《原著》あたらしい眼科39（7）：982.987，2022cレバミピド懸濁点眼液とMPCポリマーの併用処理によるドライアイ治療効果の有用性評価後藤涼花＊1勢力諒太朗＊1渡辺彩花＊1油納美和＊1大竹裕子＊1櫻井俊輔＊2原田英治＊2長井紀章＊1＊1近畿大学薬学部製剤学研究室＊2日油株式会社ライフサイエンス事業部CEvaluationoftheCombinedTherapyofRebamipideandMPCPolymerfortheTreatmentofDryEyeRyokaGoto1）,RyotaroSeiriki1）,SayakaWatanabe1）,MiwaYuno1）,HirokoOtake1）,ShunsukeSakurai2）,EijiHarata2）CandNoriakiNagai1）1）FacultyofPharmacy,KindaiUniversity,2）LifeScienceProductsDivision,NOFCorporationC本研究では市販ドライアイ治療薬であるレバミピド懸濁点眼液（REB点眼液）と生体適合性CMPCポリマー（MPCP）を併用処理した際のドライアイに対する治癒効果について検討した．REB点眼液点眼C5分後にCMPCPを処理することで，涙液中CREB濃度の滞留性向上が確認され，そのCREB眼表面滞留時間の延長はCREB点眼液単独処理群と比較し有意に高値であった．次に，N-アセチルシステイン処理ウサギ（眼表面ムチン被覆障害モデル）を用い，REB点眼液とCMPCP併用処理時のドライアイに対する治療効果を検討したところ，併用処理により，眼表面ムチン被覆障害モデルの涙液層破壊とムチン量低下は改善され，その効果はCREB点眼液単独処理群に比べ高値であった．以上，MPCP併用により，REBの涙液中薬物滞留性が高まるとともに，ムチン被覆改善作用が向上する可能性が示唆された．CInthisstudy,weinvestigatedwhetherornotacombinationofcommerciallyavailablerebamipideophthalmicsuspension（CA-REBeye-drop）and2-methacryloyloxyethylCphosphorylcholine（MPC）polymerCprovidesCanCenhancedtherapeutice.ectfordryeye.ThecombinationofCA-REBeye-dropandMPCpolymerprolongedthedrugresidenceinthelacrimal.uid.Next,thetherapeuticpotentialofthecombinationtreatmentfordryeyewasevaluatedinanN-acetylcysteine-treatedrabbitmodel.ThecombinationofCA-REBeye-dropandMPCpolymerpromotedimprovementofboththetear.lmbreakupandlevelofdecreasedmucincausedbytheN-acetylcysteinetreatment.Moreover,thetherapeutice.ectwassigni.cantlyincreasedintherabbitsinstilledwiththecombinationofCCA-REBCeye-dropCandCMPCCpolymerCinCcomparisonCwithCtheCrabbitsCinstilledCwithCCA-REBCeye-dropCalone.CTheseresultsshowthatthecombinationofCA-REBeye-dropandMPCpolymermayprovideanenhancedthera-peutice.ectforpatientsa.ictedwithdryeye.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）39（7）：982.987,C2022〕Keywords：MPCポリマー，レバミピド，ドライアイ，眼表面，涙液．MPCpolymer,rebamipide,dryeye,ocularsurface,lacrimal.uid.Cはじめに涙液は外側から油層，水層のC2層で構成され，外側に位置する油層は内側にある水層の蒸発を抑える働きを有している1）．また，水層には角膜上皮から分泌されている糖蛋白質ムチンが分布し，このムチンが涙液を角膜表面に維持させる役割を担っている2）．