抗緑内障点眼薬の角膜障害におけるIn Vitro スクリーニング試験：SV40 不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T）を用いた細胞増殖抑制作用の比較

admin — Wed, 30 Apr 2008 06:07:35 +0000

———————————————————————-Page1（131）???0910-181008\100頁JCLS《原著》あたらしい眼科25（4）：553～556，2008?〔別刷請求先〕伊藤吉將：〒577-8502東大阪市小若江3-4-1近畿大学薬学部製剤学研究室Reprintrequests：??????????????????????????????????????????????????????????????-?-??????????????????-????????????????-???????????抗緑内障点眼薬の角膜障害における????????スクリーニング試験：SV40不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T）を用いた細胞増殖抑制作用の比較長井紀章＊1伊藤吉將＊1,2岡本紀夫＊3川上吉美＊4＊1近畿大学薬学部製剤学研究室＊2同薬学総合研究所＊3兵庫医科大学眼科学教室＊4兵庫医科大学病院治験センターAn????????ScreeningTestforCornealDamagesbyVariousAnti-GlaucomaEyeDrops：ComparisonofSuppressiontoCellGrowthofCornealEpithelialCellLineSV40（HCE-T）byThemNoriakiNagai1）,YoshimasaIto1,2）,NorioOkamoto3）andYoshimiKawakami4）1）????????????????????2）????????????????????????????????????????????????????????????????????3）????????????????????????????????????????????????????????4）???????????????????????????????????????????????????????????????長期にわたる抗緑内障薬点眼薬の使用は角膜障害をひき起こすことが知られている．これまで????????角膜上皮細胞増殖抑制試験にはヒト正常角膜上皮細胞が用いられてきたが，細胞増殖率のばらつきが大きく，採取されたヒト角膜の個体差のため点眼薬の角膜上皮細胞増殖抑制作用に関する評価試験には不向きであった．今回，正常角膜上皮細胞の代わりにSV40不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T）を用い点眼薬の????????角膜上皮細胞増殖抑制について検討を行った．点眼薬はb遮断薬，プロスタグランジン製剤，炭酸脱水酵素阻害薬，選択的交感神経a1遮断薬，a，b受容体遮断薬そして副交感神経作動薬の7種を用いた．本研究の結果，HCE-T細胞増殖抑制効果の強さはイソプロピルウノプロストン（レスキュラ?）＞ラタノプロスト（キサラタン?）≫マレイン酸チモロール（チモプトール?）＞塩酸ブナゾシン（デタントール?）＞ニプラジロール（ハイパジール?）＞塩酸ドルゾラミド（トルソプト?）≫塩酸ピロカルピン（サンピロ?）の順であり，HCE-Tはばらつきが少なく，正常ヒト角膜上皮細胞に代わり????????角膜上皮細胞増殖抑制試験に使用できることが明らかとなった．Theselectionofanti-glaucomaeyedropsiscomplicated,sincetheirlong-termusecausescornealdamage.Although????????cornealcellproliferationdisordertestinghavebeendoneusingnormalhumancornealepithelialcell（HCEC）,theHCECarenotsuitableforresearchintocornealdamagebyanti-glaucomaeyedropsasHCEChavevariousgrowthratesindependenceonindividualdi?erencesbetweenhumancorneasusedassources.Weinvestigatedthee?ectsofanti-glaucomaeyedropsonproliferationofthehumancornealepithelialcelllineSV40（HCE-T）,using7preparations：b-blocker,prostaglandinagent,topicalcarbonicanhydraseinhibitor,a1-blocker,a,b-blockerandparasympathomimeticagent.Cellproliferationinhibitionbytheeyedropsdecreasedinthefollowingorder：isopropylunoproston（Rescula?）