《原著》あたらしい眼科33（10）：1518?1523，2016c各種プロスタグランジン系緑内障点眼薬が水晶体上皮細胞に及ぼす影響について茨木信博＊1三宅謙作＊2＊1いばらき眼科クリニック＊2眼科三宅病院TheInfluenceofVariousProstaglandinGlaucomaEyedropsonLensEpithelialCellsNobuhiroIbaraki1）andKensakuMiyake2）1）IbarakiEyeClinic,2）MiyakeEyeHospital目的：これまでに，緑内障点眼薬で白内障手術後に黄斑浮腫が発症する原因は，水晶体上皮細胞の炎症性サイトカイン産生促進であることを報告した．今回は，点眼液による水晶体上皮細胞の炎症性サイトカイン産生促進効果と細胞障害性を各種プロスタグランジン（PG）系緑内障市販薬間で比較した．方法：培養水晶体上皮細胞株の細胞形態と培養上清中のIL（インターロイキン）-1a，IL-6，PGE2を計測した．製剤は，キサラタン（X），ラタノプロストPF（L），ルミガン（Lu），タプロス（T），トラバタンズ（Tr）で，10?1,000倍希釈を培地に添加した．結果：Xでは1,000倍希釈でも細胞形態に異常を示したが，L，Luでは300倍希釈，T，Trでは100倍希釈で細胞は正常な形態であった．サイトカインはX，L，Lu，T，Trの順で多く産生された．結論：緑内障点眼製剤による水晶体上皮細胞の細胞障害とサイトカインの産生促進は，塩化ベンザルコニウムの含有濃度や種類により差があること，非含有でも他の添加剤で生じることが明らかとなった．Purpose：Wehavereportedthatmacularedemaaftercataractsurgerywithuseofglaucomaeyedropsiscausedbystimulatorycytokineproductionoflensepithelialcells.Inthisreport,wecomparetheinfluenceofvariousglaucomaeyedropsonlensepithelialcells.Methods：Humanlensepithelialcellswereculturedwithvariousdrugs：Xalatan,LatanoprostPF,Lumigan,TapulosandTrabatans.Eachdrugwasdiluted10to1000timesandaddedtothemedium.CellmorphologywasobservedandcytokinesIL-1-alpha,IL-6andPGE2intheculturesupernatantweremeasured.Results：LumiganandLatanoprostPFat300xdilutionandTapulosandTrabatansat100xshowednocytotoxicity,butXalatanat1000xdilutionshowedcytotoxicity.Intermsofcytokineproduction,Xalatan,Lumigan,LatanoprostPF,TapulosandTrabatansshoweddecreases,respectively.Conclusion：Glaucomaeyedropformulationswereantagonistictocytotoxicityinlensepithelialcells,andpromotedtheproductionofcytokines.Thedegreediffersdependingonthetypeandconcentrationofbenzalkoniumchlorideadded,andofotherpreservativesinthebenzalkoniumchloride-freetypes.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）33（10）：1518?1523,2016〕Keywords：白内障術後，黄斑浮腫，緑内障点眼薬，塩化ベンザルコニウム，水晶体上皮細胞．aftercataractsurgery,macularedema,glaucomaeyedrop,benzalkoniumchloride,lensepithelialcells.はじめに?胞様黄斑浮腫（cystoidmacularedema：CME）は，種々の眼疾患や眼内手術後に生ずるが，その成因は不明である．白内障手術後に生ずるCMEについても，低眼圧，硝子体索引，炎症などが考えられている1）．さらに，白内障手術後に緑内障薬の点眼を行った場合に，CMEが起こることが報告されている．近年，プロスタグランジン製剤の白内障手術後の使用によるCMEが報告されているが2?5），緑内障治療薬によるCMEは以前より数多く報告されている．これまでに筆者らは，この白内障手術後の緑内障点眼薬によるCMEの原因を明らかにするために，ラタノプロスト，チモロール，防腐剤である塩化ベンザルコニウムの入らないチモロール，さらに，緑内障薬の主成分を含まない基剤のみと，さらにその基剤から塩化ベンザルコニウムを除いたものを使用し，白内障手術後早期眼において，CMEの発生が緑内障治療薬の主成分の関与よりも，添加されている防腐剤である塩化ベンザルコニウムが大きく関与していることを報告した6）．さらに，ヒト水晶体上皮細胞（humanlensepithelialcell：HLEC）を培養し，緑内障点眼薬の主成分であるラタノプロスト，チモロール，塩化ベンザルコニウムを添加し，各種炎症系サイトカインの産生を検討したところ，緑内障点眼薬の主成分よりも塩化ベンザルコニウムの添加によって，はるかに高濃度のサイトカインを産生することを明らかにした7）．今回は，実際に臨床で使用している各種プロスタグランジン系緑内障市販薬によるHLECに対する障害，サイトカインの産生について検討し，塩化ベンザルコニウム，ホウ酸などの防腐効果のある物の添加により，HLECが障害を受け，サイトカインの産生も増加すること，塩化ベンザルコニウム自体の改良や防腐剤の工夫によって障害やサイトカインの産生を抑えることが可能であることを見いだした．さらに，点眼容器の工夫によって防腐剤フリーとされている点眼薬について，塩化ベンザルコニウム以外の添加剤によって，高濃度のサイトカインが産生され，細胞障害も高度に生ずることが明らかとなったので報告する．I方法培養したHLECは，ヒト由来の水晶体上皮佃胞で株化されたもの（SRA01/04）8）を用いた．25mm2の培養フラスコに，70±5個/mm2の細胞密度となるように調整し，37℃，5％炭酸ガス，湿度100％で培養した．培養液は，DulbeccoMinimumEssentialMedium（Gibco,GlandIsland,NY）に5％ウシ胎児血清を添加したもので，抗菌薬や抗真菌薬の入らないものを標準培地として用いた．薬剤は，キサラタン（ファイザー：以下，X），タプロス（参天製薬：以下，T），トラバタンズ（日本アルコン：以下，Tr），ラタノプロストPF（日本点眼薬研究所：以下，L），ルミガン（千寿製薬：以下，Lu）を各企業より提供を受け使用した．それぞれの点眼薬を標準培地で10?1,000倍に希釈したもので細胞培養を行った．培養7日目に位相差顕微鏡で細胞形態を観察するとともに，培地を回収し細胞成分を除去した後に培地中の各種サイトカインを定量した．薬剤の希釈度によって生細胞数が異なるため，各々の培養フラスコ中の細胞数を計測し，105個の細胞に対するサイトカイン量を計算した．標準培地でのみ培養したものを対照とした．各々3個の培養を行い，平均値と標準偏差を求めた．炎症性サイトカインはインターロイキン1a（IL-1a），インターロイキン6（IL-6）とプロスタグランジンE2（PGE2）を測定した．IL-1aはEL1SA（enzyme-linkedimmunosorbentassay）キット（日本抗体研究所，高崎市），IL-6はCLEIA（chemiluminescentenzymeimmunoassay）キット（富士レビオ，東京），PGE2はRIA（radioimmunoassay）キット（NENLifeScienceProducts,Boston）を用いて測定した7）．II結果1.細胞形態Xは100倍希釈以上の高濃度で細胞は死滅し，300倍で少数の生細胞を，1,000倍で細胞伸展を認めた（図1）．Lu（図2），L（図3）は，30倍以上で細胞は死減，100倍で伸展，300倍未満で正常であった．T（図4），Tr（図5）は，10倍で細胞が死滅，30倍で伸展，100倍で正常であった．2.サイトカイン産生IL-1aの産生量は，対照が60.6±42.0pg/105細胞（平均値±標準偏差）に対し，300倍希釈のXが146.5±31.7pg/105細胞で，100倍希釈のLu，L，T，Trは各々50±26.8，21.1±9.0，11.3±5.3，4.0±0.6pg/105細胞であった（図6）．IL-6（図7）は，対照，300倍希釈のX，100倍希釈のLu，L，T，Trが各々378.9±228.5，2,011.5±338.7，1,154.7±296.6，362.3±106.8，222.6±33.9，148.6±15.8pg/105細胞，PGE2（図8）は，各々21.9±13.8，205.3±41.1，NA，71.3±35.3，8.3±0.3，10.3±3.7pg/105細胞であった．