これら，ムチンは分泌型ムチンと膜型ムチンのC2種類に大きく分類され，分泌型ムチンは主として涙液の水層に分布し，水分を保持する形で涙液中に混じり込むことで，眼表面で涙液を均一に伸展させる働きを担っている．一方，膜型ムチンは上皮細胞の表面にある微絨毛の先端〔別刷請求先〕長井紀章：〒577-8502東大阪市小若江C3-4-1近畿大学薬学部製剤学研究室Reprintrequests：NoriakiNagai,Ph.D.,FacultyofPharmacy,KindaiUniversity,3-4-1Kowakae,Higashi-Osaka,Osaka577-8502,CJAPANC982（128）CH3CH3CH2CCH2CCO－CH3COOCH2CH2OPOCH2CH2N＋CH3O（CH2）17CH3OCH3l図1MPCポリマーの化学構造式に存在し，糖衣を形成することで，上皮表面の水濡れ性維持に寄与すると考えられている3,4）．このようにムチンは眼表面での涙液維持に強く関与する因子であり，眼表面でのムチン量の低下はドライアイの発症に繋がる．ドライアイは涙液減少型，蒸発亢進型，涙液層破壊時間短縮型など，その機序により分類されている5）．これらの治療法としては人工涙液，ヒアルロン酸点眼液を用いた涙液の補給，涙点プラグなどによる涙液滞留量の増加，温罨法や瞼縁洗浄などが行われている6,7）．さらに近年では，角膜表面上に存在するムチンの産生を高めるレバミピド懸濁点眼液（REB点眼液，ムコスタ点眼液）やムチンの放出を促進するジクアホソルナトリウム点眼液（ジクアス点眼液）といった点眼薬が広く用いられている．これら薬物療法は有用であるが，パソコンやスマートフォンの普及からドライアイ患者数が急増しているわが国においてさらに有用なドライアイ療法の確立が望まれているのが現状である．日油株式会社により開発されたCMPCポリマーは生体適合性，保水性および保湿性に優れ，人工臓器などの医療機器の表面処理剤として開発されている．本研究に用いたCMPCポリマーは，PC構成単位，アミド構成，疎水性構成単位のC3種の構成単位を特定の割合で有する共重合体である．それぞれの構成単位におけるCPC構成単位はC2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンエチルホスファート（MPC）であり，共重合体の生体適合性，親水性に寄与する．アミド構成単位はCN,N-ジメチルアクリルアミド（DMA）であり，高分子量化させることで共重合体の眼表面での滞留性向上が，疎水性構成単位はステアリルメタクリレート（SMA）であり，共重合体の角膜表面への接着性を向上させることが期待できるポリマーである．近年筆者らは，これらCMPCポリマーがムチンと類似した水分保持作用を有することを見出すとともに，N-アセチルシステイン頻回点眼処理により作製した眼表面ムチン被覆障害ウサギモデルを用い，MPCポリマーの点眼がドライアイ治療に有用であることを報告した8）．本研究では，これらCMPCポリマーと市販ドライアイ治療薬であるCREB点眼液を併用処理した際のドライアイに対する治癒効果について，眼表面ムチン被覆障害ウサギモデルを用いて評価した．CH2CHCONCH3CH3mn涙液採取涙液採取REBREB5minMPCP＋REBMPCPREB5min5minREB＋MPCPREBMPCP10min20min30min図2本研究で実施したREBとMPCポリマーの点眼処理スケジュールI対象および方法1.使用薬物および実験動物REB点眼液は，大塚製薬から購入し，MPCポリマーは日油から譲渡されたものを用いた．図1には今回用いたCMPCポリマーの構造式を示す．また，N-アセチルシステイン溶液は和光純薬製を用い，シルメル試験紙は昭和薬品化工から購入した．涙液ムチン測定キットはコスモ・バイオから得た．その他の試薬は市販特級品あるいはCHPLC用試薬を用いた．日本白色種雄性ウサギ（2.5.3.0Ckg）は清水実験材料から購入し，近畿大学実験動物規定に従い実験を行った（実験承認番号，KAPS-31-002）．C2.薬物の点眼処理方法REB点眼前後にC0.1％CMPCポリマーを点眼し，点眼間隔はC5分，点眼量はC1回C30Cμlとした．また本研究では，MPCポリマー点眼C5分後にCREB点眼処理を行ったものをCMPCP＋REB群，REB点眼C5分後にCMPCポリマーを点眼したものをCREB＋MPCP群とした．図2にはCMPCポリマーおよびCREB点眼液併用処理時における涙液中CREB濃度を測定した際の点眼処理スケジュールを示す．C3.HPLCを用いたREB濃度の測定試料からのCREB抽出にはN,N-ジメチルホルムアミドを用い，リン酸緩衝液/アセトニトリル＝83/17（v/v）を移動相としたCHPLC法にて濃度の測定を行った．