＞latanoprost（Xalatan?）≫timololmaleate（Timoptol?）＞bunazosinhydro-chloride（Detantol?）＞nipradiol（Hypadil?）＞dorzolamidehydrochloride（Trusopt?）≫pilocarpinehydrochloride（San-pilo?）.TheseresultsshowthattheproposedmethodusingHCE-Tissuitableforresearchingcornealdamagecausedbyanti-glaucomaeyedrops.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）25（4）：553～556,2008〕Keywords：緑内障，SV40不死化ヒト角膜上皮細胞，b遮断薬，プロスタグランジン製剤，炭酸脱水酵素阻害薬．glaucoma,humancorneaepithelialcelllineSV40,b-blocker,prostaglandinagent,topicalcarbonicanhydraseinhibitor.———————————————————————-Page2???あたらしい眼科Vol.25，No.4，2008（132）インキュベーター内で24時間培養したものを実験に用いた．実際の操作法として，PBS（リン酸緩衝食塩水）または薬剤を含んだ培地（未処理群培地25??，PBS50??；薬剤処理群培地25??，PBS25??および薬剤25??）にて24時間培養後，各wellにTetraColorONE（生化学社製）20??を加え，37℃，5％CO2インキュベーター内で1時間処理を行い，マイクロプレートリーダー（BIO-RAD社製）にて490nmの吸光度（Abs）を測定した．本実験における細胞増殖性はTetra-ColorONEを用い，テトラゾリウム塩が生細胞内ミトコンドリアのデヒドロゲナーゼにより生産されたホルマザンを測定することで表した．各薬剤とも，1回の実験に同一薬剤6～8wellを用い，同実験を3～5回くり返した．本研究では，細胞増殖抑制率は下記の計算式により算出した．細胞増殖抑制率（％）＝（Abs未処理－Abs薬剤処理）/Abs未処理×100また，得られた細胞増殖抑制率から50％細胞増殖抑制時希釈率（EC50）を算出した．EC50の算出は近似曲線の方程式から計算により求めた．II結果1.抗緑内障点眼薬による角膜上皮細胞増殖抑制効果図1には種々抗緑内障点眼薬処理におけるHCE-T増殖抑制効果について示した．プロスタグランジン製剤であるレスキュラ?は，希釈率80倍までは高い細胞増殖抑制を示し，今回用いた抗緑内障点眼薬のなかで最も強い細胞増殖抑制作用を示した．レスキュラ?についで細胞増殖抑制作用を有したのは希釈率56倍まで強い細胞増殖抑制作用を示したキサラタン?であり，こちらもプロスタグランジン製剤であった．プロスタグランジン製剤のつぎに高い細胞増殖抑制作用を示したのはb遮断薬であるチモプトール?であり，希釈率24倍まで高い細胞増殖抑制を示した．選択的交感神経a1遮断薬であるデタントール?，a，b受容体遮断薬であるハイパジール?はともに希釈率8倍までは約90％の細胞増殖抑制はじめに抗緑内障薬による角膜障害には，点眼薬中に含まれる主薬，添加剤，防腐剤だけでなく，角膜知覚，涙液動態および結膜といったオキュラーサーフェス（眼表面）の状態が関与することが明らかとされ，臨床（???????）と基礎（????????）両方面からの観察が重要である1）．しかしながら，プロスタグランジン製剤など，多くの抗緑内障点眼薬が開発され，臨床で使用されているにもかかわらず，これら????????実験による抗緑内障点眼薬が角膜上皮細胞へ及ぼす影響に関する報告は十分とはいえない．この理由として，正常ヒト角膜上皮細胞は世代による個体差のばらつきが大きく扱いがむずかしいこと，抗緑内障薬の種類が豊富であるため，正常ヒト角膜上皮細胞を用いた????????上皮細胞増殖抑制試験には多くの経費が必要となることが考えられる．したがって，低コストでばらつきの少ない????????上皮細胞増殖抑制試験系を確立することは臨床的に非常に重要であると考えられる．今回，SV40不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T）を用い，現在臨床現場で多用されているb遮断薬（チモプトール?），プロスタグランジン製剤（レスキュラ?，キサラタン?），炭酸脱水酵素阻害薬（トルソプト?），選択的交感神経a1遮断薬（デタントール?），a，b受容体遮断薬（ハイパジール?），副交感神経作動薬（サンピロ?）など，異なる抗緑内障点眼薬7種を用いた????????角膜上皮細胞増殖抑制試験について検討を行った．I対象および方法1.使用細胞培養細胞は理化学研究所より供与されたSV40不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T，RCBNo.1384）を用い，100IU/m?ペニシリン（GIBCO社製），100?g/m?