あたらしい眼科オンラインジャーナル » SV40 不死化ヒト角膜上皮細胞

セリシン添加抗緑内障薬がSV40 不死化ヒト角膜上皮細胞増殖作用へ与える影響

admin — Wed, 29 Sep 2010 15:30:54 +0000

0910-1810/10/\100/頁/JCOPY（129）1295《原著》あたらしい眼科27（9）：1295.1298，2010cはじめに現在の臨床における治療法としては，抗緑内障点眼薬による薬物療法が第一選択とされている．一方，点状表層角膜症や眼瞼炎といった眼局所の副作用や，患者からのしみる，かすむ，眼が充血するといった訴えで点眼薬の中止および変更を余儀なくされ，薬剤選択が困難なことや眼圧コントロールが問題視されている．これら抗緑内障薬の角膜傷害には，点眼薬中に含まれる主薬，保存剤だけでなく，角膜知覚，涙液動態および結膜といったオキュラーサーフェス（眼表面）の生理状態が関与することが明らかとされ，臨床と基礎研究の両方面からの観察が抗緑内障薬の低角膜傷害性療法開発には重要である1）．カイコ繭は絹糸になるフィブロイン（70～80％）とそれを包むセリシン（20～30％）から構成されている．従来，この〔別刷請求先〕伊藤吉將：〒577-8502東大阪市小若江3-4-1近畿大学薬学部製剤学研究室Reprintrequests：YoshimasaIto,Ph.D.,FacultyofPharmacy,KinkiUniversity,3-4-1Kowakae,Higashi-Osaka,Osaka577-8502,JAPANセリシン添加抗緑内障薬がSV40不死化ヒト角膜上皮細胞増殖作用へ与える影響長井紀章＊1村尾卓俊＊1伊藤吉將＊1,2岡本紀夫＊3＊1近畿大学薬学部製剤学研究室＊2同薬学総合研究所＊3兵庫医科大学眼科学教室SericinAdditiontoAnti-glaucomaEyeDrops：EffectonProliferationofCornealEpithelialCellLineSV40（HCE-T）NoriakiNagai1）,TakatoshiMurao1）,YoshimasaIto1,2）andNorioOkamoto3）1）FacultyofPharmacy,2）PharmaceutialResearchandTechnologyInstitute,KinkiUniversity,3）DepartmentofOphthalmology,HyogoCollegeofMedicine抗緑内障薬は臨床にて多用されているが，長期にわたる使用は角膜傷害をひき起こすことが知られている．本研究ではSV40不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T）を用い，角膜傷害治癒作用を有するセリシンを抗緑内障薬へ添加することによる角膜上皮細胞増殖抑制作用への影響について検討を行った．抗緑内障薬は市販製剤であるb遮断薬（チモプトールR），プロスタグランジン製剤（レスキュラR，キサラタンR），炭酸脱水酵素阻害薬（トルソプトR），選択的交感神経a1遮断薬（デタントールR），a，b受容体遮断薬（ハイパジールR），副交感神経作動薬（サンピロR）の7種を用いた．本研究の結果，抗緑内障薬へセリシンを添加することにより，角膜上皮細胞増殖抑制作用の強さは各種単剤処理時と比較し軽減した．このセリシンによる軽減効果は，今回用いたすべての点眼薬において認められた．本知見は，低刺激点眼薬開発を目指すうえできわめて有用であると考えられる．Anti-glaucomaeyedropsarefrequentlyusedinclinicaltreatment,anditisknownthattheirlong-termusecancausecornealepithelialcelldamage.Inthisstudy,weinvestigatedtheeffectofthesericinadditiontovariousanti-glaucomaeyedropsoncornealepithelialcelllineSV40（HCE-T）proliferation.Usedinthisstudywere7eyedroppreparations：b-blocker（TimoptolR）,prostaglandinagent（ResculaR，XalatanR）,topicalcarbonicanhydraseinhibitor（TrusoptR）,a1-blocker（DetantolR）,a,b-blocker（HypadilR）andparasympathomimeticagent（SanpiloR）.Withthecombinationofsericinandanti-glaucomaeyedrops,cellproliferationinhibitiondecreasedincomparisonwithuseofasingletypeofconventionalanti-glaucomaeyedrops.Theresultsofcombiningsericinandanti-glaucomaeyedropsprovideusefulinformationfordevelopmentofanti-glaucomaeyedropsthatdonotcausecornealepithelialcellsdamage.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）27（9）：1295.1298,2010〕Keywords：セリシン，抗緑内障薬，SV40不死化ヒト角膜上皮細胞，緑内障，細胞増殖．sericin,anti-glaucomaeyedrops,humancorneaepithelialcelllineSV40,glaucoma,cellproliferation.1296あたらしい眼科Vol.27，No.9，2010（130）カイコ繭由来の絹蛋白質であるセリシンは，生糸から絹糸への精錬の過程において除去され廃棄物として扱われていた．しかし近年，細胞死抑制作用など生物化学領域においてその活性が認められ注目されている2）．筆者らもこれまで，このセリシンに角膜傷害治癒促進効果があることを見出し，眼科領域におけるセリシンの有効利用の可能性を報告してきた3）．さらに筆者らは以前に，抗緑内障点眼薬の角膜傷害におけるinvitroスクリーニング試験として，抗緑内障点眼薬の角膜傷害性比較を目的とした基礎（invitro）実験系「ヒト角膜上皮細胞を用いたinvitro角膜傷害試験」を確立し報告してきた4）．そこで今回，現在臨床現場で多用されているb遮断薬（チモプトールR），プロスタグランジン製剤（レスキュラR，キサラタンR），炭酸脱水酵素阻害薬（トルソプトR），選択的交感神経a1遮断薬（デタントールR），a，b受容体遮断薬（ハイパジールR），副交感神経作動薬（サンピロR）の異なる抗緑内障点眼薬7種へセリシンを添加することで，角膜傷害性がどのように変化するのかを明らかにすべく，このinvitro角膜傷害試験法4）を用いて検討を行った．I対象および方法1.