III考按これまでに筆者らは，白内障術後の緑内障薬によるCMEは，塩化ベンザルコニウムの関与の可能性が高いこと，その機序として白内障の手術後に残存した水晶体上皮細胞に，緑内障治療薬が作用することにより各種サイトカインが多量に産生されることを確認し，このサイトカインが網膜に作用するためではないかと考えた6,7）．防腐剤としての塩化ベンザルコニウムは，静菌や殺菌作用，保存効力が高いことから，点眼薬の約7割で使用されている．塩化ベンザルコニウムを添加することで，薬物の浸透性が亢進するという利点がある一方で，これまでに眼表面障害の問題がとりあげられている．おもに角膜上皮細胞に対する細胞毒性が報告されおり，これは防腐剤の界面活性作用によるもので，細胞膜の透過性が高まり，膜破壊や細胞質の変性によって生じる9）．塩化ベンザルコニウムなどの防腐剤が点眼薬に添付される意味は，点眼瓶を用いて繰り返し使用するために，開栓によって瓶内に細菌が混入し，増値することを防ぐためである．したがって，単回使用の点眼には通常防腐効果のある添加剤は添加されていない．また，その防腐効果を確認するために，種々の細菌を用いた保存効力試験が実施され，点眼瓶，点眼薬の汚染が生じないかを検討されている10）．今回使用したXとLu，Tにはそれぞれ塩化ベンザルコニウムが0.02％と0.005％，0.001％，TrとLには塩化ベンザルコニウムは含有されていないが，濃度は不明であるが，防腐剤としての亜鉛やホウ酸などの緩衝剤が添加されている．X，Lu，Tの順で，細胞障害が生じ，サイトカインの産生も多かった．これは，塩化ベンザルコニウムの濃度によって障害の程度が決まること7）と同様の結果であった．さらに，Tの塩化ベンザルコニウムは，塩化ベンザルコニウムの炭素鎖長が一定のものであり，他の製剤ではこの炭素鎖長が種々であるのに対し，より細胞毒生が少ないものを使用している．さらに，Tでは保存効力試験と角膜上皮細胞を用いた細胞毒性試験を行い，塩化ベンザルコニウムの至適濃度（0.0005?0.003％）を決定し，以前の0.01％から現在の0.001％に減量されている11）．LuのPGE2が検査不能であったが，これはLuが検査試薬と交差反応するものと考えられ，異常な高値を示したが，詳細は不明である．Trは，塩化ベンザルコニウムに代わる防腐剤として，ホウ酸の存在下で亜鉛イオンが細菌などのATP産生を阻害することで細菌などを死滅させる添加物が含まれている．これは，酸性下でもっともその効力が強力に出現することから，製剤の状態では酸性を示している．点眼することで，涙液によって緩衝され中性となることで，細胞毒性が減弱，消失するものと考えられている12）．今回の検討においても，Trを培養液に加えることで中性になり，添加物の細胞毒性が軽減したと考えられる．最後に，Lについては，塩化ベンザルコニウムを含まない点眼薬なので好結果を期待していた．しかし，結果は塩化ベンザルコニウムが含まれている製剤と同等の結果であった．Lは，塩化ベンザルコニウムを含まなくても，複数回の点眼で容器内の細菌などの増殖を防御するために，点眼口にフィルターを付け，細菌などの混入を防御している．防腐剤を減らし，あるいは無添加にすることが可能な点眼瓶として，非常に有益なものと思われる．しかし，今回の良好な結果が得られなかったのは，保存効力試験を通すために，塩化ベンザルコニウムは非添加であるが，ホウ酸（濃度不明）が細菌などの増殖が生じないように添加されているためと考えられた．本来，フィルターを用いた点眼瓶に保存効力試験を行う必要はないので，塩化ベンザルコニウム以外の添加剤についても，その添加の目的，濃度などを検討すべきであると考えられた．今回の検討で，緑内障の点眼薬の実薬においても，水晶体上皮細胞の細胞障害や細胞のサイトカイン産生に及ぼす影響は，塩化ベンザルコニウム含有によって濃度依存的に強いことと，塩化ベンザルコニウム非添加でフィルター付き点眼瓶を用いた薬剤でも，塩化ベンザルコニウム添加の薬物と同等の影響があることが明らかとなった．白内障術後の緑内障点眼薬の使用については，塩化ベンザルコニウムの含有濃度に注意して使用すべきと考えられた．さらに，塩化ベンザルコニウム非添加であっても，他の防腐効果を期待した添加物を加えていることがあるので，点眼薬の添加物や保存効力試験の有無などもよく確認する必要があると思われた．文献1）GassJDM：StereoscopicAtlasofMacularDiseases；DiagnosisandTreatment.4thEd,p478-481,CVMosby,St.Louis,MO,19972）RoweJA,HattenhauerMG,HermanDC：Adversesideeffectsassociatedwithlatanoprost.AmJOphthalmol124：683-685,19973）FechtnerRD,KhouriAS,ZimmermanTJetal：Anterioruveitisassociatedwithlatanoprost.AmJOphthalmol126：37-41,19984）MoroiSE,GottfredsdottirMS,SchteingartMTetal：Cystoidmacularedemaassociatedwithlatanoprosttherapyinacaseseriesofpatientswithglaucomaandocularhypertension.Ophthalmology106：1024-1029,19995）MiyakeK,OtaI,MaekuboKetal：Latanoprostacceleratesdisruptionoftheblood-aqueousbarrierandtheincidenceofangiographiccystoidmacularedemainearlypostoperativepseudophakias.ArchOphthalmol117：34-40,19996）MiyakeK,OtaI,IbarakiNetal：Enhanceddisruptionoftheblood-aqueousbarrierandtheincidenceofangiographiccystoidmacularedemainearlypostoperativepseudokaias.ArchOphthalmol119：387-394,20017）GotoY,IbarakiN,MiyakeK：Humanlensepithelialcelldamageandstimulationoftheirsecretionofchemicalmediatorsbybenzalkoniumchlorideratherthanlatanoprostandtimolol.ArchOphthalmol121：835-839,20038）IbarakiN,ChenS-C,LinL-Retal：Humanlensepithelialcellline.ExpEyeRes67：577-585,19989）相良健：オキュラーサーフェスへの影響─防腐剤の功罪．あたらしい眼科25：789-794,200810）保存効力試験法．第十六改正日本薬局方．2044-2046,2011.3.24.厚生労働省11）浅田博之，七條優子，中村雅胤ほか：0.0015％タフルプロスト点眼液のベンザルコニウム塩化物濃度の最適化検討─眼表面安全性と保存効力の視点から─．YAKUGAKUZASSHI130：867-871,201012）LewisRA,KatzGJ,WeissMJetal：Travoprost0.004％withandwithoutbenzarkoniumchloride：acomparisonofsafetyandefficacy.JGlaucoma16：98-103,2007〔別刷請求先〕茨木信博：〒320-0851栃木県宇都宮市鶴田町720-1いばらき眼科クリニックReprintrequests：NobuhiroIbaraki,M.D.,IbarakiEyeClinic,720-1Tsuruta-machi,Utsunomiyacity,Tochigi320-0851,JAPAN0195110-81810/あ16た/（133）あたらしい眼科Vol.33，No.10，20161519図1キサラタン添加時の細胞形態7日目a：100倍希釈．ほとんどの細胞が死滅している．b：300倍希釈．わずかの生細胞を認めるが，細胞は伸展している．c：1,000倍希釈．ほぼ正常の細胞形態（バーは100μm）．図2ルミガン添加時の細胞形態7日目a：30倍希釈．ほとんどの細胞が死滅している．b：100倍希釈．細胞伸展を認める．c：300倍希釈．ほぼ正常の細胞形態（バーは100μm）．1520あたらしい眼科Vol.33，No.10，2016（134）図3ラタノプロストPF添加時の細胞形態7日目a：30倍希釈．ほとんどの細胞が死滅している．b：100倍希釈．細胞伸展を認める．c：300倍希釈．ほぼ正常の細胞形態（バーは100μm）．図4タプロス添加時の細胞形態7日目a：10倍希釈．ほとんどの細胞が死滅している．b：30倍希釈．細胞伸展を認める．c：100倍希釈．ほぼ正常の細胞形態（バーは100μm）．（135）あたらしい眼科Vol.33，No.10，20161521図5トラバタンズ添加時の細胞形態7日目a：10倍希釈．ほとんどの細胞が死滅している．b：30倍希釈．細胞伸展を認める．c：100倍希釈．ほぼ正常の細胞形態（バーは100μm）．図6IL?1aの産生（pg/105細胞）X：キサラタン，Lu：ルミガン，L：ラタノプロストPF，T：タプロス，Tr：トラバタンズ．図7IL?6の産生（pg/105細胞）X：キサラタン，Lu：ルミガン，L：ラタノプロストPF，T：タプロス，Tr：トラバタンズ．図8PGE2の産生（pg/105細胞）X：キサラタン，Lu：ルミガン，L：ラタノプロストPF，T：タプロス，Tr：トラバタンズ．1522あたらしい眼科Vol.33，No.10，2016（136）（137）あたらしい眼科Vol.33，No.10，20161523