ストレプトマイシン（GIBCO社製）および5.0％ウシ胎児血清（FBS，GIBCO社製）を含むDMEM/F12培地（GIBCO社製）にて培養した．2.使用薬物抗緑内障点眼薬は市販製剤であるb遮断薬（0.5％チモプトール?），プロスタグランジン製剤（0.12％レスキュラ?，0.005％キサラタン?），炭酸脱水酵素阻害薬（1％トルソプト?），選択的交感神経a1遮断薬（0.01％デタントール?），a，b受容体遮断薬（0.25％ハイパジール?），副交感神経作動薬（1％サンピロ?）の7種を用いた．表1には本研究で用いた抗緑内障薬の臨床における点眼回数および防腐剤の種類と濃度を示す．3.抗緑内障点眼薬による細胞処理法HCE-T（50×104個）をフラスコ（75cm2）内に播種し，80％コンフルーエンスとなるまで培養した2,3）．この細胞を0.05％トリプシンにて?離し，細胞数を計測後，96wellプレートに100??（10×104———————————————————————-Page3あたらしい眼科Vol.25，No.4，2008???（133）通常細胞数確保のため実験に用いられる培養第4世代の正常ヒト角膜上皮細胞は，起源（ロット）によるばらつきが大きく扱いがむずかしいといった欠点を有している．筆者らも今回の実験前に使用したが，ロット間，培養世代により細胞増殖性にばらつきがあり（第4世代正常ヒト角膜上皮細胞増殖性の変動係数；30.88％，0.25cells/cm2にて播種後3日間培養），このように多種にわたる点眼剤の角膜上皮細胞増殖抑制作用に関する評価実験には不向きであると考えられた．近年，佐々木らにより確立されたSV40にて不死化されたヒト角膜上皮細胞（HCE-T）は細胞増殖性のばらつきも少なく（第4世代HCE-T細胞増殖性の変動係数；4.70％，0.25cells/cm2にて播種後3日間培養）多くの研究に用いられており，正常ヒト角膜上皮細胞とほぼ同等の性質を有することが報告されている5）．したがって，このHCE-Tは????????実験における抗緑内障点眼薬による角膜上皮細胞増殖抑制作用に関する評価に利用できると考えられた．本研究では，HCE-Tを用い，同一条件下における抗緑内障点眼薬処理が角膜分裂機能へ与える影響を検討するため，異なる7種の抗緑内障点眼薬が角膜上皮細胞増殖に及ぼす影響について検討を行った．プロスタグランジン製剤であるレスキュラ?およびキサラタン?は他の抗緑内障点眼薬と比較し高い細胞増殖抑制作用を有することが明らかとなった．b遮断薬であるチモプトール?は選択的交感神経a1遮断薬であるデタントール?，a，b受容体遮断薬ハイパジール?より細胞増殖抑制作用は高かったものの，プロスタグランジン製剤に比べその作用は明らかに低かった．実際の臨床現場において，抗緑内障点眼薬による角膜上皮細胞増殖抑制作用はプロスタグランジン製剤やb遮断薬で高頻度にみられることはすでによく知られており6），筆者らが示したプロスタグランジン製剤が強い細胞増殖抑制作用を有することと一致が認められた．しかし，b遮断薬であるチモプトール?はプロスタグランジン製剤に比べその細胞増殖抑制作用は明らかに低く，臨床で高頻度に角膜上皮細胞増殖抑制作用が認められるという報告と矛盾が認められた．大槻らはb遮断薬による角膜障害は薬物自身の毒性と涙液分泌能低下によるものであることを報告している7）．このことから，b遮断薬による角膜上皮細胞増殖抑制作用は涙液分泌能低下が薬物自身の毒性を上昇させているのではないかと示唆された．一方，点眼回数が1日3回である炭酸脱水酵素阻害薬トルソプト?はプロスタグランジン製剤やa，b遮断薬に比べ低い細胞増殖抑制作用を示した．このことは炭酸脱水酵素阻害作用を有する主薬（塩酸ドルゾラミド）自身の角膜上皮細胞への細胞増殖抑制作用が低いためではないかと考えられた．今回の研究で細胞増殖抑制作用が最も低かったのが副交感神経作動薬であるサンピロ?であった．点眼薬には品質の劣化を防ぐ目的で防腐剤が添加されている．防率を示したが，希釈率24倍ではそれぞれ約48％へ細胞増殖抑制率の低下が認められた．また，炭酸脱水酵素阻害薬であるトルソプト?も，希釈率8倍までは90％以上の細胞増殖抑制率を示したが，希釈率24倍では約40％とデタントール?やハイパジール?よりやや低い抑制率を示した．今回用いた抗緑内障点眼薬のなかで最も弱い抑制率を示したのは副交感神経作動薬であるサンピロ?であり，その抑制率は希釈率4倍で79％，希釈率8倍では46％であった．本実験で用いた抗緑内障のEC50（希釈率）はレスキュラ?（99.09）＞キサラタン?（70.35）?チモプトール?（29.90）＞デタントール?（23.16）＞ハイパジール?（20.11）＞トルソプト?（17.47）?サンピロ?（7.49）の順に低値を示した．III考按角膜上皮は5～6層の細胞層から構成され，基底細胞と表層細胞に大きく分けられる．このうち基底細胞は分裂増殖機能と接着機能を，表層細胞はバリア機能および涙液保持機能を担っている．この4つの機能のどれか1つでも破綻した際角膜上皮障害が認められるが，なかでも薬剤の影響を特に受けやすいとされているのが分裂機能とバリア機能である4）．