0910-1810/11/\100/頁/JCOPY（71）527《第49回日本白内障学会原著》あたらしい眼科28（4）：527.530，2011cはじめに一般に白内障はその混濁過程が比較的長期であり，種々の発症危険因子，たとえば，水晶体上皮細胞から線維細胞への分化過程での障害，加齢，喫煙，糖尿病，外傷，マッサージ，電撃，ガラス加工時の熱，超音波，薬物，栄養障害，さらに紫外線などによる放射エネルギーの関与が報告されている1～3）．近年，白内障のなかで最も発症頻度の高い加齢白内障の成因として，太陽光中に含まれる紫外線などによる水晶体細胞への酸化ストレス〔活性酸素種（reactiveoxygenspecies：ROS）など〕が注目されている．この機構として，酸化的傷害により水晶体上皮細胞，特に細胞膜が傷害を受け細胞内恒常性が破綻をきたし電解質バランスなどが崩れ，上昇した細胞内カルシウムイオン（Ca2＋）がCa2＋依存性蛋白分解酵素であるカルパインを活性化し，最終的にクリスタリン蛋白質が分解・凝集され水晶体混濁がひき起こされるという仮説が提唱されている1）．これら酸化ストレスに関わる代表的なROSは，スーパーオキシド（O2・），過酸化水素（H2O2），ヒドロキシラジカル（・OH），一酸化窒素（NO）などがあげられ，いずれも蛋白質や核酸からROSと反応しやすい脂質の水素を引き抜くことで連鎖的脂質過酸化反応をひき起こし，〔別刷請求先〕伊藤吉將：〒577-8502東大阪市小若江3-4-1近畿大学薬学部製剤学研究室Reprintrequests：YoshimasaIto,Ph.D.,SchoolofPharmacy,KinkiUniversity,3-4-1Kowakae,Higashi-Osaka,Osaka577-8502,JAPAN遺伝性白内障ICR/fラット水晶体への過酸化水素処理による脂質過酸化とCa2＋-ATPase活性の関連性長井紀章＊1村尾卓俊＊1小仲陽子＊1伊藤吉將＊1,2竹内典子＊3＊1近畿大学薬学部製剤学研究室＊2同薬学総合研究所＊3名城大学薬学部生理学研究室RelationshipbetweenLipidPeroxidationandCa2＋-ATPaseActivityinICR/fRatLensesStimulatedbyHydrogenPeroxideNoriakiNagai1）,TakatoshiMurao1）,YokoKonaka1）,YoshimasaIto1,2）andNorikoTakeuchi3）1）SchoolofPharmacy,2）PharmaceuticalResearchandTechnologyInstitute,KinkiUniversity,3）SectionofBiochemistry,FacultyofPharmacy,MeijoUniversity本研究では，正常およびIharacataractrat（ICR/fラット）水晶体を用い，白内障発症要因の一種である過酸化水素（H2O2）処理が水晶体中過酸化脂質（LPO）産生やCa2＋-ATPase活性へ与える影響について比較検討を行った．正常およびICR/fラットともにH2O2処理によりLPOの上昇が認められ，ICR/fラットでは正常ラットと比較し，低濃度のH2O2処理でLPO産生量増加が確認された．また正常およびICR/fラットともに，LPO値が6.7pmol/mgproteinに達した際に急速なCa2＋-ATPase活性低下が認められた．以上の結果から，ICR/fラットは正常ラットと比較し，水晶体でのH2O2に対する防御能が脆弱であることが明らかとなった．ThisstudyevaluatedtherelationshipbetweenlipidperoxidationandCa2＋-ATPaseactivityinthelensesofnormalratsandIharacataractrats（ICR/frat：arecessivehereditarycataractstrain）,followingstimulationbyhydrogenperoxide（H2O2）.Lipidperoxide（LPO）levelsinnormalandICR/fratlenseswereincreasedbytreatmentwithH2O2,andthelevelsintheLPOlensesbeingsignificantlyincreasedincomparisonwiththatinnormalratlenses.Inaddition,therapiddecreaseinCa2＋-ATPaseactivitywasobservedbyproductionofhighLPO（6-7pmol/mgprotein）inthelensesofnormalandICR/frats.TheresultssuggestedthattheICR/fratlensesaremoresensitivitytoH2O2thanarenormalratlenses.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）28（4）：527.530,2011〕Keywords：白内障，過酸化脂質，Ca2＋-ATPase,ジエチルジチオカルバミン酸，ICR/fラット．cataract,lipidperoxide,Ca2＋-ATPase,diethyldithiocarbamate,Iharacataractrat.528あたらしい眼科Vol.28，No.4，2011（72）この反応で多くの過酸化脂質（LPO）を生ずる．筆者らは，遺伝性白内障モデル動物Iharacataractrat（ICR/fラット）を用い，水晶体混濁前におけるROSによるLPOの増加を明らかとするとともに，水晶体でのLPO増加はICR/fラット白内障の主因であり，最終的に細胞内Ca2＋の増加を介した水晶体混濁をひき起こすことを報告した4）．したがって，ICR/fラット水晶体におけるROSによるLPOの増加と細胞内Ca2＋の制御機構であるCa2＋-ATPaseの関係を詳細にすることは白内障発症機構の解明および抗白内障薬開発を目指すうえで非常に重要と考えられる．本研究では，正常および遺伝性白内障モデル動物ICR/fラット水晶体を用い，ROSの一種であるH2O2処理による酸化ストレスが水晶体中LPO産生量やCa2＋-ATPase活性へ与える影響について比較検討を行った．また，活性酸素捕捉能を有するラジカルスカベンジャーであるジエチルジチオカルバミン酸（DDC）の影響についても検討した．I対象および方法1.実験動物実験には22日齢の遺伝性白内障ICR/fラットとWistarラット（正常ラット）を用いた．ICR/fラットは名城大学薬学部生理学研究室から供与された．正常ラットは清水実験材料から購入した．すべてのラットは室温25℃，湿度60％に保たれた環境下で飼育し，飼料（飼育繁殖固形飼料CE-2，日本クレア）および水は自由に摂取させた．2.水晶体中過酸化脂質量の測定LPOの測定は，正常およびICR/fラットから摘出した水晶体を0.100mMH2O2含有生理食塩水に加え60分間処理後，氷中でホモジナイズし，遠心分離（5,800rpm，10min，4℃）を行い，その上清をLPO測定試料とした．LPO測定はLPOAssayKit（BIOXYTECHRLPO-586TM）を用いてマロンジアルデヒドおよび4-ヒドロキシアルケンを分析することにより測定した．DDC処理時には，摘出した水晶体をH2O2含有生理食塩水処理前に，100μMDDC含有生理食塩水にて15分間処理を行った．得られた結果は総蛋白質量当りの量として表した．総蛋白質量はBio-RadProteinAssayKit（バイオ・ラッドラボラトリーズ社製）を用いて測定した．3.水晶体中Ca2＋-ATPase酵素活性の測定Ca2＋-ATPase酵素活性の測定は，正常およびICR/fラットから摘出した水晶体を0.100mMH2O2含有生理食塩水に加え60分間処理後，氷中でホモジナイズし，このホモジネートをCa2＋-ATPase酵素活性測定試料とした．Ca2＋-ATPase酵素活性の測定法はWangらの方法5）に従った．すなわち，上記ホモジネートを125μlずつ2本に分け，一方には2MKCl25μl,1M4-（2-hydroxyethyl）-1-piperazineethanesulfonicacid（HEPES,pH7.4）25μl,100mMMgCl225μl,20mMEGTA（グリコールエーテルジアミン四酢酸）25μl,4mMATP112.5μl，精製水12.5μlを加え，他方には2MKCl25μl,1MHEPES（pH7.4）25μl,100mMMgCl225μl,20mMEGTA25μl,4mMATP112.5μl,22mMCaCl212.5μlを加え，37℃で1時間インキュベーションした．