HPLC法には，InertsilODS-3を接続した高速液体クロマトグラフィー装置LabSolutions（島津製作所）を用い，カラム温度C35℃（クロマトチャンバーCCTO-20AC使用），移動相の流速はC0.25Cml/ap＝0.018bp＝0.0202.50.5REB濃度（mg/mL）2.00.4REB濃度（mg/mL）1.50.31.00.20.50.10.00.0図3MPCポリマー（MPCP）併用処理が市販REB点眼液の涙液滞留性に与える影響a：点眼処理C10分後の涙液中CREB濃度．Cb：点眼処理C30分後の涙液中CREB濃度．平均値C±標準誤差，n＝3.6.min，検出波長C254Cnm，測定時間C16分とした．試料注入量はC10Cμlとし，オートインジェクターCSIL-20ACを用いた．本研究では，REBのピークがC12.13分の間に検出された．C4.眼表面ムチン被覆障害ウサギモデルの作製雄性日本白色種ウサギにC10％CN-アセチルシステイン溶液（溶媒：生理食塩液）を午前C9時から午後C7時までC2時間間隔で計C6回（各回C50Cμl）点眼処理を施すことで眼表面ムチン被覆障害モデルを作製した．本研究では，涙液状態の安定化のため，点眼処理C2日後のウサギをドライアイC0日目として研究に用いた．C5.涙液油層の干渉像の観察興和製CDR-1Caを用い，開瞼器にてC5分間開瞼したウサギの涙液油層干渉像を撮影した．撮影は薬物点眼処理C24時間後に行い，角膜中央部にフォーカスをあて干渉像を測定した．また，得られた干渉像よりドライアイスポット（涙液が伸展せず黒色で映る部分）の面積値をCImageJにて測定し，干渉像全体の面積値（40.3CmmC2）に対する比として傷害率を算出した．さらに，点眼処理群の傷害率を点眼未処理群の傷害率で除したもの（傷害率点眼群/傷害率未点眼群×100）を涙液層破壊率（％）とした．C6.涙液中ムチン量の測定結膜.内からCSchirmer試験紙にて涙液をC5分間採取し，得られた試料に存在するムチンコア蛋白質からCO-グリカンをCb脱離すると同時に糖鎖還元末端に蛍光ラベルさせることで得られる蛍光強度を測定することで，ムチン量の定量を行い，涙液量にて除したものを涙液中ムチン濃度とした．これらムチン量の定量には涙液ムチン測定キットを用い，蛍光強度は，CORONA社製蛍光プレートリーダーCSH-9000にて測定した（励起波長C336Cnm，蛍光波長C383Cnm）．本実験における薬物処理時におけるムチン量は，未処理群の涙液中ムチン量に対する比（％）として表した．C7.統計解析得られたデータは平均値±標準誤差として表した．各々の実験値はCStudentのCt-testまたはCDunnettの多重比較検定にて解析した．本研究ではCp値がC0.05以下を有意差ありとした．CII結果1.REB点眼液およびMPCP併用処理におけるREB眼表面滞留性の変化図3はCREB点眼液およびCMPCP併用処理（単回）10分およびC30分後における正常ウサギ涙液中でのCREB挙動を示す．REB点眼液を単剤投与したCREB単独処理群の点眼C10分後における涙液中薬物濃度はC1.23Cmg/mlであり，点眼C30分後にはC0.10Cmg/mlまで低下した．また，MPCポリマー点眼C5分後にCREB点眼液を処理したCMPCP＋REB処理群の涙液中CREB濃度変化は，REB単独処理群と類似した挙動を示した．一方，REB点眼液処理C5分後にCMPCポリマーを点眼したCREB＋MPCP処理群では，眼表面でのCREB滞留性が高まり，眼表面での薬物量はCREB単独処理群のそれに比べ，点眼C10分後でC1.68倍，点眼C30分後でC2.62倍であった．C2.眼表面ムチン被覆障害ウサギモデルに対するREB点眼液およびMPCP併用処理の有用性評価図4はCREB点眼液単剤処理およびCREB点眼液とCMPCポリマー併用処理を行った際の涙液油層干渉像とその眼表面障害治癒効果を示す．10％CN-アセチルシステイン溶液処理により眼表面の涙液層を破壊したのち生理食塩水連続点眼を行ったCSaline群ではC2日目，5日目における涙液層破壊率はそれぞれC99.8％，76.2％であった．一方，REB単独処理群では，連続点眼C2日目，5日目における涙液層破壊率はそれぞれC44.7％，39.9％であった．また，MPCポリマーを前点眼したCMPCP＋REB処理群では，REB単独点眼処理群と同程度であった．一方，REB投与後にCMPCポリマーを点眼したCREB＋MPCP処理群では，REB単独処理群と比較し，有意な傷害率の低下が認められ，連続点眼C2日目の涙液層破壊率はC28.6％，5日目ではC10.3％であった．