使用細胞培養細胞は理化学研究所より供与されたSV40不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T，RCBNo.1384）を用い，100IU/mlペニシリン（GIBCO社製），100μg/mlストレプトマイシン（GIBCO社製）および5％ウシ胎児血清（FBS，GIBCO社製）を含むDMEM/F12培地（GIBCO社製）にて培養した．2.使用薬物抗緑内障点眼薬は市販製剤であるb遮断薬（0.5％チモプトールR），プロスタグランジン製剤（0.12％レスキュラR，0.005％キサラタンR），炭酸脱水酵素阻害薬（1％トルソプトR），選択的交感神経a1遮断薬（0.01％デタントールR），a，b受容体遮断薬（0.25％ハイパジールR），副交感神経作動薬（1％サンピロR）の7剤を用いた．セリシン（30kDa）はセイレーン株式会社より供与されたものを用いた．3.抗緑内障点眼薬による細胞処理法HCE-T（50×104個）をフラスコ（75cm2）内に播種し，HCE-Tがフラスコ中に80％存在するようになるまで培養した5,6）．この細胞を，0.05％トリプシンにて.離し，細胞数を計測後，96穴プレートに100μl（10×104個）ずつ播種し，37℃，5％CO2インキュベーター内で24時間培養したものを実験に用いた．表1には今回用いた抗緑内障薬に含まれる添加物を，表2にはセリシンおよび抗緑内障点眼薬の添加量を示す〔抗緑内障薬はPBS（リン酸緩衝生理食塩水）にて希釈を行った〕．表2に示した添加量にて24時間培養後，各wellにTetraColorONE（生化学社製）20μlを加え，37℃，5％CO2インキュベーター内で1時間処理を行い，マイクロプレートリーダー（BIO-RAD社製）にて490nmの吸光度（Abs）を測定することで細胞増殖抑制を表した．各処理とも培地中に含まれるpHインジケーターのフェノールレッドが中性を示すことを確認し，同実験を3.7回くり返した．本研究では，細胞増殖抑制率は下記の計算式により算出した4）．細胞増殖抑制率（％）＝（Abs未処理.Abs薬剤処理）/Abs未処理×100筆者らはすでに，今回用いた抗緑内障には細胞増殖抑制率の変動が認められ，その細胞増殖抑制率が約50％となる薬剤希釈率はレスキュラR（98）＞キサラタンR（70）＞チモプトールR（30）＞デタントールR（22）＞ハイパジールR（22）＞トルソプトR（18）＞サンピロR（6）であることを報告している．この結果を基に本実験では，細胞増殖抑制率の変動が認められる薬剤希釈率を用いた4）．また，セリシン（pH7）は終濃度0.1％となるように設定し行った．II結果図1には，細胞増殖抑制率が約50％となる薬剤希釈率付表1各種抗緑内障点眼薬に含まれる添加物抗緑内障点眼薬添加物チモプトールRベンザルコニウム塩化物，リン酸二水素Na，水酸化Na，リン酸水素NaレスキュラRベンザルコニウム塩化物，ポリソルベート80，等張化剤，pH調節剤キサラタンRベンザルコニウム塩化物，リン酸二水素Na，等張化剤，リン酸水素Na，トルソプトRベンザルコニウム塩化物，ヒドロキシエチルセルロース，D-マンニトール，クエン酸Na，塩酸デタントールRベンザルコニウム塩化物，濃グリセリン，ホウ酸，pH調節剤ハイパジールRベンザルコニウム塩化物，リン酸二水素K，リン酸水素Na，塩酸，塩化NaサンピロRパラオキシ安息香酸プロピル，パラオキシ安息香酸メチル，クロロブタノール，酢酸Na，ホウ酸，ホウ砂，pH調節剤表2抗緑内障点眼薬の添加量培地PBS薬剤セリシン未処理50μl50μl0μl0μl単剤処理50μl25μl25μl0μlセリシン添加薬剤処理50μl0μl25μl25μlPBS：リン酸緩衝生理食塩水．（131）あたらしい眼科Vol.27，No.9，20101297近における角膜上皮細胞増殖抑制効果と，これら薬剤処理群にセリシンを添加した際の角膜上皮細胞増殖抑制率の変化を示す．薬剤のみの刺激ではいずれの処理群においても30～80％程度の細胞増殖抑制効果であった．この希釈率における抗緑内障に0.1％セリシンを添加したところ，本実験で用いたすべての抗緑内障点眼薬群において有意な細胞増殖抑制効果の低下が認められた．III考按抗緑内障薬による角膜傷害性の程度を検討するにあたり，その評価法の選択は非常に重要である．角膜上皮は5～6層の細胞層から構成され，基底細胞と表層細胞に大きく分けられる．このうち基底細胞は分裂増殖機能と接着機能を，表層細胞はバリア機能および涙液保持機能を担っている．この4つの機能のどれか1つでも破綻した際角膜上皮傷害が認められるが，なかでも薬剤の影響を特に受けやすいとされているのが分裂機能とバリア機能である7）．筆者らは以前に，抗緑内障点眼薬の角膜傷害におけるinvitroスクリーニング試験として，抗緑内障点眼薬の傷害性比較を目的としたinvitro角膜実験を確立し報告してきた4）．このHCE-Tによるinvitro角膜実験は，個体差やオキュラーサーフェスの状態の要因をすべて同一条件の状態で評価することが可能なため，薬剤自身が有する角膜上皮細胞分裂機能への影響を検討するのに適している．そこで本研究では，臨床現場で多用されている7種の異なる抗緑内障点眼薬の角膜傷害性が，セリシンと併用することでどのように変化するのかについてこのinvitro角膜実験を用いて検討した．HCE-Tを用いた結果において，抗緑内障点眼薬の細胞増殖抑制作用はレスキュラR＞キサラタンR≫チモプトールR＞デタントールR＞ハイパジールR＞トルソプトR≫サンピロRの順であった4）．この結果は，実際の臨床現場における抗緑内障点眼薬による角膜上皮傷害の頻度と類似していた．一方，いずれの抗緑内障薬もセリシンを組み合わせることで抗緑内障薬単剤処理と比較し細胞増殖抑制率が有意に軽減された．セリシンは細胞増殖促進作用を有することが知られており，筆者らもまたこのHCE-T細胞へのセリシン処理により細胞増殖が増大することを報告している3）．したがって，このセリシンの細胞増殖促進作用が抗緑内障薬による角膜上皮細胞増殖傷害の軽減をもたらすものと示唆された．一方で，点眼薬調製には主薬以外にもさまざまな添加物が用いられている（表1）．添加物は点眼薬の種類において異なっており，その濃度も均一ではない．なかでも品質の劣化を防ぐ目的で用いられる保存剤ベンザルコニウム塩化物は細胞増殖抑制をひき起こす主要な要因とされている．今回用いた7種の抗緑内障薬においても細胞傷害性を示すと考えられる添加物であるベンザルコニウム塩化物，ポリソルベート80，パラベン類，ホウ酸をはじめ多くの添加物が用いられていた．これら多くの異なる添加物を含む抗緑内障薬7種すべてにおいて，セリシンが有意にその角膜上皮細胞増殖傷害の軽減を示したという結果は，セリシンの角膜上皮細胞増殖促進効果が現在点眼薬調製に用いられている添加物においてほとんど影響を受けないことを意味し，点眼製剤への新規添加物としてセリシンの応用が期待された．現在，筆者らはこのセリシンと抗緑内障薬との合剤が角膜傷害性へ与える影響を明確にすべく角膜上皮.離モデルを用いたinvivo実験において，セリシン含有抗緑内障薬の角膜サンピロR48希釈倍率細胞増殖抑制率（%）020406080100＊チモプトールR希釈倍率細胞増殖抑制率（%）0204060801002832＊レスキュラR希釈倍率96100細胞増殖抑制率（%）020406080100＊細胞増殖抑制率（%）020406080100キサラタンR6872希釈倍率＊トルソプトR1620希釈倍率細胞増殖抑制率（%）020406080100＊2024希釈倍率細胞増殖抑制率（%）020406080100デタントールR＊＊2024希釈倍率ハイパジールR細胞増殖抑制率（%）020406080100＊＊図1セリシン添加抗緑内障薬が角膜上皮細胞増殖抑制率へ与える影響□：単剤処理，■：セリシン添加薬剤処理．