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各種プロスタグランジン系緑内障点眼薬が水晶体上皮細胞に及ぼす影響について
2016年10月31日 月曜日紫外線によるブタ水晶体上皮細胞傷害に対するEPC-K1の効果
2012年2月29日 水曜日《原著》あたらしい眼科29（2）：277.282，2012c紫外線によるブタ水晶体上皮細胞傷害に対するEPC-K1の効果山口大輔＊1中西孝子＊2奥野勉＊3植田俊彦＊1舟橋久幸＊4塩田清二＊4久光正＊2小出良平＊1＊1昭和大学医学部眼科学教室＊2昭和大学医学部第一生理学教室＊3労働安全衛生総合研究所＊4昭和大学医学部第一解剖学教室E.ectofEPC-K1onUltravioletRadiation-InducedInjuryinCulturedLensEpithelialCellsDaisukeYamaguchi1）,TakakoNakanishi-Ueda2）,TsutomuOkuno3）,ToshihikoUeda1）,HisayukiFunahashi4）,SeijiShioda4）,TadashiHisamitsu2）andRyoheiKoide1）1）DepartmentofOphthalmology,2）DepartmentofPhysiology,4）DepartmentofAnatomy,ShowaUniversitySchoolofMedicine,3）HumanEngineeringandRiskManagementResearchGroup,NationalInstituteofOccupationalSafetyandHealth目的：紫外線（UV）による培養ブタ水晶体上皮細胞（LEC）傷害に対するビタミンE（VE）とビタミンC（VC）のリン酸ジエステルであるEPC-K1の効果について検討した．方法：UV照射後に各0.1mMEPC-K1，VEまたはVC溶液を添加し，48時間後の生細胞数をクリスタルバイオレット（CV）法で測定した．また，DNA酸化ストレスマーカーである8-hydroxy-deoxyguanosine（8-OHdG）を免疫染色した．結果：310nm，500mJ/cm2照射によりLEC生細胞数は37％に減少した．EPC-K1添加により，生細胞数は非照射レベルに回復したが，VEまたはVC単独，またはVC＋VE同時添加では回復しなかった．UV照射6時間後，8-OHdGは増加したが，EPC-K1により減少した．結論：EPC-K1は酸化ストレスを抑制し，UVによるLEC傷害を抑制したと考えられた．Purpose：Theaimofthisstudywastoinvestigatethepreventivee.ectofEPC-K1,aphosphatediesterofvitaminC（VC）andvitaminE（VE）,againstUVradiation-inducedlensepithelialcell（LEC）injury.Methods：LECviabilitywasdeterminedbycrystalviolet（CV）stainingat48hoursafterUVirradiation.TheDNAoxidativestressmarker8-hydroxy-deoxyguanosine（8-OHdG）wasdeterminedbyimmunohistochemicalstain.Results：Irradiationof500mJ/cm2at310nmsigni.cantlydecreasedcellviabilityto37％ofcontrol（withoutirradiation）.Theadditionof0.1mMEPC-K1afterirradiationreturnedcellviabilitytocontrollevel,buttheadditionof0.1mMVE,VCorVE＋VCwasnote.ective.Although8-OHdGstainedcellsincreasedat6hoursafterUVirradiation,theydecreasedwiththeadditionof0.1mMEPC-K1.Conclusion：TheseresultssuggestthatagainstUV-inducedLECinjury,EPC-K1exertsaprotectivee.ectthatinvolvesoxidativestressinhibition.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）29（2）：277.282,2012〕Keywords：水晶体上皮細胞，紫外線照射，EPC-K1，8-ハイドロキシ-デオキシグアノシン．lensepithelialcell,ultravioletirradiation,EPC-K1,8-hydroxy-deoxyguanosine.はじめに紫外線が生体に及ぼす作用にはDNAの直接的傷害，活性酸素種（reactiveoxygenspecies：ROS）形成を介した細胞の傷害などが知られている1.3）．水晶体でも波長300.400nmは吸収され4），ROSによる細胞膜傷害5），蛋白質変性6）が報告されている．正常な状態では，DNA傷害修復機構やsuperoxidedismutaseやcatalase，glutathioneperoxidaseのような抗酸化酵素やアスコルビン酸やグルタチオンなどの抗酸化物質によるROSの消去系で傷害は抑制されている7,8）．しかし何らかの原因により酸化/抗酸化のバランスが崩れROSを消去できず，産生系が亢進する場合に酸化ストレスが生じる．8-hydroxy-deoxyguanosine（8-OHdG）は最も顕〔別刷請求先〕植田俊彦：〒142-8666東京都品川区旗の台1-5-8昭和大学医学部眼科学教室Reprintrequests：ToshihikoUeda,M.D.,DepartmentofOphthalmology,ShowaUniversitySchoolofMedicine,1-5-8Hatanodai,Shinagawa-ku,Tokyo142-8666,JAPAN著な酸化DNA産物の一つであり，酸化ストレスの指標として用いられている9.12）．ビタミンE（VE）とビタミンC（VC）をリン酸エステル結合で合成したl-ascorbicacid2-［3,4-dihydro-2,5,7,8-tetramethyl-2-（4,8,12-trimethyltridecyl）-2H-l-benzopyran-6-yl-hydrogenphosphate］potassiumsalt（EPC-K1）は水溶性，脂溶性ラジカルスカベンジャーで13），網膜ホモジェネート中脂質過酸化物質生成を抑制し14），ホスホリパーゼA2活性を抑制する15）．鉄誘導ウシ網膜ホモジェネート中脂質過酸化物質を対象として抗酸化効果を比較した実験ではEPC-K1のIC50（50％阻害濃度）値は20μMとepigallo-catechingal-lateのIC50（6.8μM）と比較しても強い抗酸化力をもつ14）．本研究では水晶体に吸収される310nmとDNAに吸収されやすくcyclobutanepyrimidinedimmerを産生する最適な波長であるとされる270nm16）の紫外線を用い，ブタ水晶体上皮細胞（lensepithelialcells：LEC）傷害をひき起こし，生細胞数を指標としてEPC-K1とVEまたはVCの効果を比較した．また，酸化ストレスの指標となる8-OHdGの変化に注目し，EPC-K1の効果を観察した．I実験方法1.細胞培養新鮮なブタ眼球（東京芝浦臓器株式会社，東京）から水晶体上皮を得て，コラーゲンIコート60mmディッシュ（BDFalconR，日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）に固定し，血清含有培地〔10％ウシ胎児血清：FBS（GIBCOR，invitrogen），100u/mlpenicillin,100μg/mlstreptmycin,2.5μg/mlamphoterisinB（GIBCOR，invitrogen）を含むD-MEM/F-12（Dulbecco’sModi.edEagleMedium：NutrientMixtureF-12,GIBCOR，invitrogen）〕にて37℃，5％CO2の条件下，初代培養した．2週間後，コンフルエントになったLECを，0.25％trypsin-EDTA（GIBCOR，invitrogen）処理により回収し，コラーゲンIコートT-75フラスコ（BDFalconR，日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）を用い，血清含有培地にて37℃，5％CO2の条件下，継代した．