図5は眼表面ムチaSalineREBMPCP＋REBREB＋MPCP0d2d5dbcp＝0.003p＝0.0000011201201008060涙液層破壊率（％）10080604000図4市販REB点眼液とMPCポリマー（MPCP）併用処理がウサギ眼表面ムチン被覆障害モデルの角膜障害に与える影響a：連続点眼処理C2日目およびC5日目の代表的涙液油層干渉像．バーはC1Cmmを示す．Cb：連続点眼処理C2日目の涙液層破壊率．Cc：連続点眼処理C5日目の涙液層破壊率．平均値C±標準誤差，n＝3.6.Cp＝0.0002402020ap＝0.003b175175150150125100755025ムチン量（％）12510075502500図5MPCポリマー（MPCP）と市販REB点眼液併用処理がウサギ眼表面ムチン被覆障害モデルの涙液中ムチン量に与える影響a：連続点眼処理C2日目の涙液中ムチン量．Cb：連続点眼処理C5日目の涙液中ムチン量．平均値C±標準誤差，n＝3.6.ン被覆障害ウサギモデルに各点眼処理を行った際の涙液中ムで低下していた．これら眼表面ムチン被覆障害ウサギモデルチン量の変化を示す．10％CN-アセチルシステイン溶液処理にCREB単剤点眼を行ったところ，ムチン量の増加が確認さにより，涙液中ムチン量は，正常ウサギのそれの約C70％まれ，連続点眼C5日目の涙液中ムチン量は正常群と同程度であった．また，MPCP＋REB処理群においても同様のムチン量の改善が認められた．一方，REB＋MPCP点眼処理群では有意に涙液中ムチン量の向上が認められ，点眼処理C5日目のムチン量は正常群の約C140％であった．CIII考按MPCポリマーは生体適合性が高く，ムチンと類似した作用を有することから，眼表面の安定化において有用な物質である8）．本研究では正常ウサギを用い，MPCポリマーとドライアイ治療薬CREB点眼液の併用処理が，涙液中での薬物滞留性にどのような影響を及ぼすかについて検討を行った．また，眼表面ムチン被覆障害ウサギモデルを用い，これら併用処理時におけるドライアイ治癒効果について検討した．点眼後における涙液中薬物挙動を検討するうえで，評価用動物種の選択は重要である．一般的に使用される実験動物としてはマウスやラットが知られているが，これらは眼が小さく，水晶体も人と比べ非常に大きな割合を示すなど，ヒトの眼と構造が大きく異なっている．一方で，ウサギやサルは眼表面の状態や眼構造ともにヒトのそれと類似しており，眼領域の研究において多用される動物種である．とくに，ウサギはサルに比べて飼育が容易であることからも，点眼薬の薬物動態挙動を確認するうえでもっとも用いられる実験動物種である．このため本研究ではウサギを用い，REBおよびCMPCポリマー併用処理が涙液中CREBの濃度変化におよぼす影響を検討した（図3）．REB点眼液を単剤投与したところ（REB単独処理群），点眼直後から眼表面でのCREB濃度の低下が確認され，点眼C30分後の涙液中CREB濃度はC1.23Cmg/mlであった．これらCREB点眼を行ったC5分後にCMPCポリマーを追加点眼したところ（REB＋MPCP処理群），涙液中でのREB濃度の増加が確認され，そのCREB眼表面持続時間の延長はCREB単独処理群と比較し有意に高値であった．一方，点眼する順番を変更し，REB点眼の前にCMPCポリマーを処理した場合（MPCP＋REB処理群）では，REB眼表面滞留時間の延長は確認されず，MPCP＋REB処理群とCREB単独処理群の涙液中CREB濃度に有意な差はみられなかった．筆者らの以前の報告で，MPCポリマーは涙液成分や角膜上皮の両方と親和性を有しており，点眼後上皮膜上に付着したMPCポリマーは涙液層をトラップし，眼表面の安定化が得られるということを報告している8）．また，筆者らのこれまでの実験にて，REB点眼液は点眼後CREB微粒子が角膜表面に付着し，溶解したものが徐々に吸収され薬効を示すことが確認されている9）．これらの背景および今回の結果から，REB点眼液点眼後の懸濁CREB微粒子が角膜表面に付着後，MPCポリマーがそれをカバーすることで，眼表面でのCREB濃度の維持が得られるのではないかと推察された．また，MPCポリマーが先に角膜上皮に付着し，その後CREB微粒子が角膜表面に接触してきた際には，これらCMPCポリマーによるCREBのカバーが十分には得られず，REB単独点眼と同程度の薬物涙液持続時間を示したのではないかと考えられた．ただ，これらの仮説の証明には今後より詳細な検討が必要と考えている．次に，REB点眼液およびCMPCポリマー併用処理した際の，ドライアイ療法としての有用性について検討を試みた．