酵素反応は25μlの氷冷50％トリクロロ酢酸を加えることにより停止させた．その後，遠心分離（5,000rpm，10min，4℃）し，上清200μlにモリブデン硫酸液（2.7mM七モリブデン酸六アンモニウム，205mM硫酸）600μl，Fiske-Subarow液（10.4mM1-アミノ-2-ナフトール-4-スルホン酸，1.4M亜硫酸水素ナトリウム，40.7mM亜硫酸ナトリウム）20μl加え，室温で10分間放置し，660nmにおける吸光度を分光光度計CL-770（島津製作所製）にて比色定量した．Ca2＋-ATPase酵素活性は0.1mMCaCl2存在下または非存在下でのATP分解により放出される無機リン酸（Pi）量の差により算出した．DDC処理時には，摘出した水晶体をH2O2含有生理食塩水処理前に，100μMDDC含有生理食塩水にて15分間処理を行い，同様に酵素活性を測定した．得られた結果は総蛋白質量当りの量として表した．II結果1.H2O2処理によるICR/fラット水晶体中LPO産生量およびCa2＋-ATPase活性の変化図1，2には正常（図1）とICR/fラット（図2）水晶体へのH2O2処理によるLPO産生量およびCa2＋-ATPase活性の変化を示した．正常およびICR/fラットともにH2O2処理濃度の増加に従いLPO産生量の増加が認められ，そのLPO産生量の最大値は約9pmol/mgproteinであり，正常とICR/fラットでほぼ同じであった．一方，Ca2＋-ATPase活性においては，正常およびICR/fラットともにH2O2処理濃度の増加に従いCa2＋-ATPase活性の低下がみられた．これら正常とICR/fラット水晶体におけるCa2＋-ATPase活性は，LPO産生量が6.7pmol/mgprotein付近で急速に低下した．また，LPO産生量の増加およびCa2＋-ATPase活性の低下は，正常ラットでは60mMH2O2処理で認められたが，ICR/fラット水晶体ではより低濃度の20mMH2O2処理でみられた．2.ラジカルスカベンジャーDDC処理がH2O2処理誘発水晶体中LPO産生量およびCa2＋-ATPase活性変化へ与える影響図3に100μMDDC前処理後30mMH2O2にて刺激した際の，正常およびICR/fラット水晶体中LPO産生量の変化を示した．正常およびICR/fラットともに，H2O2処理により増加した水晶体LPO産生量は，DDCを前処理することで有意に減少した．図4には100μMDDC前処理後30mM（73）あたらしい眼科Vol.28，No.4，2011529H2O2にて刺激した際の，正常およびICR/fラット水晶体中Ca2＋-ATPase活性の変化を示した．水晶体中Ca2＋-ATPase活性においても，DDCを前処理することでH2O2処理により低下した水晶体Ca2＋-ATPase活性は，正常およびICR/fラットともにH2O2未処理水晶体と同程度まで回復した．III考按加齢白内障の成因とされる酸化ストレスはおもにROSによりひき起こされる1,4）．このROSの一つであるH2O2はFe2＋やハロゲンと反応して活性酸素のなかでも最も反応性が高く酸化力の強い・OHを生じ，・OHは脂質の水素を引き抜くことで連鎖的脂質過酸化反応を誘発し，大量のLPO産生に関わることが知られている6）．筆者らはこれまで遺伝性白内障モデル動物ICR/fラットを用い，水晶体中での大量のLPO産生は細胞内Ca2＋の増加をひき起こし，最終的に水晶体混濁につながることを明らかとしてきた4）．そこで本研究では，正常およびICR/fラット水晶体を用いH2O2処理による酸化ストレスが水晶体中LPO産生量および細胞内Ca2＋調節を担うCa2＋-ATPase活性へ与える影響について比較検討を行った．以前に筆者らは前眼部画像解析装置EAS-1000を使い，動物を殺傷せずに水晶体混濁を測定した4）．その結果22.63日齢のICR/fラット水晶体は透明性を維持しており，混濁は認められなかったが，77日齢では混濁開始が認められ，91日齢のICR/fラット水晶体は成熟白内障であった．