培地は2.3日ごとに交換し，継代数4.6の細胞を実験に用いた．2.紫外線照射キセノンランプ光源装置（MAX-301,朝日分光株式会社）を用いて，特定の波長域を分離するバンドパスフィルター（半値幅10nm）により310nmまたは270nmを得て石英製のライトガイドとロッドレンズ（朝日分光株式会社）を通して照射した（図1）．照射量（放射露光，J/cm2）はおおむねその波長における50％致死量とした．照射直前に放射照度（W/cm2）をシリコーンフォトダイオードディテクター（SEL033,InternationalLightTechnology,Peabody,MA,出力口96wellplate図1紫外線照射装置キセノンランプ光源装置（MAX-301,朝日分光株式会社）．出力口を固定し，1wellずつ照射した．周辺のwellには斜光カバーを施した．USA）に接続したラジオメータ（IL1400A,InternationalLightTechnology）で測定し，照射時間を調節することで310nmの場合には500mJ/cm2（50.60秒），または270nmの場合には2mJ/cm2（3.4.5秒）を得た．3.生細胞数の測定LECを96wellplate（CORNING,NY,USA）に3×104cells/ml（100μl/well）となるよう播種し，80％コンフルエントまで培養した後，低血清培地〔0.2％FBS，100u/mlpenicillin,100μg/mlstreptmycin,2.5μg/mlamphoterisinBを含むD-MEM/F-12〕100μl/wellに交換し，24時間培養して実験に用いた．照射直前に，培地を照射に影響のないphosphatebu.ersaline（PBS，組織培養用ダルベッコPBS（.），日水製薬株式会社）に置き換えた．310nm,500mJ/cm2または270nm,2mJ/cm2を1wellごとに照射後，PBSから低血清培地に交換し，0.01.0.3mMEPC-K1（千寿製薬株式会社），ビタミンE（VE，和光純薬工業株式会社），ビタミンC（VC，和光純薬工業株式会社）またはH2Oを添加した．48時間後に培地を取り除き，生理食塩水（大塚製薬株式会社）100μl/wellを加えて洗浄後，0.1％crystalvioletエタノール溶液（和光純薬工業株式会社）50μl/wellを加え，室温で15分間放置し，生細胞（LEC）を固定，染色した．その後，crystalvioletを除去，5回水洗後，乾燥した．乾燥したwellに0.5％sodiumdodecylsulfate溶液（和光純薬工業株式会社）を100μl/well加え，マイクロプレートリーダー（Model680XR,Bio-RadLaboratories）で波長570nmの吸光度を測定した．結果は，非照射LEC生細胞数の測定値をコントロールとしたときの百分率をcellsurvival300として表示した．2504.8-OHdG免疫染色200Cellviability（％ofcontrol）GlassBottomCultureDishes（MatTekCorporation,Ashland,MA,USA）に6×104cells/2mlとなるよう細胞を播種し，80％コンフルに培養した後，310nm,500mJ/cm2または270nm,2mJ/cm2照射後，血清含有培地に交換し，0.1mMEPC-K1またはH2Oを添加した．照射6時間後に150100500非照射00.05mM0.1mM0.3mM培地を取り除き，4％paraformaldehyde（Plysciences,Warrington,PA,USA）にて30分間固定し，100μg/mlRnase（si-RNAseIII,タカラバイオ株式会社），1mMEDTA（和光純薬株式会社），0.4MNaCl（和光純薬株式会社）を含む10mMTris-HCl（pH7.4,和光純薬株式会社）を加え37℃にて60分間インキュベーション後，PBSで洗浄（2回）し，10μg/mlProteinaseK（株式会社医学生物研究所）を加える．7分後，PBSにて洗浄（2回）した．4NHClを加図2310nm，500mJ.cm2によるLEC傷害とEPC-K1添加の影響310nm，500mJ/cm2照射48時間後，生細胞数は非照射に比べ37±1％と有意に減少した（n＝5，p＜0.01）．照射直後，EPC-K10.05mM，0.1mM，0.3mM添加した場合の生細胞数の割合はそれぞれ68±5％，120±4％（p＜0.01），234±25％（p＜0.01）となった．n＝5，Mean±SE，＊＊p＜0.01.200え，7分後50mMTris-HClbu.erを加えpH7.5に調整した．5分後，PBSにて洗浄（2回），anti-8-OHdG（日油株式会社）/PBS（1：50）を添加し7），60分後，PBSにて洗浄（2回），二次抗体としてAlexa568conjugatedgoatanti-mouseIgG（invitrogen,probes.invitrogen.com,Eugene,OR,USA）/PBS（1：200）を添加した．20分後，PBSで洗浄（2回），核染色のためにHoechst33342（invitrogen,probes.Cellviability（％ofcontrol）150100500invitrogen.com,Eugene,OR,USA）/PBS（1：500）を加え，非照射00.05mM0.1mM0.3mM斜光して15分，PBSで洗浄（2回）し，Fluoromount（Dia-gnositicBiosystem,Pleasanton,CA,USA）を添加し，共焦点レーザー顕微鏡（NikonA1si,株式会社ニコン）にてLECを撮影し，8-OHdG免疫染色陽性細胞（赤色），核染色（青色）により全細胞数をカウントし，プレパラートごとに全細胞数に対する8-OHdG陽性細胞数の割合を測定した．5.統計学的処理2群間の比較には，Student’st-test検定を用い，非照射群との比較にはrepeatedmeasurementANOVA（analysisofvariance）を用いた．有意確率5％未満を有意とした．数値は平均値±標準偏差で示した．II結果1.310nm,500mJ.cm2によるLEC傷害とEPC-K1添加の影響310nm,500mJ/cm2照射48時間後の生細胞数は非照射の場合と比べ37±1％と有意に減少した（n＝5,p＜0.01）．310nm,500mJ/cm2照射による生細胞数の減少（37±1％）に対するEPC-K1の影響を検討した．照射直後，EPC-K10.05mM，0.1mM，0.3mM添加した場合の生細胞数の割合はそれぞれ68±5％，120±4％（p＜0.01），234±25％（p＜0.01）となり，EPC-K10.1mM，0.3mM添加により，照射により図3270nm，2mJ.cm2照射によるLEC傷害とEPC-K1添加の影響270nm，2mJ/cm2照射48時間後，生細胞数は非照射に比べ59±9％と有意に減少した（n＝5，p＜0.01）．照射直後，EPC-K10.01mM，0.05mM，0.1mM，0.3mM添加した．EPC-K10.1mM，0.3mM添加により，照射により減少した生細胞数が有意に増加した．n＝5，Mean±SE，＊＊：p＜0.01.減少した生細胞数が有意に増加した（図2）．2.270nm,2mJ.cm2照射によるLEC傷害とEPC-K1添加の影響270nm,2mJ/cm2照射48時間後の生細胞数は非照射の場合と比べ59±9％と有意に減少した（n＝5,p＜0.01）．270nm,2mJ/cm2照射による生細胞数の減少（59±9％）に対するEPC-K1の影響を検討した．照射直後，EPC-K10.01mM,0.05mM，0.1mM，0.3mM添加した場合の生細胞割合はそれぞれ66±8％，62±6％，102±10％（n＝5,p＜0.01），161±21％（n＝5,p＜0.01）となり，EPC-K10.1mM，0.3mM添加により，照射により減少した生細胞数が有意に増加した（図3）．3.紫外線照射によるLEC傷害とVC,VEまたは同時添加の影響310nm,500mJ/cm2または270nm,2mJ/cm2照射48時（131）あたらしい眼科Vol.29，No.2，2012279表1310nm（500mJ/cm2）または270nm（2mJ/cm2）照射によるLEC傷害に対するVC，VEまたはVC＋VE同時添加の影響添加量VCVEVC＋VE310nm照射053±5％53±5％53±5％310nm照射0.05mM56±6％55±12％310nm照射0.1mM57±8％56±11％53±8％310nm照射0.3mM53±14％54±10％270nm照射043±7％43±7％43±7％270nm照射0.05mM55±18％47±11％270nm照射0.1mM50±9％48±5％55±7％270nm照射0.3mM50±4％56±6％値は非照射LEC生細胞数に対する百分率で示した．310nm（500mJ/cm2）照射により，LEC生細胞数は43±7％に，270nm（2mJ/cm2）照射により53±5％と有意に減少した（p＜0.001）．VC,VEまたはVC＋VE同時添加による生細胞数の変化はなかった．Mean±SE.n＝5.間後の生細胞数は非照射の場合と比べ43±7％，53±5％と有意に減少した（n＝5,p＜0.01）．照射直後にVC（0.05mM,0.1mM,0.3mM）またはVE（0.05mM,0.1mM,0.3mM）を添加したが，生細胞数は回復しなかった．