《第51回日本眼感染症学会原著》あたらしい眼科32（4）：551.555，2015cラクトフェリンの抗アカントアメーバ活性に及ぼすリゾチームおよびムチンの影響鈴木智恵＊1矢内健洋＊1野町美弥＊2今安正樹＊2佐々木香る＊3冨田信一＊1＊1玉川大学農学部＊2株式会社メニコン＊3JCHO星ヶ丘医療センターEffectsofLysozymeandMucinonAmoebicidalActivityofLactoferrinAgainstAcanthamoebasp.AA014ChieSuzuki1）,KenyouYanai1）,MiyaNomachi2）,MasakiImayasu2）,KaoruAraki-Sasaki3）andShinichiTomita1）1）FacultyofAgriculture,TamagawaUniversity,2）MeniconCo.,Ltd.,3）JCHOHosigaokaMedicalCenterアカントアメーバによる角膜炎は，しばしば治療に難渋する．本研究では，Acanthamoebasp.AA014臨床分離株の栄養体を用いて，涙液中に存在するリゾチームやムチンがラクトフェリン（LF）の抗アカントアメーバ活性に及ぼす影響について検討した．アメーバは，脱鉄ウシLF（apo-bLF）30μM，60分間処理によって不定形の状態で死滅し，その生存率は6.33±0.58％であった．apo-bLFはリゾチームとの共存で相加作用を示したが，この作用はムチンの共存で低下する傾向が認められた．また，フローサイトメトリー分析によると，apo-bLFとリゾチームで処理したアメーバはDiBAC4（3）によるピークが右へとシフトしたが，ムチンの共存によってピークは小さくなった．LFはアメーバ表層の負電荷部位との静電的な相互作用によって膜の脱分極を生じ，抗アメーバ活性を発揮しているものと推察した．MedicaltreatmentofAcanthamoebakeratitisisoftendifficult.Inthisstudy,weexaminedtheinfluenceoflysozymeandmucinontheamoebicidalactivityoflactoferrin（LF）againstAcanthamoebasp.AA014clinical-isolatetrophozoites.Inthecaseofthetreatmentwithiron-freebovineLF（apo-bLF）at30μMfor60minutes,themeanratioofcellviabilitywas6.3±0.58％.Themorphologyofdeadcellsshowedanalmostnon-globularform.Althoughtheamoebicidalactivityofapo-bLFincreasedinthepresenceoflysozyme,itdecreasedslightlyinthepresenceofmucin.FlowcytometryrevealedthepeakofAcanthamoebatreatedwithapo-bLFandlysozymewasshiftedtotheright,however,thepeakwassmallbycoexistenceofthemucin.ThedepolarizationofthecellmembranewascausedbyelectrostaticinteractionbetweentheLFmoleculeandthecellmembrane.ThefindingsofthisstudyindicatethattheamoebicidalactivityofLFisexertedbythedepolarizationofamoebacells.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）32（4）：551.555,2015〕Keywords：ラクトフェリン，リゾチーム，ムチン，アカントアメーバ，抗アメーバ活性．lactoferrin,lysozyme,mucin,Acanthamoeba,amoebicidalactivity.はじめにアカントアメーバは，土壌や水環境に生息する自由生活型アメーバであり，ライフサイクル中では栄養体とシスト体の二形態をとる1）．栄養体は不定形であることが多いが，栄養源の枯渇などにより環境が悪化すると自己防御のために球形に変化し，さらに悪化するとシスト体へと形態変化する．通常，アカントアメーバによる角膜炎の治療として，角膜掻爬＋抗真菌薬＋消毒剤の併用療法が行われるが，病期が進み，アメーバがシスト化すると治療は困難となることが知られている2）．また，汚染原因とされるソフトコンタクトレンズのケース内にシスト体として存在する場合，消毒剤に抵抗性となる．したがって，コンタクトレンズの保存液として安全に使用でき，かつシスト体に有効な薬剤の開発が必須である．すでにコンタクトレンズの洗浄保存液としては，この目的でヨード製剤が発売されているが，中和が必要である．