さらに，水晶体中Ca2＋上昇および水晶体混濁の要因とされる，加齢に伴う水晶体中LPO量およびCa2＋-ATPase活性についても，22.49日齢のICR/fラットでは変化が認められないことを確認した4）．これらの結果から本研究では22日齢のICR/fラット水晶体（透明時の水晶体）を研究に使用した．2.52.01.51.00.50.01086420Lipidperoxide（pmol/mgprotein）Lipidperoxide（pmol/mgprotein）Normalrat＊ControlDDC＊ControlDDCICR/frat図3ジエチルジチオカルバミン酸（DDC）が過酸化水素（H2O2）処理による過酸化脂質（LPO）上昇へ与える影響Control：30mMH2O2処理，DDC：100μMDDCおよび30mMH2O2処理（n＝3.4）．＊p＜0.05vs.Control.121086420020406080100Lipidperoxide（pmol/mgprotein）H2O2concentration（mM）43210Ca2＋-ATPaseactivity（μmol/mgprotein/hr）○：LPO●：Ca2＋-ATPase図1過酸化水素（H2O2）処理による正常ラット水晶体中過酸化脂質（LPO）およびCa2＋-ATPase活性の変化（n＝3.4）121086420020406080100Lipidperoxide（pmol/mgprotein）H2O2concentration（mM）43210Ca2＋-ATPaseactivity（μmol/mgprotein/hr）○：LPO●：Ca2＋-ATPase図2過酸化水素（H2O2）処理によるICR/fラット水晶体中過酸化脂質（LPO）およびCa2＋-ATPase活性の変化（n＝3.4）43210Ca2＋-ATPaseactivity（μmol/mgprotein/hr）43210Ca2＋-ATPaseactivity（μmol/mgprotein/hr）＊NormalratICR/fratControlDDC＊ControlDDC図4ジエチルジチオカルバミン酸（DDC）が過酸化水素（H2O2）処理によるCa2＋-ATPase活性低下へ与える影響Control：30mMH2O2処理，DDC：100μMDDCおよび30mMH2O2処理（n＝3.4）．＊p＜0.05vs.Control.530あたらしい眼科Vol.28，No.4，2011（74）H2O2を用いラット水晶体に酸化ストレスを施したところ，正常およびICR/fラットともにH2O2によるLPO産生量の増加が認められた（図1，2）．これらH2O2によるLPO産生量の増加は，活性酸素捕捉能を有するDDC処理により抑制された（図3）ことから，H2O2処理による水晶体内LPO産生量の増加はラジカルを介した連鎖的脂質過酸化反応によるものであると示唆された．一方，正常ラットと比較しICR/fラット水晶体では低濃度のH2O2処理によるLPO産生量の増加がみられた．したがって，ICR/fラット水晶体では正常ラット水晶体と比較し，低濃度のH2O2処理においても連鎖的脂質過酸化反応が誘発されることが明らかとなった．したがって，ICR/fラットでは正常ラットと比較し，ROSに対する防御機構が脆弱であるものと示唆された．本結果において，正常およびICR/fラットともにH2O2処理濃度の増加に従い，Ca2＋-ATPase活性の低下がみられた．このCa2＋-ATPase活性の低下もまた，DDC処理により抑制された．筆者らの遺伝性白内障動物を用いた以前のinvivo実験の結果4,7）において，水晶体でのLPO産生量の増加に従い，Ca2＋-ATPaseの構造変化を介したCa2＋ポンプくみ出し機能の低下がみられることから，水晶体におけるROSによるLPOの増加はCa2＋-ATPase活性の低下をひき起こすことが明らかとなった．さらに，正常ラット水晶体において，50と60mMおよび60と70mMH2O2処理群間におけるLPOの増加差はそれぞれ2.33，2.27pmol/mgproteinと同程度であったが，Ca2＋-ATPase活性低下の差は0.49，1.57μmol/mgprotein/hrと60と70mMH2O2処理群間で急速な低下が認められた．