平均値±標準誤差．n＝3.7＊p＜0.05vs対応する単剤処理群（Student’st検定）．1298あたらしい眼科Vol.27，No.9，2010（132）傷害性について解析を行っているところである．加えて，セリシンを添加することにより，従来の添加剤自身の役割にどのような影響を及ぼすのかを明らかにすることは非常に重要である．したがって，セリシンが保存剤として知られるベンザルコニウム塩化物の保存性作用に対しどのような影響を与えるのかについても検討を行っているところである．以上，本研究では同一条件下において，抗緑内障点眼薬自身が有する細胞増殖抑制作用に対するセリシンの保護効果を明らかとした．これら細胞増殖抑制作用は，臨床においては涙液能低下などの他の作用により相乗的に角膜上皮細胞増殖抑制作用をひき起こすと考えられることから8），今回のinvitroの結果を基盤とした臨床結果のさらなる解析を行うことで，抗緑内障薬による角膜傷害性とセリシンの保護効果がより明確になるものと考えられた．文献1）徳田直人，青山裕美子，井上順ほか：抗緑内障薬が角膜に及ぼす影響：臨床とinvitroでの検討．聖マリアンナ医科大学雑誌32：339-356,20042）寺田聡：セリシンを利用した無血清培地の開発とその応用．生物工学会誌86：387-389,20083）NagaiN,MuraoT,ItoYetal：Enhancingeffectofsericinoncornealwoundhealinginratdebridedcornealepithelium.BiolPharmBul32：933-936,20094）長井紀章，伊藤吉將，岡本紀夫ほか：抗緑内障点眼薬の角膜障害におけるinvitroスクリーニング試験：SV40不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T）を用いた細胞増殖抑制作用の比較．あたらしい眼科25：553-556,20085）ToropainenE,RantaVP,TalvitieAetal：Culturemodelofhumancornealepitheliumforpredictionofoculardrugabsorption.InvestOphthalmolVisSci42：2942-2948,20016）TalianaL,EvansMD,DimitrijevichSDetal：Theinfluenceofstromalcontractioninawoundmodelsystemoncornealepithelialstratification.InvestOphthalmolVisSci42：81-89,20017）俊野敦子，岡本茂樹，島村一郎ほか：プロスタグランディンF2aイソプロピルウノプロストン点眼液による角膜上皮障害の発症メカニズム．日眼会誌102：101-105,19988）大規勝紀，横井則彦，森和彦ほか：b遮断剤の点眼が眼表面に及ぼす影響．日眼会誌102：149-154,2001＊＊＊

SV40 不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T）を用いた抗緑内障薬2剤併用時の角膜上皮細胞増殖抑制作用の比較

admin — Sun, 31 Aug 2008 03:01:59 +0000

———————————————————————-Page1（89）11350910-1810/08/\100/頁/JCLSあたらしい眼科25（8）：11351138，2008cはじめに緑内障は失明を伴う眼疾患であり，その要因には眼圧とそれ以外の因子（循環障害など）が考えられている．臨床においては，抗緑内障点眼薬による薬物治療が第一選択となるが，眼圧コントロールが困難な患者に対しては複数の抗緑内障点眼薬が追加される．しかし，点眼表層角膜症や眼瞼炎といった眼局所の副作用や，患者からのしみる，かすむ，眼が充血するといった訴えで点眼薬の中止および変更を余儀なくされ，眼圧コントロールと薬剤の選択がむずかしくなってきているのが現状である．近年，抗緑内障薬の角膜障害は，点眼薬中に含まれる主薬，保存剤だけでなく，角膜知覚，涙液動態および結膜といったオキュラーサーフェス（眼表面）の〔別刷請求先〕伊藤吉將：〒577-8502東大阪市小若江3-4-1近畿大学薬学部製剤学研究室Reprintrequests：YoshimasaIto,Ph.D.,SchoolofPharmacy,KinkiUniversity,3-4-1Kowakae,Higashi-Osaka,Osaka577-8502,JAPANSV40不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T）を用いた抗緑内障薬2剤併用時の角膜上皮細胞増殖抑制作用の比較長井紀章＊1伊藤吉將＊1,2岡本紀夫＊3川上吉美＊4＊1近畿大学薬学部製剤学研究室＊2同薬学総合研究所＊3兵庫医科大学眼科学教室＊4兵庫医科大学病院治験センターComparisonofSuppressionofCornealEpithelialCellLineSV40（HCE-T）ProliferationbyCombinedTreatmentUsingTwoTypesofAnti-GlaucomaEyedropsNoriakiNagai1）,YoshimasaIto1,2）,NorioOkamoto3）andYoshimiKawakami4）1）SchoolofPharmacy,2）PharmaceutialResearchandTechnologyInstitute,KinkiUniversity,3）DepartmentofOphthalmology,HyogoCollegeofMedicine,4）ClinicalResearchCenter,HospitalofHyogoCollegeofMedicine臨床において緑内障治療には多種類の抗緑内障薬の投与が行われ，抗緑内障薬併用は角膜障害をひき起こすことが知られている．本研究では，有効成分の異なる抗緑内障薬7種を用い，ヒト角膜上皮細胞（HCE-T）に対する増殖抑制作用により抗緑内障薬2剤併用の角膜障害性の評価を行った．抗緑内障薬は市販製剤であるb遮断薬（チモプトールR），プロスタグランジン製剤（レスキュラR，キサラタンR），炭酸脱水酵素阻害薬（トルソプトR），選択的交感神経a1遮断薬（デタントールR），a，b受容体遮断薬（ハイパジールR），副交感神経作動薬（サンピロR）の7種を用いた．本研究の結果，抗緑内障薬2剤併用することで角膜上皮細胞増殖抑制作用の強さは各種単剤処理時と比較し増加し，その上皮細胞増殖抑制作用の増加は相加的であった．本研究は，角膜上皮障害がある患者への抗緑内障点眼薬の薬物選択を決定するうえで一つの指標となるものと考えられる．