中嶋らはCN-アセチルシステインをウサギに点眼することにより眼表面のムチンを除去した実験動物モデル（眼表面ムチン被覆障害ウサギモデル）を作製している10）．また，本モデルにおいて，角結膜表面の微絨毛/微ひだの消失，角膜および結膜におけるムチン様糖蛋白質の減少，および涙液安定性の低下といったヒトのドライアイ特徴を有していることを示している10）．そこで今回，眼表面ムチン被覆障害ウサギモデルに対しCREB点眼液およびCMPCポリマー併用処理した際の角膜中央部における涙液層破壊率の改善効果について検討を行った．その結果，10％CN-アセチルシステイン溶液処理によりウサギ眼表面の涙液層破壊と涙液中ムチン量の低下が認められ，これら眼表面障害はCREB点眼液の点眼により顕著に軽減された．本研究同様，以前の眼表面ムチン被覆障害ウサギモデルを用いた報告においても，REB点眼液は角結膜でのムチン産生量を増加させ，涙液安定性の指標となるドライスポットの出現を抑制することが示されており10），今回の結果は，これら以前の研究成果を支持するものであった．さらに，REB投与後にCMPCポリマーを処理したCREB＋MPCP処理群について検討したところ，REB点眼処理群に比べ，涙液層破壊とムチン量低下がともに有意に改善した．これら結果は先に示した薬物の涙液滞留時間を反映するものであった．一方，MPCポリマー自身にも涙液保持機能効果が認められることから8），MPCポリマーを前処理したCMPCP＋REB処理群においても涙液層破壊の軽減が期待されたが，涙液層破壊とムチン量は，REB単独処理群と同程度であった．この要因として，MPCポリマーの濃度は低いため，後から点眼されたCREBにより希釈，排出が促進され，単独処理による眼表面の安定化を有するほどの濃度が眼表面で維持できなかった可能性があるが，このことについては今後検討が必要である．以上，市販ドライアイ治療薬であるCREB点眼液点眼後にMPCポリマーを処理することで，REBの涙液薬物滞留性が高まるとともに，眼表面ムチン被覆障害ウサギモデルに対する障害修復効果が向上することが示された．この結果からREB点眼液とCMPCポリマーの併用により，ムチン被覆改善作用が向上し，MPCポリマーが眼疾患領域で有用な添加剤になりうる可能性があると考えられた．今後，MPCポリマーを配合したCREB点眼製剤を調製するとともに，そのドライアイ治療効果についても検討を進めていく予定である．利益相反長井紀章（カテゴリーF，クラス：III，日油株式会社）原田英治，櫻井俊輔（カテゴリーE）後藤涼花，勢力諒太朗，渡辺彩花，油納美和，大竹裕子（なし）文献1）真鍋礼三，木下茂，大橋裕一ほか：角膜クリニック第C2版（井上幸次，渡辺仁，前田直之ほか）．p2-5，医学書院，C20032）GipsonCIK,CHoriCY,CArguesoP：CharacterCofCocularCsur-faceCmucinsCandCtheirCalterationCinCdryCeyeCdisease.COculCSurfC2：131-148,C20043）InatomiCT,CSpurr-MichaudCS,CTisdaleCASCetal：Expres-sionofsecretorymucingenesbyhumanconjunctivalepi-thelia.InvestOphthalmolVisSciC37：1684-1692,C19964）UchinoCY,CUchinoCM,CYokoiCNCetal：AlterationCofCtearCmucinC5ACCinCo.ceCworkersCusingCvisualCdisplayCtermi-nals：TheOsakaStudy.JAMAOphthalmolC132：985-992,C20145）ドライアイ研究会：ドライアイの定義および診断基準委員会：日本のドライアイの定義と診断基準の改訂（2016年版）．ドライアイ研究会，1-5,20166）MoshirfarCM,CPiersonCK,CHanamaikaiCKCetal：Arti.cialCtearspotpourri：aliteraturereview.ClinOphthalmolC8：C1419-1433,C20147）FoulksCGN,CBronAJ：MeibomianglandCdysfunction：aCclinicalCschemeCforCdescription,Cdiagnosis,Cclassi.cation,Candgrading.OculSurfC1：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