の面から注目されているが，最適な薬剤の選択には十分な眼圧下降効果を有することも考慮することが重要である．文献1）福田正道，佐々木洋：オフロキサシン点眼薬とマレイン酸チモロール点眼薬の培養角膜細胞に対する影響と家兎眼内移行動態．あたらしい眼科26：977-981,20092）福田正道，佐々木洋：ニューキノロン系抗菌点眼薬と非ステロイド抗炎症点眼薬の培養家兎由来角膜細胞に対する影響．あたらしい眼科26：399-403,20093）福田正道，山本佳代，高橋信夫ほか：角膜抵抗測定装置による角膜障害の定量化の検討．あたらしい眼科24：521-525,20074）MiyataK,AmanoS,SawaMetal：Anovelgradingmethodforsuperficialpunctatekeratopathymagnitudeanditscorrelationwithcornealepithelialpermeability.ArchOphthalmol121：1537-1539,20035）PellinenP,LokkilaJ：Cornealpenetrationintorabbitaqueoushumoriscomparablebetweenpreservedandpreservative-freetafluprost.OphthalmicResearch4：118-122,20096）YeeRW,NorcomEG,ZhaoXC：Comparisonoftherelativetoxicityoftravoprost0.004％withoutbenzalkoniumchlorideandlatanoprost0.005％inanimmortalizedhumancorneaepithelialcellculturesystem.AdvTher23：511-518,20067）WolosinJM：Regenerationofresistanceandiontransportinrabbitcornealepitheliumafterinducedsurfacecellexfoliation.JMembrBiol104：45-55,1988＊＊＊