0.1mMVCと0.1mMVEを同時に添加しても影響はなかった（表1）．4.紫外線照射によるLEC酸化ストレスの変化とEPC-K1添加の影響紫外線照射6時間後のDNA酸化ストレスマーカーである8-OHdG染色の結果を示した（図4）．非照射LECは核が青色に染まり（A），310nm,500mJ/cm2照射では8-OHdG染色陽性LECの他に8-OHdGが核外へ漏れ出ていた（B）．310nm,500mJ/cm2照射直後の0.1mMEPC-K1添加によりこの傾向は抑制された（C）．270nm,2mJ/cm2照射によりほとんどのLECは8-OHdG染色陽性となった．いくつかのLECでは8-OHdGが核の外へ漏れ出ていた（D）．270nm,2mJ/cm2照射直後の0.1mMEPC-K1添加により8-OHdG染色陽性細胞は減少した（E）．8-OHdG陽性細胞の割合は非照射LEC（8±5％）に比べ310nm,500mJ/cm2または270nm,2mJ/cm2照射により67±7％，77±5％と有意に増加し（p＜0.01,n＝5），0.1mMEPC-K1添加によりそれぞれ37±5％，23±2％と有意に抑制された（p＜0.01,n＝5）．III考按EPC-K1は270nmまたは310nm照射により誘導されるLEC傷害を抑制することが明らかとなった．今回の実験では照射直後に培地にEPC-K1を添加した．抗酸化物の多くは酸化ストレス処理の前に投与されることが多いが，EPC-K1は310nmより短い波長を吸収するので，LECに対する照射量に影響する可能性があるため，照射前には培地に添加非照射310nm310nm270nm270nmEPC-K1EPC-K1図4紫外線照射によるLEC酸化ストレスの変化とEPC-K1添加の影響紫外線照射6時間後8-OHdG免疫染色（赤色）の結果を示した．核は青色で表示した．A：非照射LEC，B：310nm（500mJ/cm2）照射，C：310nm（500mJ/cm2）照射直後に0.1mMEPC-K1を添加，D：270nm（2mJ/cm2）照射，E：270nm（2mJ/cm2）照射直後に0.1mMEPC-K1を添加．F：プレパラートごとの8-OHdG陽性細胞数の割合を算出した．n＝5,Mean±SE，＊＊：p＜0.01vs非照射．##：p＜0.01vs310nmor270nm照射．しなかった．しかし，照射後の添加でも効果のあることが明らかとなった．照射後より光増感作用を有する蛋白質が紫外線を吸収した後に，そのエネルギーを基底状態の酸素に渡し，ROSを形成し，連鎖的な細胞傷害を起こす17,18）．この過程をEPC-K1が抑制したためと推測している．脂溶性ビタミン：VEは細胞膜に存在し，細胞傷害を招く連鎖的膜脂質過酸化反応を遮断し，自らがラジカルを受け取り，細胞外に存在する水溶性ビタミン：VCにラジカルを与え，自らは基底状態に戻り，ラジカルは細胞外へ排泄される19）．細胞内でこのような役割をもつVEとVCを併せ持つEPC-K1の生体内での代謝は明らかではないが，中脳動脈一過性虚血ラット神経細胞のDNA傷害抑制効果20），脳局所虚血傷害モデルでは脂質過酸化反応抑制21）や虚血-再灌流による急性腎傷害抑制効果22）のあることから組織へ速やかに取り込まれ抗酸化物として作用することが推測される．同様に，今回の細胞培養実験でも水溶性であるEPC-K1は速やかにLECに取り込まれ，紫外線照射により生じたラジカル連鎖反応を抑制したと考えられる．Invitro実験では脂溶性であるVEはLECに到達することは非常にむずかしく，溶媒を用いることが多い．今回の実験では条件を一定としたために，溶媒を用いなかった．また，水溶性であるVCを併用しても効果がなかったのは，細胞膜内外でのVEとVC濃度バランスが釣り合わず，ラジカルが速やかに細胞外へ排泄されなかったことが原因と考えられる．8-OHdG免疫染色は270nm照射でも増加したことから，紫外線照射によるLEC傷害にはDNA傷害だけでなく酸化ストレスが関与していることが考えられ，EPC-K1はこれを抑制した．紫外線照射によりLECではb-crystallin6）やNADPH-oxidase23）を介してROSが生じ，deoxiguanosineと反応して8-OHdGになる24）．8-OHdGは蛋白質の産生や分化・誘導に異常を生じ，白内障の一因となる可能性がある．EPC-K1は紫外線照射により増加する8-OHdGを照射後の添加により抑制したことより，EPC-K1は細胞内でROSを消去していることが明らかとなった．今回の結果では照射6時間後に8-OHdGは270nm照射に比べ310nm照射により核外に流出していた．細胞膜や核膜には310nm照射エネルギーにより励起される蛋白質が存在し，270nm照射よりもより多くのROSが生じ，連鎖的膜脂質過酸化反応の結果かもしれない．白内障水晶体から発見された2-ammonio-6-（3-oxidopyridinium-1-yl）hexanoate（OP-lysine）はpH7で214,249,320nmに吸収のピークをもつ蛋白質である25）．今回用いたLECにOP-lysineが存在するかは明らかではないが，310nm照射により励起する可能性は高く，270nm照射よりも速く光化学反応が惹起されたと考えられる．庄子らはUV-B照射によるLEC中DNA傷害（ストランドブレイク）にはFenton反応が関与していると報告している26）．EPC-K1はCu2＋やFe2＋のキレート剤としてFenton反応を抑制する27）作用もあることから，今回の実験では8-OHdG生成を阻害するだけでなく，DNAストランドブレイクを制御し，LEC傷害を抑制する可能性もあることが示唆された．本来，紫外線による水晶体DNA傷害はDNA修復機構により修復される28）が，修復能を上回る傷害が生じた場合，または細胞内抗酸化物質または酵素活性を上回る酸化ストレスが生じた場合に細胞傷害，消失，構造変化が生じ，皮質混濁，白内障へと進展する．以上の結果から，EPC-K1は水晶体の紫外線傷害を抑制する可能性が示唆された．しかし，0.3mMEPC-K1添加ではLEC細胞数が非照射より増加していたことから，EPC-K1の作用機序についてはさらなる検討が必要と考えられる．謝辞：本研究をお手伝いいただいた小澤江美さんにお礼申し上げます．文献1）TaylorHR,WestSK,RosenthalFSetal：E.ectofultra-violetradiationoncataractformation.NEnglJMed31：1429-1433,19882）SpectorA,GarnerWH：Hydrogenperoxideandhumancataract.ExpEyeRes33：673-681,19813）MuranovKO,MaloletkinaOI,PolianskyNBetal：Mecha-nismofaggregationofUV-irradiatedbL-crystallin.ExpEyeRes92：76-86,20114）BoettnerA,WolterJR：Transmissionoftheocularmedia.InvestOphthalmol1：776-783,19625）HightowerKR,ReddanJR,McCreadyJPetal：Lensepi-thelium：AprimarytargetofUVBirradiation.ExpEyeRes59：557-564,19946）AndleyUP,ClarkBA：Thee.ectsofnear-UVradiationonhumanlensb-crystallins：proteinstructuralchangesandproductionofO2.andH2O2．PhotochemPhotoboil50：97-105,19897）FreemanBA,CrapoJD：Biologyofdisease：freeradicalsandtissueinjury.LabInvest47：412-426,19828）ChowCK,TappelAL：Anenzymaticprotectivemecha-nismagainstlipidperoxidationdamagetolungsofozone-exposedrats.Lipids7：518-524,19729）LeeYA,ChoEJ,YokozawaT：Protectivee.ectofper-simmon（Diospyroskaki）peelproanthocyanidinagainstoxidativedamageunderH2O2-inducedcellularsenes-cence.BiolPharmBull31：1265-1269,200810）ZhangY,OuYangS,ZhangLetal：Oxygen-inducedchangesinmitochondrialDNAandDNArepairenzymesinagingratlens.MechAgeingDev131：666-673,201011）GrageCG,ShigenagaMK,ParkJWetal：Oxidativedam-agetoDANduringaging：8-hydroxy-2￠-deoxyguanosineinratorganDNAandurine.ProcNatlAcadSciUSA87：4533-4537,199012）HamiltonML,VanRemmenH,DrakeJAetal：Doesoxi-dativedamagetoDNAincreasewithage?ProcNatlAcadSciUSA98：10469-10474,200113）WeiT,ChenC,LiFetal：AntioxidantpropertiesofEPC-K1：astudyonmechanisms.BiophysChem77：153-160,199914）UedaT,UedaT,ArmstrongD：Preventivee.ectofnatu-ralandsyntheticantioxidantsonlipidperoxidationinthemammalianeye.OphthalmalRes28：184-192,199615）KuribayashiY,YoshidaK,SakaueTetal：Invitrostud-iesonthein.uenceofL-ascorbicacid2-［3,4-dihydro-2,（133）あたらしい眼科Vol.29，No.2，20122815,7,8-tetramethyl-2-（4,8,12-trimethyltridecyl）-2H-l-benzopyran-6-yl-hydrogenphosphate］potassiumsaltonlipidperoxidationandphospholipaseA2activity.Arzneim-ittelforschung42：1072-1074,199216）GallagherPE,WeissRB,BrentTPetal：WeavelengthdependenceofDNAincisionbyahumanultravioletendo-nuclease.PhotochemPhotobiol49：363-367,198917）FooteCS：Photoxidationofbiologicalmodelcompounds.OxygenandOxy-RadicalsinChemistryandBiology（edbyRodgersMAJ,PowersEL）,p425-439,AcademicPress,NewYork,198118）FooteCS：De.nitionofTypeIandTypeIIphotosensi-tizedoxidation.PhotochemPhtobiol54：659,199119）NikiE,NoguchiN,TsuchihashiHetal：InteractionamongvitaminC,vitaminE,andb-carotene.AmJClinNutr62：1322S-1326S,199520）ZhangWR,HayashiT,SasakiCetal：Attenuationofoxi-dativeDNAdamagewithanovelantioxidantEPC-K1inratbrainneuronalcellsaftertransientmiddlecerebralarteyocclusion.NeurolRes23：676-680,200121）KatoN,YanakaK,NagaseSetal：TheantioxidantEPC-K1amelioratesbraininjurybyinhibitinglipidperoxida-tioninaratmodeloftransientfocalcerebralischaemia.ActaNeurochir145：489-493,200322）YamamotoS,HagiwaraS,HidakaSetal：Theantioxi-dantEPC-K1attenuatesrenalischemia-reperfusioninju-ryinaratmodel.AmJNephrol33：485-490,201123）YaoJ,LiuY,WangXetal：UVBradiationinduceshumanlensepithelialcellmigrationviaNADPHoxidase-mediatedgenerationofreactiveoxygenspeciesandup-regulationofmatrixmetalloproteinases.IntJMolMed24：153-159,200924）KasaiH,NishimuraS：Hydroxylationofguanineinnucle-osidesandDNAattheC-8positionbyheatedglucoseandoxygenradical-formingagents.EnvironHealthPer-spect67：111-116,198625）ArgirovOK,LinB,OrtwerthBJ：2-Ammonio-6-（3-oxi-dopyridinium-1-yl）hexanoate（OP-lysine）isanewlyidenti.edadvancedglycationendproductincataractousandagedhumanlenses.JBiolChem279：6487-6495,200426）庄子英一：紫外線が水晶体上皮細胞DNAに与える影響およびその機序．日眼会誌101：40-45,199727）TomitaR,KashimaM,TsujimotoY：CharacterizationoftheactivityofL-ascorbicacid2-［3,4-dihydro-2,5,7,8-tetramethyl-2-（4,8,12-trimethyltridecyl）-2H-benzopy-ran-6-yl-hydrogenphosphate］potassiumsaltinhydroxylradicalelimination.ChemPharmBull48：330-333,200028）AndleyUP,SongX,MitchellDL：DNArepairandsur-vivalinhumanlensepithelialcellswithextendedlifespan.CurrEyeRes18：224-230,1999＊＊＊
Nd-YAG レーザー照射による穿孔外傷ラット白内障モデルの創傷治癒メカニズムの検討
2010年11月30日 火曜日0910-1810/10/\100/頁/JCOPY（125）1607《原著》あたらしい眼科27（11）：1607.1612，2010cはじめに白内障の予防，治療のためにさまざまな白内障動物実験モデルが研究されている．これまで実験モデルには，酸化障害，代謝障害，水晶体膜機能障害，放射線照射，外傷モデルなど多数報告されている1）．マウスやラットを用いた穿孔性外傷白内障モデルも白内障研究のために使用され，針刺入やNd-YAGレーザー照射により水晶体前.を破.させると，組織学的には水晶体線維細胞群（もしくは水晶体皮質）が前面に突出した後に水晶体上皮細胞が著しく増殖，重層化して損傷部を被覆することが報告2～10）されている．しかしNd-YAGレーザー穿孔外傷白内障モデルを用いた創傷治癒過程での免疫組織学的検討および細隙灯顕微鏡による前眼部所見の経時的な変化を併せて観察した報告は見当たらない．今回筆者らは，Nd-YAGレーザー照射によるラット外傷白内障モデルを作製して，白内障水晶体の経時的変化と創傷治癒メカニズムの免疫組織学的な検討を行った．〔別刷請求先〕綿引聡：〒321-0293栃木県下都賀郡壬生町北小林880獨協医科大学眼科学教室Reprintrequests：SatoshiWatabiki,M.D.,DepartmentofOphthalmology,DokkyoMedicalUniversity,880Kitakobayashi,Mibumachi,Shimotsuga-gun,Tochigi321-0293,JAPANNd-YAGレーザー照射による穿孔外傷ラット白内障モデルの創傷治癒メカニズムの検討綿引聡＊1松島博之＊1向井公一郎＊1寺内渉＊1妹尾正＊1小原喜隆＊2＊1獨協医科大学眼科学教室＊2国際医療福祉大学MechanismsofWoundHealinginExperimentalCataractModelInducedbyNeodymium-YAGLaserSatoshiWatabiki1）,HiroyukiMatsushima1）,KoichiroMukai1）,WataruTerauchi1）,TadashiSenoo1）andYoshitakaObara2）1）DepartmentofOphthalmology，DokkyoMedicalUniversity,2）InternationalUniversityofHealthandWelfareSprague-Dawleyラットを用い，Nd-YAGレーザー照射により水晶体前.を切開し，可逆性の外傷白内障モデルを作製した．この水晶体の混濁変化を細隙灯顕微鏡で経時的（2,4,7,14日後）に観察し，組織学的に解析することで創傷治癒メカニズムの解明を試みた．細隙灯で観察すると，前.下混濁がレーザー照射2日後にピークに達し，その後徐々に減少した．組織学的に解析すると，創傷部位で水晶体上皮細胞が増殖，重層化して破.部が被覆され，水晶体線維細胞に形態変化した．免疫組織染色を行うと，創傷部位に一致してPCNA（proliferatingcellnuclearantigen），抗Hsp70（heatshockprotein70）抗体，抗細胞骨格蛋白質抗体に陽性であった．Nd-YAGレーザー穿孔外傷白内障モデルの混濁減少と創傷治癒は，ストレス蛋白質と細胞骨格蛋白質が関与する可能性が示唆された．