Thecombinationofanti-glaucomaeyedropsisfrequentlyusedinclinicaltreatment,anditisknownthatsuchcombinationcancausecornealepithelialcellsdamage.Inthisstudy,weinvestigatedtheeectsofthecombinedinstillationoftwoanti-glaucomaeyedropsontheproliferationofhumancornealepithelialcells（HCE-T）.Sevenpreparationsofeyedrops〔b-blocker（TimoptolR）,prostaglandinagent（ResculaR,XalatanR）,topicalcarbonicanhy-draseinhibitor（TrusoptR）,a1-blocker.（DetantolR）,a,b-blocker（HypadilR）andparasympathomimeticagent（San-piloR）〕wereusedinthisstudy.Withthecombinationoftwoanti-glaucomaeyedrops,theinhibitionofcellprolifer-ationincreasedincomparisonwithuseofasingletypeofanti-glaucomaeyedrops,theincreasebeingadditiveineect.Incombinedtreatmentwithvarioustypesofanti-glaucomaeyedrops,theinhibitiontestforHCE-Tprolifer-ationmayprovideanusefulinformationforselectingtheanti-glaucomaeyedropstobeused.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）25（8）：11351138,2008〕Keywords：緑内障，SV40不死化ヒト角膜上皮細胞，レスキュラR，デタントールR，サンピロR．glaucoma,hu-mancorneaepithelialcelllineSV40,ResculaR,DetantolR,SanpiloR.———————————————————————-Page21136あたらしい眼科Vol.25，No.8，2008（90）状態が関与することが明らかとされ，臨床（invivo）と基礎（invitro）両方面からの観察が重要であることが報告された1）．筆者らもまた，抗緑内障点眼薬がSV40不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T）へ与える細胞増殖抑制作用が，正常ヒト角膜上皮細胞のものに非常に類似しており，さらに細胞増殖性，感受性にばらつきが少なく，HCE-Tが正常ヒト角膜上皮細胞の代わりにinvitro角膜障害試験に使用できることを明らかとした2）．今回，このHCE-Tを用い，現在臨床現場で多用されているb遮断薬（チモプトールR），プロスタグランジン製剤（レスキュラR，キサラタンR），炭酸脱水酵素阻害薬（トルソプトR），選択的交感神経a1遮断薬（デタントールR），a，b受容体遮断薬（ハイパジールR），副交感神経作動薬（サンピロR）など，異なる抗緑内障点眼薬7種の2剤併用による角膜障害性を明らかにすべく，invitro角膜障害試験について検討を行った．I対象および方法1.使用細胞培養細胞は理化学研究所より供与されたSV40不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T，RCBNo.1384）を用い，100IU/mlペニシリン（GIBCO社製），100μg/mlストレプトマイシン（GIBCO社製）および5.0％ウシ胎児血清（FBS，GIBCO社製）を含むDMEM/F12培地（GIBCO社製）にて培養した．2.使用薬物抗緑内障点眼薬は市販製剤であるb遮断薬（0.5％チモプトールR），プロスタグランジン製剤（0.12％レスキュラR，0.005％キサラタンR），炭酸脱水酵素阻害薬（1％トルソプトR），選択的交感神経a1遮断薬（0.01％デタントールR），a，b受容体遮断薬（0.25％ハイパジールR），副交感神経作動薬（1％サンピロR）の7剤を用いた．表1には本研究で用いた抗緑内障薬の各種抗緑内障点眼薬に含まれる添加物を示す．また，表2には本実験で用いた各種抗緑内障薬の組み合わせについて示す．3.抗緑内障点眼薬による細胞処理法HCE-T（50×104個）をフラスコ（75cm2）内に播種し，80％コンフルーエンスとなるまで培養した3,4）．この細胞を，0.05％トリプシンにて離し，細胞数を計測後，96wellプレートに100μl（10×104個）ずつ播種し，37℃，5％CO2インキュベーター内で24時間培養したものを実験に用いた．表3には抗緑内障点眼薬の添加量を示す．本実験では，表3に示した添加量を用い，培地およびPBS（リン酸緩衝液）で17段階希釈した薬剤（すなわち4128倍希釈）にて24時間培養後，各wellにTetraColorONE（生化学社製）20μlを加え，37℃，5％CO2インキュベーター内で1時間処理を行い，マイクロプレートリーダー（BIO-RAD社製）にて490nmの吸光度（Abs）を測定することで細胞増殖抑制を表した．各薬剤とも培地中に含まれるpHインジケーターのフェノールレッドが中性を示すことを確認し，同実験を3表1各種抗緑内障点眼薬に含まれる添加物抗緑内障点眼薬添加物チモプトールR塩化ベンザルコニウム，リン酸二水素Na，リン酸水素Na，水酸化NaレスキュラR塩化ベンザルコニウム，ポリソルベート80，等張化剤，pH調節剤キサラタンR塩化ベンザルコニウム，リン酸二水素Na，リン酸水素Na，等張化剤トルソプトR塩化ベンザルコニウム，ヒドロキシエチルセルロース，D-マンニトール，クエン酸Na，塩酸デタントールR塩化ベンザルコニウム，濃グリセリン，ホウ酸，pH調節剤ハイパジールR塩化ベンザルコニウム，リン酸二水素K，リン酸水素Na，塩酸，塩化NaサンピロRパラオキシ安息香酸プロピル，パラオキシ安息香酸メチル，クロロブタノール，酢酸Na，ホウ酸，ホウ砂，pH調節剤表2各種抗緑内障薬の組み合わせチモプトールRレスキュラRキサラタンRトルソプトRデタントールRハイパジールRサンピロRチモプトールR○○○○○○レスキュラR○─○○○○キサラタンR○─○○○○トルソプトR○○○○─○デタントールR○○○○○○ハイパジールR○○○─○○サンピロR○○○○○○———————————————————————-Page3あたらしい眼科Vol.25，No.8，20081137（91）7回くり返した．本研究では，細胞増殖抑制率は下記の計算式により算出した．細胞増殖抑制率（％）＝（Abs未処理Abs薬剤処理）/Abs未処理×100また，得られた細胞増殖抑制率から50％細胞増殖抑制時希釈倍数を算出した．50％細胞増殖抑制時希釈倍数の算出はMicrosoftExcelによる0次式を用いて当てはめ，計算により得られた回帰曲線より求めた．II結果表4には種々抗緑内障点眼薬2剤併用処理における角膜上皮細胞増殖抑制効果について示した．