また，長期使用によるレンズの劣化や眼に対する副作用なども未知〔別刷請求先〕冨田信一：〒194-8610町田市玉川学園6-1-1玉川大学農学部Reprintrequests：ShinichiTomita,Ph.D.,DepartmentofLifeScience,FacultyofAgriculture,TamagawaUniversity,6-1-1TamagawaGakuen,Machida,Tokyo194-8610,JAPAN0910-1810/15/\100/頁/JCOPY（87）551 である．一方，ラクトフェリン（LF）は母乳，涙を含め，もともと生体内に存在する蛋白質である．これまでに筆者らは，牛乳由来のLFがアカントアメーバの類縁種であるHartmannella栄養体の増殖を抑制することを報告した3）．その作用機序として，LFの鉄キレート能の関与以外に，LFとアメーバの特異的な結合から，鉄キレート能以外の作用機序，すなわち膜電位の変動と脱分極の可能性を報告した．このLFの将来的な臨床現場での応用を考えた場合，涙液の混和による影響は無視できない．涙液にはLFやリゾチームのような感染防御因子が存在し，外来微生物の定着や増殖を抑制している．また，ムチンは涙液保持を担うことで眼表面の保護の役割を果たしている4）．そこで，本研究では涙液に存在するリゾチームやムチンがLFの抗アカントアメーバ活性に及ぼす影響について検討するとともに，LFの抗アメーバ活性における作用機序について考察した．I実験方法1.材料アメーバは，大阪大学から分譲されたAcanthamoebasp.AA014臨床分離株の栄養体を用いた．また，脱鉄ウシLF（apo-bLF，牛乳由来，森永乳業社製），リゾチーム（ニワトリ卵白由来，シグマ社製）およびムチン（ウシ顎下腺由来，TypeI-S，シアル酸含有量：9.17％，シグマ社製）を用い§§§§§§0204060801000102030405060生存率（％）†††††※※※※※※※※※※※※※※￡￡†††時間（分）図1apo.bLFのリゾチームおよびムチン存在下におけるAcanthamoebasp.AA014の生存率●：Control，○：apo-bLF30μM，△：リゾチーム130μM，□：apo-bLF＋リゾチーム，◇：apo-bLF＋リゾチーム＋ムチン0.2mg/mL．実験データの各時間における比較はANOVAで行い，差が認められた場合にSNK検定を行った．各時間での異なる記号において有意差あり（p＜0.05）とした．552あたらしい眼科Vol.32，No.4，2015た．2.生存性試験アメーバの生存性は，トリパンブルー法で評価した3）．大腸菌抽出液を塗布した寒天培地で30℃，2日間培養したアメーバを回収後，ノイバウエル計算盤を用いて懸濁液（2×106cells/mL）を調製し，各種蛋白質溶液と等量混合した（1×106cells/mL）．この混合液を10分間隔で採取して，0.25％トリパンブルー溶液（フルカ社製）と等量混合し，位相差顕微鏡（200倍，CX41，オリンパス社製）で形態およびトリパンブルー染色性を観察した．評価方法は冨田ら3）の報告に従い，染色陰性を生細胞，陽性を死細胞とし，それぞれ不定形および球形に分類した．また，各種蛋白質溶液は涙液中の濃度を想定して，apo-bLF30μM5），リゾチーム130μM6）およびムチン0.2mg/mL7）とした．3.細胞膜電位細胞膜電位の変動をフローサイトメトリーで検討した3）．AC#6培地で25℃，5日間静置培養した栄養体を1/4Ringersolution（日本製薬社製）で回収し，洗浄後にノイバウエル計算盤を用いて懸濁液（2×106cells/mL）を調製した．この懸濁液と各種蛋白質溶液を等量混合し，37℃，60分間処理した後（1×106cells/mL），アニオン性膜電位感受性色素Bis（1,3-dibutylbarbituricacid）trimethineoxonol，sodiumsalt（DiBAC4（3），同仁化学研究所社製）で染色し，フローサイトメトリー（FACSCalibur，ベクトン・ディッキンソン社製）で蛍光強度を測定した（FL1チャネル，530nm，アメーバ数が10,000に達した時点で終了とした）．II結果1.生存性に及ぼす影響apo-bLF，リゾチームおよびムチン処理におけるアカントアメーバの生存率を図1に示した．これによると，apo-bLF30μMの場合，60分後の生存率は6.33±0.58％となり未処理（Control）に比べて有意に低下した（p＜0.01）ことから，apo-bLFの非常に高い抗アカントアメーバ活性が認められた．また，リゾチーム130μMでは，60分後の生存率は47.67±10.69％となり，約半数のアカントアメーバは死滅した．さらに，apo-bLFおよびリゾチームが共存した場合，60分後の生存率は4.67±4.62％となりapo-bLF単独と比べて有意差はなかったものの，それぞれ単独での処理よりも生存率は低い傾向であり，相加的な抗アカントアメーバ活性を示した．しかし，apo-bLF，リゾチームおよびムチンが共存した場合，生存率は16.00±9.54％となり，抗アカントアメーバ活性はわずかに低下傾向を示した．ついでapo-bLF，リゾチームおよびムチン処理によるアメーバの形態に及ぼす影響を観察した（図2）．これによると，アメーバの形態はいずれの処理においても死細胞の90（88） ％以上が不定形であり，LF，リゾチームおよびムチンがアメーバの形態変化に影響を与えることはほとんどなかった．