TheanteriorcapsuleoftheSprague-DawleyratlenswasinjuredusingNd-YAGlasertoobservethereversibletraumaticcataractmodel.Afterthecataractgradewasobservedattheselectedtimeperiods（2,4,7and14days）viaslitlamp,histologicalanalysiswasperformed.Cataractgradepeakedafter2days,thenimmediatelydecreased.Histologicalanalysisdisclosedproliferationandstratificationoflensepithelialcells（LEC）aroundtherupturedcapsule.TheproliferatingLECbegantoelongateaftertheyhadcoveredtherupturedcapsule.TheproliferatedLECreactedtoantibodiesincludedwithPCNA（proliferatingcellnuclearantigen）,Hsp70（heatshockprotein70）andvimentin.TheresultssuggestthatwoundhealingintheNd-YAGlasercataractmodeliscontrolledwithheatshockproteinandcytoskeletalprotein.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）27（11）：1607.1612,2010〕Keywords：白内障，Nd-YAGレーザー，創傷治癒，水晶体上皮細胞，細胞骨格蛋白質．cataract,Nd-YAGlaser,woundhealing,lensepithelialcells,cytoskeletalprotein.1608あたらしい眼科Vol.27，No.11，2010（126）I実験方法1.Nd-YAGレーザー外傷白内障モデルの前眼部観察実験には生後14日齢のSprague-Dawley（SD）ラット3匹6眼を使用した．ラットの実験に関しては，動物実験の飼養および保管に対する基準（NationalInstitutesofHealthGuidelinesontheCareandUseofLaboratoryAnimalsinResearchおよびARVO（TheAssociationforResearchinVisionandOphthalmology）StatementfortheUseofAnimalsinOphthalmicandVisionResearch）に基づいて行った．SDラットを散瞳した後，Nd-YAGレーザー（Aura，日本ルミナス）を水晶体前.中央部に照射して前.を切開した（設定条件：1.5mJ×4-5shots，切開の大きさ直径約500μm）．前.を切開してから，2日後，4日後，7日後，14日後に細隙灯顕微鏡カメラ（SC-6，Kowa）を用いて前眼部を観察，撮影した．撮影した徹照像から，混濁なしをグレード0とし，後.面が透見できる軽度の混濁をグレード1，混濁面積が全水晶体面積の30％以下の場合をグレード2，混濁面積が全水晶体面積の30％以上の場合をグレード3として，水晶体の混濁状態を4段階にグレード分類して経時的変化を解析した．2.組織学的検討Nd-YAGレーザーでSDラット9匹18眼を前.切開してから，2日後，7日後，14日後に眼球摘出して，摘出眼をカルノア固定液に4時間浸漬固定した．パラフィン包埋した後に4μmで薄切してパラフィン組織切片を作製した．切片は，ヘマトキシリン・エオジン（HE）染色または免疫組織染色した．免疫組織染色は，切片を3％過酸化水素によって内因性ペルオキシダーゼ処理を20分間行った後にストレプトアビジン-ビオチン（SAB）法により免疫組織染色をヒストファインSAB-PO（M）キットR（ニチレイ）を用いて行い，発色には3,3￠-ジアミノベンチジンを用いた．これらの組織学的変化は光学顕微鏡（BX51，OLYMPUS）を用いて観察した．一次抗体として，proliferatingcellnuclearantigen（PCNA，ニチレイ），heatshockprotein70（Hsp70，Stressgen），ビメンチン（Sigma）の3種類を用いた．II結果1.Nd-YAGレーザー外傷白内障モデルの前眼部観察（図1）Nd-YAGレーザー照射直後から混濁および皮質の一部が前房内に認められた．2日後に水晶体.および破.部皮質付近の混濁はピークに達した．4日，7日と徐々に混濁は減少し，14日後ではほぼ透明となった．白内障のグレードを4段階に程度分類すると（図2），レーザー照射2日後に高度混濁状態であるグレード2.5±0.5に達するが，以降徐々に混濁は減少して4日後ではグレード1.75±0.75，7日後ではグレード1.25±0.5，14日後ではグレード0.75±0.25に減少した．2.組織学的検討図3にNd-YAGレーザーを照射した水晶体前極部の破.部付近のHE染色の結果を示す．前眼部徹照像で混濁がグレード3まで増加したレーザー照射2日後での組織像は，破.部位で水晶体上皮細胞の増殖および伸展がみられた．混濁がグレード1に減少した7日後で，水晶体.は破.したままで2日後4日後7日後14日後図1Nd-YAGレーザーを照射したSDラット前眼部徹照像Nd-YAGレーザー照射2日後，4日後，7日後および14日後のSDラットの前眼部徹照像を示す．レーザー照射直後から混濁が生じ，2日後に混濁はピークに達するが，それ以降徐々に減少している．黒点は前房中に飛散した水晶体皮質の一部．247経過日数グレード143210図2白内障グレード分類X軸にレーザー照射後の経過日数，Y軸に混濁のグレード分類を示す（n＝6）．2日後に混濁がピークとなり，その後徐々に減少した．（127）あたらしい眼科Vol.27，No.11，201016092日後7日後14日後図3Nd-YAGレーザー照射群前.部―HE染色上段はNd-YAGレーザー照射したラット水晶体前極部の破.部付近の低倍率，下段は破.部付近の高倍率の組織写真を示す（Bar＝100μm）．レーザー照射により前.部が破.し，破.したところから水晶体上皮細胞が増殖および伸展している．7日後で前.は破.したままだが，上皮細胞は破.部分の皮質を覆って重層化している．14日後では重層化した細胞の層は薄くなっており，上皮細胞が水晶体線維細胞に形態変化している．2日後7日後14日後図4Nd-YAGレーザー照射群前.部―免疫組織染色（PCNA）Nd-YAGレーザー照射部付近における抗PCNA抗体を使用した免疫組織染色の結果を示す（Bar＝100μm）．矢印は抗PCNA抗体反応陽性の部分を示す．2日後の破.部付近の水晶体上皮細胞の細胞核に，7日後では重層化した上皮細胞の表層と深層の細胞核に，14日後では表層の細胞核および水晶体線維細胞様に形態変化しつつある細胞の細胞核に陽性所見がみられる．2日後7日後14日後図5Nd-YAGレーザー照射群前.部―免疫組織染色（Hsp70）抗Hsp70抗体を使用した免疫組織染色の結果を示す（Bar＝100μm）．矢印は抗Hsp70抗体反応陽性の部分を示す．特に2日後での破.した前.直下の水晶体線維細胞の細胞質に陽性所見がみられる．1610あたらしい眼科Vol.27，No.11，2010（128）はあるが，増殖した水晶体上皮細胞が損傷部の皮質を覆って重層化していた．重層化した上皮細胞はHE染色より扁平化を呈している．混濁がグレード1以下に減少した14日後では，重層化した細胞の層は菲薄化し，立方状の上皮形態を呈している．上皮下の皮質付近は無核の水晶体線維細胞の形態を認めた．免疫組織染色を行うと，PCNAは2日後の破.部付近の水晶体上皮細胞の細胞核，7日後では重層化した上皮細胞の表層と深層にある細胞核，14日後では表層の細胞核と水晶体線維細胞様に形態変化しつつある細胞の細胞核に陽性所見がみられた（図4）．Hsp70は2日後では破.した前.直下の水晶体線維細胞の細胞質，7日後では重層化した上皮細胞直下の線維細胞の細胞質，14日後には上皮細胞が水晶体線維細胞様に形態変化しているとみられる細胞の細胞質に陽性所見がみられた（図5）．ビメンチンは，すべての時期で増殖，重層化した水晶体上皮細胞の細胞質で陽性であった（図6）．III考按穿孔性外傷白内障モデルはラット，ウサギやマウスの水晶体.に針2～4）やNd-YAGレーザー5～10）で穿孔することで再現性のよい白内障が発症するモデルである．水晶体前.を破.させると，水晶体線維細胞群（もしくは水晶体皮質）が前面に突出した後に水晶体上皮細胞が著しく増殖，重層化して損傷部を被覆する2～10）．Nd-YAGレーザーの発振波長は1,064nmの近赤外領域であり，イオン化したガスのプラズマの発生により，組織を加熱せずに照射部位を機械的に破壊する11）．そのためNd-YAGレーザー照射による前.切開は，針刺入による経角膜的な方法とは異なり，水晶体以外の眼組織への影響を最小限に留めて12,13）白内障を生じさせることが可能である．岡本ら8～10）はSDラットNd-YAGレーザー白内障モデルの水晶体を摘出して実体顕微鏡下で混濁変化を観察しており，レーザー照射14日後まで混濁が増強したと報告している．