いずれの抗緑内障薬も2剤を組み合わせることで単剤処理と比較し50％細胞増殖抑制時希釈倍数の上昇が確認された．しかしこの2剤併用処理時における50％細胞増殖抑制時希釈倍数の増加程度は薬物同士の組み合わせによって異なった．そこで，抗緑内障点眼薬2剤併用時の50％細胞増殖抑制時希釈倍数における各種抗緑内障点眼薬希釈倍数での単剤処理による角膜上皮細胞増殖抑制率について示した（表5）．2剤併用に用いた各種抗緑内障薬のすべての組み合わせにおいて，角膜上皮細胞増殖抑制率の総和は2剤併用時の角膜上皮細胞増殖抑制率，すなわち50％と同等かそれ以上であった．III考按角膜上皮は56層の細胞層から構成され，基底細胞と表層細胞に大きく分けられる．このうち基底細胞は分裂増殖機能と接着機能を，表層細胞はバリア機能および涙液保持機能を担っている．この4つの機能のどれか1つでも破綻した際角膜上皮障害が認められるが，なかでも薬剤の影響を特に受けやすいとされているのが分裂機能とバリア機能である5）．今回用いたHCE-Tによるinvitro角膜実験は，個体差やオキュラーサーフェスの状態の要因をすべて同一条件の状態で評価することが可能なため，薬剤自身が有する角膜上皮細胞分裂機能へ与える影響を検討するのに適している．本研究では，このHCE-Tを用い，同一条件下における抗緑内障点眼薬2剤併用が角膜分裂機能へ与える影響を検討するため，異なる7種の抗緑内障点眼薬を組み合わせることによる角膜上皮細胞増殖障害について検討を行った．結果から，いずれの抗緑内障薬も2剤を組み合わせることで単剤処理と比較し角膜上皮細胞増殖障害の増加が確認された．抗緑内障薬2剤併用が角膜分裂能へ与える要因として，薬物の主薬の影響のみならず，点眼薬に含まれる保存剤の影響があげ表3抗緑内障点眼薬の添加量培地PBS薬剤1薬剤2未処理25μl50μl0μl0μl単剤処理25μl25μl25μl0μl2剤併用処理25μl0μl25μl25μl表4各種抗緑内障薬単剤および2剤併用時における50%細胞増殖抑制時希釈倍数チモプトールRレスキュラRキサラタンRトルソプトRデタントールRハイパジールRサンピロRチモプトールR29.9122.295.834.836.330.331.2レスキュラR122.299.1─102.8105.9104.8105.2キサラタンR95.8─70.495.783.088.576.9トルソプトR34.8102.895.717.535.4─23.3デタントールR36.3105.983.035.423.226.124.9ハイパジールR30.3104.888.5─26.120.124.5サンピロR31.2105.276.923.324.924.57.49表5抗緑内障薬2剤併用による50%細胞増殖抑制時における各種抗緑内障点眼薬希釈倍数での単剤処理による角膜上皮細胞増殖抑制率の総和チモプトールRレスキュラRキサラタンRトルソプトRデタントールRハイパジールRサンピロRチモプトールR50.0%52.6%64.6%65.4%58.5%52.4%レスキュラR50.0%─68.8%71.0%66.4%66.1%キサラタンR52.6%─51.9%69.3%56.6%63.6%トルソプトR64.6%68.8%51.9%61.8%─56.6%デタントールR65.4%71.0%69.3%61.8%59.2%57.4%ハイパジールR58.5%66.4%56.6%─59.2%53.7%サンピロR52.4%66.1%63.6%56.6%57.4%53.7%———————————————————————-Page41138あたらしい眼科Vol.25，No.8，2008（92）られ，2剤併用することにより角膜にさらされる主薬とそこに含まれる保存剤の量は相加的に増加し，これらが角膜分裂能への障害増加をひき起こすことが予想された．また，筆者らの今回の結果から，2剤併用に用いた各種抗緑内障薬のすべての組み合わせにおいて角膜上皮細胞増殖抑制率の総和は，2剤併用時の角膜上皮細胞増殖抑制率（50％）と同等かそれ以上となり，これら抗緑内障点眼薬2剤併用による角膜上皮細胞増殖障害の増加は相乗的ではなく相加的であることが明らかとなった．一方，これら2剤併用時の角膜上皮細胞増殖障害が，加算的に増加するのであれば2剤併用の50％細胞増殖抑制時希釈倍数時における各種抗緑内障薬細胞増殖抑制率の総和は約50％となるはずである．しかしながら，2剤併用の50％細胞増殖抑制時希釈倍数時における各種抗緑内障薬細胞増殖抑制率の総和は約5071％と2剤併用時の角膜上皮細胞増殖障害と比較し高かった．これらの結果は，薬物同士の組み合わせによっては，抗緑内障薬2剤併用による薬物自体の角膜上皮細胞増殖障害は単剤同士の角膜上皮細胞増殖障害の程度を単純に加算した値より軽減されることを示した．筆者らは以前の報告で抗緑内障点眼薬の角膜上皮細胞障害性は主薬の種類，含量や保存剤のみに起因するのではなく，界面活性剤などの添加物も強く関わることを明らかとした2）．したがって，抗緑内障薬の2剤併用において抗緑内障薬の主薬や保存剤の量だけが影響するのではなく，含有される添加物や組み合わせといった他の要因にも注目する必要性が示唆された．今回用いた7種の抗緑内障薬のなかで細胞障害性を示すと考えられる添加物は塩化ベンザルコニウム，ポリソルベート80，パラベン類，ホウ酸などが考えられた．本研究において，2剤併用の50％細胞増殖抑制時希釈倍数時における各種抗緑内障薬細胞増殖抑制率の総和と比較し，2剤併用時の細胞増殖抑制率が顕著に（15％以上）軽減された抗緑内障薬の組み合わせは，レスキュラR×デタントールR，サンピロR，トルソプトR，ハイパジールRおよびデタントールR×チモプトールR，キサラタンRの6種類の組み合わせであった．これらはレスキュラR，デタントールR，サンピロRが含まれる組み合わせであり，レスキュラRには添付剤として界面活性剤ポリソルベート80が，デタントールRおよびサンピロRには保存剤のホウ酸が含有されていた．したがって，2剤併用による角膜上皮細胞増殖障害性は塩化ベンザルコニウムの毒性の総和で上昇するものと考えられたが，薬剤中に2つ以上の細胞毒性を示す添加物が混在する場合，2剤併用を行っても単剤での角膜上皮細胞増殖障害性を単純に合わせたものに比較し減少する傾向があるのではないかと考えられた．もちろん主薬同士の作用による角膜分裂能障害の緩和も考えられるため，今後添加物および主薬同士の組み合わせによる詳細な検討が必要と考えられる．以上，本研究では同一条件下において，抗緑内障点眼薬2剤併用時の薬剤自身が有する角膜上皮細胞増殖障害性の強さを明らかとした．これら角膜上皮細胞増殖障害性は，臨床においては涙液能低下などの他の作用により相乗的に角膜上皮細胞障害をひき起こすと考えられることから6），今回のinvitroの結果を基盤とした臨床結果のさらなる解析を行うことで，薬剤の選択が容易になるものと考えられた．これらの報告は今後の角膜研究および抗緑内障点眼薬投与時における薬物選択を決定するうえで一つの指標になるものと考えられた．文献1）徳田直人，青山裕美子，井上順ほか：抗緑内障薬が角膜に及ぼす影響：臨床とinvitroでの検討．聖マリアンナ医科大学雑誌32：339-356,20042）長井紀章，伊藤吉將，岡本紀夫ほか：抗緑内障点眼薬の角膜障害におけるinvitroスクリーニング試験：SV40不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T）を用いた細胞増殖抑制作用の比較．