2.細胞膜電位に及ぼす影響蛍光色素のDiBAC4（3）を用いてLFの細胞膜電位に及ぼす影響を検討した．この蛍光色素は，図3のように細胞膜が脱分極することで色素がアメーバ内に入り込み，蛍光強度が増加する．DiBAC4（3）を用いたフローサイトメトリーでの細胞膜電位の変動をヒストグラムで示した（図4）．これによると，加熱処理（80℃，30分）のピークは，Controlのピークと比べて103付近にシフトし蛍光強度が増加したことから，アカントアメーバの脱分極が認められた．apo-bLFの場合，加熱処理と同様にピークシフトは103付近であり，蛍光強度が増加し，脱分極を生じた．また，リゾチームにおいても蛍光強度の増加は認められたが，ピークは102付近であり，完全な脱分極にまでは至らなかった．さらに，apo-bLFおよびリゾチームの共存では，それぞれ単独で処理した場合よりもDiBAC4（3）の取り込み量は増加し，蛍光強度は増加した．しかし，apo-bLF，リゾチームおよびムチンが共存した場合，ピークは102および103付近に分かれ，蛍光強度は低下した．III考察アカントアメーバ栄養体に対するLFの抗アメーバ活性は，apo-bLF30μMで高い活性を示し，栄養体がシスト化することなく死滅した．また，抗アメーバ活性はリゾチームとの共存で相加作用が認められた．同時に，アメーバ細胞膜はapo-bLFによって脱分極し，その程度はリゾチームの共に高い抗アカントアメーバ活性とともに，鉄キレート作用以外の静電的なアメーバ細胞膜への直接作用も示した8,9）．さらに，LFは細胞膜からリポ多糖（LPS）の遊離を引き起こし，細胞膜を損傷することで細胞死を導く機序も報告されている．たとえば，Yamauchiら10）は，bLFがEscherichiacoliCL991-2のLPSを遊離させることを確認し，ヒトリゾチームによるグラム陰性菌の死滅率が増加したと報告している．また，Ellisonら11）は，ヒトLFがE.coli5448の膜透過性に影響を与えるだけでなく，LPSに直接結合することで抗菌活性に関与していることを示し，LFとリゾチームが相乗的にグラム陰性菌を死滅させることを報告している．すなわち，グラム陰性菌に対するLFの抗菌活性は，リゾチームによって増強される細胞膜への直接的な影響が示されている．本研究でも，アカントアメーバ栄養体の細胞膜電位は，apo-bLF処理において大きく変動し，脱分極を生じた．さらにリゾチームの共存によって，細胞膜の脱分極は増大した．このことから，LFが鉄のキレートのみではなく，LF.100800存在比（％）604020存下でさらに増大することが明らかとなった．しかし，これらの抗アメーバ活性は，ムチンが共存することによりわずかな低下傾向を示した．このLFの抗アメーバ活性は静電的な機序が推測される．従来，LFの抗微生物活性は，微生物の増殖に必須な鉄をキレート化し，増殖環境を鉄欠乏状態にすることで発揮され図2apo.bLF，リゾチームおよびムチン共存下におけると考えられてきた．しかし，筆者らがすでに報告したトリるAcanthamoebasp.AA014細胞の形態：不定形死細胞，パンブルー法およびLogreduction法を用いたapo-bLFの：不定形生細胞，：球形生細胞，：球形死細胞．抗アカントアメーバ活性の検討において，apo-bLFは非常処理時間：60分Ⅰ-AⅠ-BⅡ-AⅡ-B図3apo.bLF処理におけるAcanthamoebasp.AA014のDiBAC4（3）染色性I：Control，II：apo-bLF30μM．A：位相差顕微鏡，B：蛍光顕微鏡．観察条件：励起480nm，蛍光530nm，Bar＝20μm．（89）あたらしい眼科Vol.32，No.4，2015553 100FL1-H200Events0101102103100FL1-H200Events0101102103104100FL1-H200Events0101102103104100FL1-H200Events0101102103100FL1-H200Events0101102103100FL1-H200Events0101102103ABCDEF100FL1-H200Events0101102103100FL1-H200Events0101102103104100FL1-H200Events0101102103104100FL1-H200Events0101102103100FL1-H200Events0101102103100FL1-H200Events0101102103ABCDEF図4apo.bLF，リゾチームおよびムチン共存下におけるAcanthamoebasp.AA014のDiBAC4（3）の取り込みによる蛍光強度の変動A：Control，B：加熱（80℃，30分），C：apo-bLF30μM，D：リゾチーム130μM，E：apo-bLF＋リゾチーム，F：apo-bLF＋リゾチーム＋ムチン0.2mg/mL．処理時間：60分．アメーバ間の静電的な相互作用によって，アメーバ細胞膜の脱分極および膜損傷を引き起こしていることが明らかとなった．一方，リゾチーム130μM単独での処理でも，apo-bLFほどではないが，抗アカントアメーバ活性が認められた．