ICR/fラット水晶体においても未処理群と20mMおよび20と30mMH2O2処理群間におけるLPOの増加差はそれぞれ2.87，2.24pmol/mgproteinであり，未処理群と20mMH2O2処理群間のLPO産生量差のほうが大きな増加が認められたが，Ca2＋-ATPase活性低下は0.81，1.45μmol/mgprotein/hrと20と30mMH2O2処理群間で急速な低下が認められた．これら正常とICR/fラット水晶体におけるCa2＋-ATPase活性の急速な低下は，ともにLPO産生量が6.7pmol/mgprotein付近に達した際に認められたことから，LPO増加に伴うCa2＋-ATPase活性の低下には最低値が存在することが示唆された．筆者らが以前に測定したICR/fラットのinvivo実験の報告4,7）においても，Ca2＋-ATPase活性低下はLPO値が約7pmol/mgprotein付近に達した際に認められたことから，ある一定値までのROSによるLPO産生量増大は，Ca2＋-ATPase活性に与える影響は弱いが，一定値（ラット水晶体においては7pmol/mgprotein付近）を超えるとCa2＋-ATPase活性の低下が急速に進行し，重度な白内障進行へとつながる可能性が示唆された．細胞内において上昇した細胞内Ca2＋濃度は，細胞内カルシウムストアへ取り込まれるか細胞外へ排出されることで調節されている．このカルシウムストアへの取り込みは，小胞体膜に存在するsarcoplasmicreticulumCa2＋-ATPase（SERCA）によって行われ，細胞外への排出は細胞膜に存在するplasmamembraneCa2＋-ATPase（PMCA）によって行われる．今回測定したCa2＋-ATPase活性はSERCAとPMCA両方の活性を含むものであるため，今回の結果から得られたLPO増加による急速なCa2＋-ATPase活性の低下は，SERCAとPMCAのどちらに強く起因するのかを明らかとすることは白内障発症機構解明研究において非常に重要でありさらなる研究が必要である．したがって，現在筆者らはLPO産生がSERCAとPMCAへ与える影響について検討しているところである．以上，本研究ではICR/fラットは正常ラットと比較し，水晶体における酸化ストレスに対する防御能が脆弱であることを明らかとした．また，ラット水晶体中における一定以上の脂質過酸化により急速なCa2＋-ATPase活性低下がみられ，その際のLPO値はラットにおいて6.7pmol/mgproteinであることが判明した．さらに，DDCがH2O2刺激によるLPO上昇においても効果的に働くことを確認した．これらの報告は今後の抗白内障薬開発研究の確立に有用であるものと考える．文献1）SpecterA：Oxidativestress-inducedcataract：mechanismofaction.FASEBJ9：1173-1182,19952）佐々木一之：白内障．医学と薬学33：1271-1277,19953）ShearerTR,DavidLL,AndersonRSetal：Reviewofselenitecataract.CurrEyeRes11：357-369,19924）NagaiN,ItoY,TakeuchiN：InhibitiveeffectsofenhancedlipidperoxidationonCa（2＋）-ATPaseinlensesofhereditarycataractICR/frats.Toxicology247：139-144,20085）WangZ,BunceGE,HessJL：SeleniteandCa2＋homeostasisintheratlens：effectonCa-ATPaseandpassiveCa2＋transport.CurrEyeRes12：213-218,19936）大柳善彦：SODと活性酸素調節剤─その薬理作用と臨床応用．p3-4，日本医学館，19897）NagaiN,ItoY,TakeuchiNetal：ComparisonofthemechanismsofcataractdevelopmentinvolvingdifferencesinCa（2＋）regulationinlensesamongthreehereditarycataractmodelrats.BiolPharmBull31：1990-1995,2008＊＊＊