臨床での抗緑内障点眼薬点眼による角膜障害性の検討においては，基礎疾患を除外した対象を選択し，年齢を揃え，点眼処理を同一条件としても，個体差およびオキュラーサーフェスの状態にばらつきが生じるという問題がある．一方，ヒト角膜上皮細胞を用いた????????実験は個体差やオキュラーサーフェスの状態の要因をすべて同一条件の状態で評価することが可能なため，薬剤自身による角膜上皮細胞への影響を検討することが可能である．これまでの????????試験における抗緑内障点眼薬による角膜上皮細胞増殖抑制作用に関する評価は正常ヒト角膜上皮細胞を用いて行われてきた．しかし，———————————————————————-Page4???あたらしい眼科Vol.25，No.4，2008（134）角膜上皮細胞増殖抑制試験に使用できることが明らかとなった．以上，本研究では同一条件下において，抗緑内障点眼薬自身が有する細胞増殖抑制作用の強さを明らかにした．これら細胞増殖抑制作用は，臨床においては涙液能低下などの他の作用により相乗的に角膜上皮細胞増殖抑制作用をひき起こすと考えられることから，今回の????????の結果を基盤とし，臨床でさらなる解析を行うことで，薬剤の選択が容易になるものと考えられた．また，HCE-Tは正常ヒト角膜上皮細胞に代わり，????????角膜上皮細胞増殖抑制試験に使用可能であることが明らかとなった．角膜上皮細胞増殖能は角膜の修復能と透過性にもつながるため，角膜障害性を反映するものと考えられ，これらの報告は今後の角膜研究および抗緑内障点眼薬投与時における薬物選択を決定するうえで一つの指標になるものと考えられた．文献1）徳田直人，青山裕美子，井上順ほか：抗緑内障薬が角膜に及ぼす影響：臨床と????????での検討．聖マリアンナ医科大学雑誌32：339-356,20042）ToropainenE,RantaVP,TalvitieAetal：Culturemodelofhumancornealepitheliumforpredictionofoculardrugabsorption.?????????????????????????42：2942-2948,20013）TalianaL,EvansMD,DimitrijevichSDetal：Thein?uenceofstromalcontractioninawoundmodelsystemoncornealepithelialstrati?cation.?????????????????????????42：81-89,20014）俊野敦子，岡本茂樹，島村一郎ほか：プロスタグランディンF2aイソプロピルウノプロストン点眼薬による角膜上皮障害の発症メカニズム．日眼会誌102：101-105,19985）Araki-SasakiK,OhashiY,SasabeTetal：AnSV40-immortalizedhumancornealepithelialcelllineanditscharacterization.?????????????????????????36：614-621,19956）青山裕美子：緑内障の薬物治療─抗緑内障点眼薬と角膜．?????????????????????,4：132-147,20037）大槻勝紀，横井則彦，森和彦ほか：b遮断剤の点眼が眼表面に及ぼす影響．日眼会誌105：149-154,20018）青山裕美子，本木正師，橋本真理子：各種抗緑内障点眼薬のヒト角膜上皮細胞に対する影響．日眼会誌108：75-83,2004腐剤は点眼薬の種類によって異なっており，その濃度も均一ではなく，この防腐剤が細胞増殖抑制をひき起こす要因の一つとされている8）．本研究ではサンピロ?のみが防腐剤にパラベン類を使用しており，他の6剤は塩化ベンザルコニウムが用いられていた．細胞増殖抑制の要因の一つである防腐剤のなかで特に塩化ベンザルコニウムの角膜上皮細胞への毒性が強く，サンピロ?の防腐剤であるパラベン類は角膜分裂機能にほとんど影響を与えないことはすでに報告されている6）．これらのことから，サンピロ?が他の抗緑内障点眼薬と比較しほとんど細胞増殖抑制作用を示さないのは防腐剤の種類の相違によるものと考えられた．今回のHCE-Tを用いた結果において，抗緑内障点眼薬の細胞増殖抑制作用はレスキュラ?＞キサラタン?≫チモプトール?＞デタントール?＞ハイパジール?＞トルソプト?≫サンピロ?の順に低値を示した．防腐剤である塩化ベンザルコニウム含有量が最も高いのは0.02％のキサラタン?であるが，細胞増殖抑制作用が最も高いのは塩化ベンザルコニウム濃度が0.005％とキサラタン?の4分の1であるレスキュラ?であった．また，a，b受容体遮断薬ハイパジール?に含まれる塩化ベンザルコニウムは0.002％と塩化ベンザルコニウム0.005％を含むトルソプト?よりも低いが，その細胞増殖抑制作用はトルソプト?より高かった．この結果は添加されている塩化ベンザルコニウムの量のみでは説明することができなかった．一方，主薬の含有濃度を比較すると，レスキュラ?は0.12％，キサラタン?では0.005％とレスキュラ?のほうが明らかに高く，界面活性作用を有するポリソルベート8

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