Gonaら7）はレーザー照射15日で水晶体損傷部の瘢痕は残存するものの，肉眼的な観察で混濁は消失していたと報告している．今回筆者らは，過去の報告10,12）を基に水晶体前.中央部にレーザーを照射し，前.および皮質表層を中心に創傷の修復経過を観察した．レーザー照射14日後まで細隙灯顕微鏡を用いて経時的に水晶体の混濁を観察したところ，一過性に増加した後に減少していた．外傷白内障モデルの組織学的解析はこれまでも行われており，筆者らの観察でも早期の水晶体前面の混濁時期に，混濁部位に一致した前.破.部での水晶体上皮細胞の著しい増殖を認めた．その後，増殖した水晶体上皮細胞が重層化して損傷部を被覆するという，過去の報告2～10）と同様の組織修復行程がみられた．筆者らの観察ではさらに，水晶体混濁の減少に伴い，重層化していた水晶体上皮細胞が菲薄化して水晶体線維細胞に形態変化していくことが観察できた．過去には3H-サイミジンオートラジオグラフィー法8,10）を用いて外傷白内障モデルの破壊部位別（前.，赤道部，後.破壊）の水晶体上皮細胞の増殖能を観察し，水晶体増殖帯以外の各破壊部位でも水晶体上皮細胞の増殖が認められたと報告されている．筆者らは，抗PCNA抗体を用いた免疫組織染色法14～16）を用いて経時的に増殖能の観察を行った．その結果，修復過程で重層化した上皮細胞の細胞核や，菲薄化して水晶体線維細胞様に形態変化している細胞の細胞核にPCNAの発現がみられ，免疫組織学的手法でも水晶体増殖帯ではなく前.損傷部付近での水晶体上皮細胞の増殖を確認できた．ストレス反応時に産生される分子シャペロンHsp7017）の発現が重層化した上皮細胞直下の水晶体線維細胞や，水晶体線維芽細胞に形態変化している細胞にみられることから，水晶体前.が損傷されると，破.部位でストレス反応が生じて水晶体上皮細胞の増殖能が亢進することが示唆された．同様のストレス反応は穿刺性外傷モデルでも擦過によりひき起こされる可能性があるが，これらのストレス反応による分子シャペロンの報告はなく，今後両モデルにおいて比較検討する必要がある．細胞骨格蛋白質はラット亜セレン酸白内障モデルを用いた実験から，水晶体の透明性維持に関連することが報告18～20）されている．2日後7日後14日後図6Nd-YAGレーザー照射群前.部―免疫組織染色（ビメンチン）抗ビメンチン抗体を使用した免疫組織染色の結果を示す（Bar＝100μm）．矢印は抗ビメンチン抗体反応陽性の部分を示す．水晶体上皮細胞の増殖，重層化に伴って陽性反応がみられ，特に7日後の上皮細胞が重層化している部位で強い陽性反応がみられる．（129）あたらしい眼科Vol.27，No.11，20101611Wisterラットでは可逆性の白内障が発生し，透明治癒過程に細胞骨格蛋白質が発現している20）．今回，外傷後の創傷治癒反応の部位に一致して細胞骨格蛋白質であるビメンチン発現の増強が免疫組織学的に認められた．これらの強陽性の不均一な蛋白質の確認は，蛋白質が凝集した可能性があることが示唆される．外傷白内障においても組織修復過程に細胞骨格蛋白質が関連している可能性がある．混濁の再透明化については，マウス外傷白内障モデルで，創傷後水晶体線維が再生することで混濁水晶体が再透明化したと報告している21）．今後14日以降の変化を観察する必要がある．以上の考察より，Nd-YAGレーザー白内障モデルの混濁出現および減少についての機序を推察した（図7）．通常の水晶体では増殖帯周辺部の水晶体上皮細胞のみが増殖，分裂をくり返し，赤道部に移動して水晶体線維細胞へと分化する．しかし，Nd-YAGレーザー照射により水晶体前.が破.すると創傷治癒反応としてストレス応答が生じ，増殖帯ではなく前.損傷部周辺での水晶体上皮細胞の増殖能亢進と，ビメンチンを含んだ細胞骨格蛋白質の発現の増強が生じる．この損傷部周辺での水晶体上皮細胞の増殖，重層化が生じることで水晶体が混濁する．しかし，水晶体上皮細胞層により損傷部が被覆されると，水晶体上皮細胞の重層化が抑制され，次第に細胞層が菲薄化して水晶体線維細胞に形態変化し，水晶体線維を再生することで混濁が減少すると考えた．しかしながら，水晶体混濁減少と再生の機序は水晶体上皮細胞が産生する基底膜やコラーゲン，細胞が前房内の前房水やマクロファージなどの貪食細胞による影響が関与している可能性があり，今後長期間のさらなる検討が必要である．本稿の要旨は第47回日本白内障学会において発表した．本研究のためにご指導を頂いたニュービジョン眼科研究所石井康雄先生に感謝の意を表します．文献1）岩田修造：水晶体その生化学的機構．p311-360，メディカル葵出版，19862）FagerholmPP,PhilipsonBT：Experimentaltraumaticcataract.I.Aquantitativemicroradiographicstudy.InvestOphthalmolVisSci18：1151-1159,19793）UgaS：Woundhealinginthemouselens.ExpEyeRes32：175-186,19814）雑賀司珠也：後発白内障でのTGFbシグナル伝達．日本白内障学会誌16：41-44,20045）CampbellCJ,RittlerMC,InnisREetal：Oculareffectsproducedbyexperimentallasers.III.Neodymiumlaser.AmJOphthalmol66：614-632,19686）PauH,WeberU,KernWetal：LesionandregenerationoftheanteriorandposteriorlenscapsuleandcortexinrabbitsNd：YAGlaser.GraefesArchClinExpOphthalmol227：392-400,19897）GonaO,WhiteJH,ObenauerL：Woundhealingbytheratlensafterneodymium-YAGlaserinjury.ExpEyeRes40：251-261,19858）岡本庄之助，照林宏文，堤元信ほか：Nd-YAGレーザー照射による白内障モデル─1.照射部位による上皮細胞増殖能と進展形式の変化─．眼紀42：1863-1868,19919）照林宏文，岡本庄之助，池部均ほか：QスイッチNd-YAGレーザー照射による白内障モデル─2.照射部位による白内障進展形式の差異─．日眼会誌96：440-446,199210）照林宏文，岡本庄之助，池部均ほか：QスイッチNd-YAGレーザー照射による白内障モデル─3.照射部位による上皮細胞増殖能の変化─．眼紀43：679-687,199211）Aron-RosaD,GriesemannJC,AronJJ：Useofpulsedneodymiumyaglaser（picosecond）toopentheposteriorlenscapsuleintraumaticcataract：Apreliminaryreport.OphthalmicSurg12：496-499,198112）矢部京子：Nd-YAGレーザーによる水晶体前.切開について─基礎実験および臨床成績─．埼玉医科大学雑誌13：131-138,198613）余敏子：パルス型Nd-YAGレーザー照射の網脈絡膜に対……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………図7仮説：混濁水晶体の再透明化Nd-YAGレーザー照射により前.が破.すると，創傷治癒反応として損傷部周辺での細胞増殖因子や細胞骨格蛋白質，熱ショック蛋白質の発現が増強して水晶体上皮細胞の異所性増殖が生じ，上皮細胞が重層化することで水晶体混濁が生じる．しかし，損傷部を被覆した後に水晶体上皮細胞の重層化が調節されて細胞層が菲薄化し，水晶体線維細胞様に形態変化することで混濁部位の再透明化を生じる．1612あたらしい眼科Vol.27，No.11，2010（130）する影響．特に硝子体内照射時の傷害について．埼玉医科大学雑誌12：267-275,198514）加藤良平：免疫組織化学を用いた細胞増殖能の解析．組織細胞化学，p47-50，学際企画，199415）山口慶子，庄司昭世，加藤圭一ほか：ProliferatingCellNuclearAntigenによるラット水晶体上皮細胞増殖能の検討．あたらしい眼科8：1935-1938,199116）久保江理，高柳克典，都筑昌哉ほか：抗PCNA免疫組織化学法による水晶体上皮細胞の増殖動態の研究．あたらしい眼科12：1745-1749,199517）永田和宏：ストレス蛋白質─基礎と臨床─．p100-114，中外医学社，199418）MatsushimaH,DavidLL,HiraokaTetal：Lossofcytoskeletalproteinsandlenscellopacificationintheselenitecataractmodel.ExpEyeRes64：387-395,199719）松島博之：白内障・後発白内障と細胞骨格蛋白質─分子生物学的解析─．日本白内障学会誌15：5-20,200320）松島博之，向井公一郎，小原喜隆ほか：亜セレン酸白内障モデルにおける水晶体混濁減少に関する蛋白質の変動．日眼会誌104：377-383,200021）HirayamaS,WakasugiA,MoritaTetal：Repairandreconstructionofthemouselensafterperforatinginjury.JpnJOphthalmol47：338-346,2003＊＊＊