あたらしい眼科25：553-556,20083）ToropainenE,RantaVP,TalvitieAetal：Culturemodelofhumancornealepitheliumforpredictionofoculardrugabsorption.InvestOphthalmolVisSci42：2942-2948,20014）TalianaL,EvansMD,DimitrijevichSDetal：Theinu-enceofstromalcontractioninawoundmodelsystemoncornealepithelialstratication.InvestOphthalmolVisSci42：81-89,20015）俊野敦子，岡本茂樹，島村一郎ほか：プロスタグランディンF2aイソプロピルウノプロストン点眼液による角膜上皮障害の発症メカニズム．日眼会誌102：101-105,19986）大規勝紀，横井則彦，森和彦ほか：b遮断剤の点眼が眼表面に及ぼす影響．日眼会誌102：149-154,2001＊＊＊

抗緑内障点眼薬の角膜障害におけるIn Vitro スクリーニング試験：SV40 不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T）を用いた細胞増殖抑制作用の比較

admin — Wed, 30 Apr 2008 06:07:35 +0000

———————————————————————-Page1（131）???0910-181008\100頁JCLS《原著》あたらしい眼科25（4）：553～556，2008?〔別刷請求先〕伊藤吉將：〒577-8502東大阪市小若江3-4-1近畿大学薬学部製剤学研究室Reprintrequests：??????????????????????????????????????????????????????????????-?-??????????????????-????????????????-???????????抗緑内障点眼薬の角膜障害における????????スクリーニング試験：SV40不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T）を用いた細胞増殖抑制作用の比較長井紀章＊1伊藤吉將＊1,2岡本紀夫＊3川上吉美＊4＊1近畿大学薬学部製剤学研究室＊2同薬学総合研究所＊3兵庫医科大学眼科学教室＊4兵庫医科大学病院治験センターAn????????ScreeningTestforCornealDamagesbyVariousAnti-GlaucomaEyeDrops：ComparisonofSuppressiontoCellGrowthofCornealEpithelialCellLineSV40（HCE-T）byThemNoriakiNagai1）,YoshimasaIto1,2）,NorioOkamoto3）andYoshimiKawakami4）1）????????????????????2）????????????????????????????????????????????????????????????????????3）????????????????????????????????????????????????????????4）???????????????????????????????????????????????????????????????長期にわたる抗緑内障薬点眼薬の使用は角膜障害をひき起こすことが知られている．これまで????????角膜上皮細胞増殖抑制試験にはヒト正常角膜上皮細胞が用いられてきたが，細胞増殖率のばらつきが大きく，採取されたヒト角膜の個体差のため点眼薬の角膜上皮細胞増殖抑制作用に関する評価試験には不向きであった．今回，正常角膜上皮細胞の代わりにSV40不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T）を用い点眼薬の????????角膜上皮細胞増殖抑制について検討を行った．点眼薬はb遮断薬，プロスタグランジン製剤，炭酸脱水酵素阻害薬，選択的交感神経a1遮断薬，a，b受容体遮断薬そして副交感神経作動薬の7種を用いた．本研究の結果，HCE-T細胞増殖抑制効果の強さはイソプロピルウノプロストン（レスキュラ?）＞ラタノプロスト（キサラタン?）≫マレイン酸チモロール（チモプトール?）＞塩酸ブナゾシン（デタントール?）＞ニプラジロール（ハイパジール?）＞塩酸ドルゾラミド（トルソプト?）≫塩酸ピロカルピン（サンピロ?）の順であり，HCE-Tはばらつきが少なく，正常ヒト角膜上皮細胞に代わり????????角膜上皮細胞増殖抑制試験に使用できることが明らかとなった．Theselectionofanti-glaucomaeyedropsiscomplicated,sincetheirlong-termusecausescornealdamage.Although????????cornealcellproliferationdisordertestinghavebeendoneusingnormalhumancornealepithelialcell（HCEC）,theHCECarenotsuitableforresearchintocornealdamagebyanti-glaucomaeyedropsasHCEChavevariousgrowthratesindependenceonindividualdi?erencesbetweenhumancorneasusedassources.Weinvestigatedthee?ectsofanti-glaucomaeyedropsonproliferationofthehumancornealepithelialcelllineSV40（HCE-T）,using7preparations：b-blocker,prostaglandinagent,topicalcarbonicanhydraseinhibitor,a1-blocker,a,b-blockerandparasympathomimeticagent.Cellproliferationinhibitionbytheeyedropsdecreasedinthefollowingorder：isopropylunoproston（Rescula?）＞latanoprost（Xalatan?）≫timololmaleate（Timoptol?）＞bunazosinhydro-chloride（Detantol?）＞nipradiol（Hypadil?）＞dorzolamidehydrochloride（Trusopt?）≫pilocarpinehydrochloride（San-pilo?）.TheseresultsshowthattheproposedmethodusingHCE-Tissuitableforresearchingcornealdamagecausedbyanti-glaucomaeyedrops.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）25（4）：553～556,2008〕Keywords：緑内障，SV40不死化ヒト角膜上皮細胞，b遮断薬，プロスタグランジン製剤，炭酸脱水酵素阻害薬．