リゾチームは，細菌細胞壁のペプチドグリカン成分であるNアセチルムラミン酸およびN-アセチルグルコサミン間のb-1，4結合を加水分解することで抗菌活性を示す．LeonSicairosら12）による報告では，リゾチームが赤痢アメーバ栄養体に対して抗アメーバ活性を示すことから，アメーバ細胞膜には細菌のペプチドグリカンと類似の成分を有している可能性を示唆している．このLFおよびリゾチームの抗アメーバ活性がムチンで阻害傾向を示したことにも静電的な機序が関与していると推測される．塩基性蛋白質であるLFおよびリゾチームは，反応系中では正に帯電しており，負に帯電している細胞膜と静電的に相互作用している．そのため，塩基性蛋白質であるapo-bLFおよびリゾチームの共存は，アメーバ細胞膜への静電的な相互作用を大きくしたと考えられる．一方，ムチン分子は糖鎖非還元末端のN-アセチルノイラミン酸によって分子表面が負に帯電している．したがって，正電荷を有するapo-bLFやリゾチームと，負電荷を有するムチンが共存することにより，それらが静電的に相互作用し合い，apo-bLFやリゾチームの細胞膜への相互作用が弱まったと考えられる．実験に用いた各種蛋白質の濃度は，既報5.7）に基づいて設定し，ウシ顎下腺ムチンのN-アセチルノイラミン酸含有量は9.17％であった．ムチンは250kDa以上の分子量でその50％以上が糖鎖によるものであるが，涙液ムチンのN-アセチルノイラミン酸の含有量は明確ではない．このようなことから，今回の結果が臨床症例の炎症状態の眼表面や涙が付着したソフトコンタクトレンズにおいて，どのように反映されているかは不明であるが，実際の臨床現場でも，涙液中のLF，リゾチーム，ムチンが互いに関与していると考えられる．しかし，本研究から，apo-bLFがアカントアメーバ栄養体に対して高い抗アメーバ活性を有することは明らかであり，アカントアメーバ角膜炎の予防や治療における応用の可能性が示唆される．今後は，臨床的に問題となるシスト体に対するLFの作用およびLFとリゾチーム，ムチンの相互作用について検討する予定である．最後に，アメーバを分譲していただいた大阪大学感染制御部浅利誠志先生ならびに砂田淳子先生に感謝申し上げます．また，bLFを提供していただいた森永乳業株式会社食品基盤研究所山内恒治博士ならびに若林裕之博士に感謝申し上げます．利益相反：野町美弥（カテゴリーE：（株）メニコン），今安正樹（カテゴリーE：（株）メニコン）554あたらしい眼科Vol.32，No.4，2015（90） 文献1）MaP,VisvesvaraGS,MartinezAJetal：NaegleriaandAcanthamoebainfections：review.RevInfectDis12：490513,19902）YokogawaH,KobayashiA,YamazakiNetal：Bowman’slayerencystmentincasesofpersistentAcanthamoebakeratitis.ClinOphthalmol6：1245-1251,20123）冨田信一，魚谷孝之，高野真未ほか：ラクトフェリンによるHartmannella細胞の増殖抑制作用．ラクトフェリン2009：137-141，20094）堀裕一：涙液層にかかわる眼組織と涙液層の層別機能．専門医のための眼科診療クオリファイ19ドライアイスペシャリストへの道（横井則彦編），p34-37，中山書店，20135）KijlstraA,JeurissenSHM,KoningKM：Lactoferrinlevelsinnormalhumantears.BrJOpthalmol67：199-202,19836）砂田順，松尾信彦，藤井洋子ほか：シェーグレン病における涙液および唾液リゾチーム濃度の研究．眼臨80：816819,19867）中村葉，横井則彦，徳重秀樹ほか：健常者における涙液中のシアル酸測定．日眼会誌104：621-625,20008）冨田信一，長谷川祥太，魚谷孝之ほか：ラクトフェリンのアカントアメーバ臨床株における抗アメーバ活性．ラクトフェリン2011：35-40,20119）冨田信一，鈴木智恵，野町美弥ほか：Logreduction法によるラクトフェリンの抗アカントアメーバ活性の評価．ラクトフェリン2013：115-120,201310）YamauchiK,TomitaM,GiehlTJetal：Antibacterialactivityoflactoferrinandapepsin-derivedlactoferrinpeptidefragment.InfectImmun61：719-728,199311）EllisonRT,GiehlTJ：Killingofgram-negativebacteriabylactoferrinandlysozyme.JClinInvest88：1080-1091,199312）Leon-SicairosN,Lopez-SotoF,Reyes-LopezMetal：Amoebicidalactivityofmilk,apo-lactoferrin,sIgAandlysozyme.ClinMedRes4：106-113,2006＊＊＊（91）あたらしい眼科Vol.32，No.4，2015555