glaucoma,humancorneaepithelialcelllineSV40,b-blocker,prostaglandinagent,topicalcarbonicanhydraseinhibitor.———————————————————————-Page2???あたらしい眼科Vol.25，No.4，2008（132）インキュベーター内で24時間培養したものを実験に用いた．実際の操作法として，PBS（リン酸緩衝食塩水）または薬剤を含んだ培地（未処理群培地25??，PBS50??；薬剤処理群培地25??，PBS25??および薬剤25??）にて24時間培養後，各wellにTetraColorONE（生化学社製）20??を加え，37℃，5％CO2インキュベーター内で1時間処理を行い，マイクロプレートリーダー（BIO-RAD社製）にて490nmの吸光度（Abs）を測定した．本実験における細胞増殖性はTetra-ColorONEを用い，テトラゾリウム塩が生細胞内ミトコンドリアのデヒドロゲナーゼにより生産されたホルマザンを測定することで表した．各薬剤とも，1回の実験に同一薬剤6～8wellを用い，同実験を3～5回くり返した．本研究では，細胞増殖抑制率は下記の計算式により算出した．細胞増殖抑制率（％）＝（Abs未処理－Abs薬剤処理）/Abs未処理×100また，得られた細胞増殖抑制率から50％細胞増殖抑制時希釈率（EC50）を算出した．EC50の算出は近似曲線の方程式から計算により求めた．II結果1.抗緑内障点眼薬による角膜上皮細胞増殖抑制効果図1には種々抗緑内障点眼薬処理におけるHCE-T増殖抑制効果について示した．プロスタグランジン製剤であるレスキュラ?は，希釈率80倍までは高い細胞増殖抑制を示し，今回用いた抗緑内障点眼薬のなかで最も強い細胞増殖抑制作用を示した．レスキュラ?についで細胞増殖抑制作用を有したのは希釈率56倍まで強い細胞増殖抑制作用を示したキサラタン?であり，こちらもプロスタグランジン製剤であった．プロスタグランジン製剤のつぎに高い細胞増殖抑制作用を示したのはb遮断薬であるチモプトール?であり，希釈率24倍まで高い細胞増殖抑制を示した．選択的交感神経a1遮断薬であるデタントール?，a，b受容体遮断薬であるハイパジール?はともに希釈率8倍までは約90％の細胞増殖抑制はじめに抗緑内障薬による角膜障害には，点眼薬中に含まれる主薬，添加剤，防腐剤だけでなく，角膜知覚，涙液動態および結膜といったオキュラーサーフェス（眼表面）の状態が関与することが明らかとされ，臨床（???????）と基礎（????????）両方面からの観察が重要である1）．しかしながら，プロスタグランジン製剤など，多くの抗緑内障点眼薬が開発され，臨床で使用されているにもかかわらず，これら????????実験による抗緑内障点眼薬が角膜上皮細胞へ及ぼす影響に関する報告は十分とはいえない．この理由として，正常ヒト角膜上皮細胞は世代による個体差のばらつきが大きく扱いがむずかしいこと，抗緑内障薬の種類が豊富であるため，正常ヒト角膜上皮細胞を用いた????????上皮細胞増殖抑制試験には多くの経費が必要となることが考えられる．したがって，低コストでばらつきの少ない????????上皮細胞増殖抑制試験系を確立することは臨床的に非常に重要であると考えられる．今回，SV40不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T）を用い，現在臨床現場で多用されているb遮断薬（チモプトール?），プロスタグランジン製剤（レスキュラ?，キサラタン?），炭酸脱水酵素阻害薬（トルソプト?），選択的交感神経a1遮断薬（デタントール?），a，b受容体遮断薬（ハイパジール?），副交感神経作動薬（サンピロ?）など，異なる抗緑内障点眼薬7種を用いた????????角膜上皮細胞増殖抑制試験について検討を行った．I対象および方法1.使用細胞培養細胞は理化学研究所より供与されたSV40不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T，RCBNo.1384）を用い，100IU/m?ペニシリン（GIBCO社製），100?g/m?ストレプトマイシン（GIBCO社製）および5.0％ウシ胎児血清（FBS，GIBCO社製）を含むDMEM/F12培地（GIBCO社製）にて培養した．2.使用薬物抗緑内障点眼薬は市販製剤であるb遮断薬（0.5％チモプトール?），プロスタグランジン製剤（0.12％レスキュラ?，0.005％キサラタン?），炭酸脱水酵素阻害薬（1％トルソプト?），選択的交感神経a1遮断薬（0.01％デタントール?），a，b受容体遮断薬（0.25％ハイパジール?），副交感神経作動薬（1％サンピロ?）の7種を用いた．表1には本研究で用いた抗緑内障薬の臨床における点眼回数および防腐剤の種類と濃度を示す．3.抗緑内障点眼薬による細胞処理法HCE-T（50×104個）をフラスコ（75cm2）内に播種し，80％コンフルーエンスとなるまで培養した2,3）．この細胞を0.05％トリプシンにて?離し，細胞数を計測後，96wellプレートに100??（10×104———————————————————————-Page3あたらしい眼科Vol.25，No.4，2008???（133）通常細胞数確保のため実験に用いられる培養第4世代の正常ヒト角膜上皮細胞は，起源（ロット）によるばらつきが大きく扱いがむずかしいといった欠点を有している．筆者らも今回の実験前に使用したが，ロット間，培養世代により細胞増殖性にばらつきがあり（第4世代正常ヒト角膜上皮細胞増殖性の変動係数；30.88％，0.25cells/cm2にて播種後3日間培養），このように多種にわたる点眼剤の角膜上皮細胞増殖抑制作用に関する評価実験には不向きであると考えられた．近年，佐々木らにより確立されたSV40にて不死化されたヒト角膜上皮細胞（HCE-T）は細胞増殖性のばらつきも少なく（第4世代HCE-T細胞増殖性の変動係数；4.70％，0.25cells/cm2にて播種後3日間培養）多くの研究に用いられており，正常ヒト角膜上皮細胞とほぼ同等の性質を有することが報告されている5）．したがって，このHCE-Tは????????実験における抗緑内障点眼薬による角膜上皮細胞増殖抑制作用に関する評価に利用できると考えられた．本研究では，HCE-Tを用い，同一条件下における抗緑内障点眼薬処理が角膜分裂機能へ与える影響を検討するため，異なる7種の抗緑内障点眼薬が角膜上皮細胞増殖に及ぼす影響について検討を行った．プロスタグランジン製剤であるレスキュラ?およびキサラタン?は他の抗緑内障点眼薬と比較し高い細胞増殖抑制作用を有することが明らかとなった．b遮断薬であるチモプトール?は選択的交感神経a1遮断薬であるデタントール?，a，b受容体遮断薬ハイパジール?より細胞増殖抑制作用は高かったものの，プロスタグランジン製剤に比べその作用は明らかに低かった．実際の臨床現場において，抗緑内障点眼薬による角膜上皮細胞増殖抑制作用はプロスタグランジン製剤やb遮断薬で高頻度にみられることはすでによく知られており6），筆者らが示したプロスタグランジン製剤が強い細胞増殖抑制作用を有することと一致が認められた．しかし，b遮断薬であるチモプトール?はプロスタグランジン製剤に比べその細胞増殖抑制作用は明らかに低く，臨床で高頻度に角膜上皮細胞増殖抑制作用が認められるという報告と矛盾が認められた．大槻らはb遮断薬による角膜障害は薬物自身の毒性と涙液分泌能低下によるものであることを報告している7）．このことから，b遮断薬による角膜上皮細胞増殖抑制作用は涙液分泌能低下が薬物自身の毒性を上昇させているのではないかと示唆された．一方，点眼回数が1日3回である炭酸脱水酵素阻害薬トルソプト?はプロスタグランジン製剤やa，b遮断薬に比べ低い細胞増殖抑制作用を示した．このことは炭酸脱水酵素阻害作用を有する主薬（塩酸ドルゾラミド）自身の角膜上皮細胞への細胞増殖抑制作用が低いためではないかと考えられた．今回の研究で細胞増殖抑制作用が最も低かったのが副交感神経作動薬であるサンピロ?であった．点眼薬には品質の劣化を防ぐ目的で防腐剤が添加されている．防率を示したが，希釈率24倍ではそれぞれ約48％へ細胞増殖抑制率の低下が認められた．また，炭酸脱水酵素阻害薬であるトルソプト?も，希釈率8倍までは90％以上の細胞増殖抑制率を示したが，希釈率24倍では約40％とデタントール?やハイパジール?よりやや低い抑制率を示した．今回用いた抗緑内障点眼薬のなかで最も弱い抑制率を示したのは副交感神経作動薬であるサンピロ?であり，その抑制率は希釈率4倍で79％，希釈率8倍では46％であった．本実験で用いた抗緑内障のEC50（希釈率）はレスキュラ?（99.09）＞キサラタン?（70.35）?チモプトール?（29.90）＞デタントール?（23.16）＞ハイパジール?（20.11）＞トルソプト?（17.47）?サンピロ?（7.49）の順に低値を示した．III考按角膜上皮は5～6層の細胞層から構成され，基底細胞と表層細胞に大きく分けられる．このうち基底細胞は分裂増殖機能と接着機能を，表層細胞はバリア機能および涙液保持機能を担っている．この4つの機能のどれか1つでも破綻した際角膜上皮障害が認められるが，なかでも薬剤の影響を特に受けやすいとされているのが分裂機能とバリア機能である4）．臨床での抗緑内障点眼薬点眼による角膜障害性の検討においては，基礎疾患を除外した対象を選択し，年齢を揃え，点眼処理を同一条件としても，個体差およびオキュラーサーフェスの状態にばらつきが生じるという問題がある．一方，ヒト角膜上皮細胞を用いた????????実験は個体差やオキュラーサーフェスの状態の要因をすべて同一条件の状態で評価することが可能なため，薬剤自身による角膜上皮細胞への影響を検討することが可能である．これまでの????????試験における抗緑内障点眼薬による角膜上皮細胞増殖抑制作用に関する評価は正常ヒト角膜上皮細胞を用いて行われてきた．しかし，———————————————————————-Page4???あたらしい眼科Vol.25，No.4，2008（134）角膜上皮細胞増殖抑制試験に使用できることが明らかとなった．以上，本研究では同一条件下において，抗緑内障点眼薬自身が有する細胞増殖抑制作用の強さを明らかにした．これら細胞増殖抑制作用は，臨床においては涙液能低下などの他の作用により相乗的に角膜上皮細胞増殖抑制作用をひき起こすと考えられることから，今回の????????の結果を基盤とし，臨床でさらなる解析を行うことで，薬剤の選択が容易になるものと考えられた．また，HCE-Tは正常ヒト角膜上皮細胞に代わり，????????角膜上皮細胞増殖抑制試験に使用可能であることが明らかとなった．角膜上皮細胞増殖能は角膜の修復能と透過性にもつながるため，角膜障害性を反映するものと考えられ，これらの報告は今後の角膜研究および抗緑内障点眼薬投与時における薬物選択を決定するうえで一つの指標になるものと考えられた．文献1）徳田直人，青山裕美子，井上順ほか：抗緑内障薬が角膜に及ぼす影響：臨床と????????での検討．聖マリアンナ医科大学雑誌32：339-356,20042）ToropainenE,RantaVP,TalvitieAetal：Culturemodelofhumancornealepitheliumforpredictionofoculardrugabsorption.?????????????????????????42：2942-2948,20013）TalianaL,EvansMD,DimitrijevichSDetal：Thein?uenceofstromalcontractioninawoundmodelsystemoncornealepithelialstrati?cation.?????????????????????????42：81-89,20014）俊野敦子，岡本茂樹，島村一郎ほか：プロスタグランディンF2aイソプロピルウノプロストン点眼薬による角膜上皮障害の発症メカニズム．日眼会誌102：101-105,19985）Araki-SasakiK,OhashiY,SasabeTetal：AnSV40-immortalizedhumancornealepithelialcelllineanditscharacterization.?????????????????????????36：614-621,19956）青山裕美子：緑内障の薬物治療─抗緑内障点眼薬と角膜．?????????????????????,4：132-147,20037）大槻勝紀，横井則彦，森和彦ほか：b遮断剤の点眼が眼表面に及ぼす影響．日眼会誌105：149-154,20018）青山裕美子，本木正師，橋本真理子：各種抗緑内障点眼薬のヒト角膜上皮細胞に対する影響．日眼会誌108：75-83,2004腐剤は点眼薬の種類によって異なっており，その濃度も均一ではなく，この防腐剤が細胞増殖抑制をひき起こす要因の一つとされている8）．本研究ではサンピロ?のみが防腐剤にパラベン類を使用しており，他の6剤は塩化ベンザルコニウムが用いられていた．細胞増殖抑制の要因の一つである防腐剤のなかで特に塩化ベンザルコニウムの角膜上皮細胞への毒性が強く，サンピロ?の防腐剤であるパラベン類は角膜分裂機能にほとんど影響を与えないことはすでに報告されている6）．これらのことから，サンピロ?が他の抗緑内障点眼薬と比較しほとんど細胞増殖抑制作用を示さないのは防腐剤の種類の相違によるものと考えられた．今回のHCE-Tを用いた結果において，抗緑内障点眼薬の細胞増殖抑制作用はレスキュラ?＞キサラタン?≫チモプトール?＞デタントール?＞ハイパジール?＞トルソプト?≫サンピロ?の順に低値を示した．防腐剤である塩化ベンザルコニウム含有量が最も高いのは0.02％のキサラタン?であるが，細胞増殖抑制作用が最も高いのは塩化ベンザルコニウム濃度が0.005％とキサラタン?の4分の1であるレスキュラ?であった．また，a，b受容体遮断薬ハイパジール?に含まれる塩化ベンザルコニウムは0.002％と塩化ベンザルコニウム0.005％を含むトルソプト?よりも低いが，その細胞増殖抑制作用はトルソプト?より高かった．この結果は添加されている塩化ベンザルコニウムの量のみでは説明することができなかった．一方，主薬の含有濃度を比較すると，レスキュラ?は0.12％，キサラタン?では0.005％とレスキュラ?のほうが明らかに高く，界面活性作用を有するポリソルベート8