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ウイルス編-1：CMV角膜内皮炎の診断基準

2015年5月31日日曜日

特集●眼感染症診断の温故知新あたらしい眼科32（5）：637～641，2015特集●眼感染症診断の温故知新あたらしい眼科32（5）：637～641，2015ウイルス編-1：CMV角膜内皮炎の診断基準DiagnosticCriteriaforCMVCornealEndotheliitis小泉範子＊はじめにウイルス性角膜内皮炎は眼感染症のなかではあまり知名度の高くない疾患ではないだろうか．しかし，角膜内皮炎によって角膜内皮細胞が広範囲に脱落すると，水疱性角膜症となって高度の視力障害を生じる重症疾患であり，原因不明の角膜浮腫や角膜内皮障害の症例では鑑別疾患のひとつとして思い浮かべていただきたい．本稿では，2006年に日本から初めて報告され，近年とくに注目されているサイトメガロウイルス（cytomegalovirus：CMV）角膜内皮炎について，その臨床的特徴と診断，治療を概説する．ICMV角膜内皮炎とは角膜内皮炎は角膜内皮細胞に特異的な炎症を生じる疾患で，1982年にKhodadoustらによって初めて報告された．当時は自己免疫が関与する病態と考えられていたが1），その後，PCR（polymerasechainreaction）などの分子生物学的な検査によって原因が明らかになり，単純ヘルペスウイルス2～3），水痘帯状疱疹ウイルス4），サイトメガロウイルス，ムンプスウイルス5）などのウイルスが原因となることが知られている．なかでもCMV角膜内皮炎は，2006年に日本から初めて報告された新しい疾患概念であり6），その後，日本やシンガポール，台湾などのアジアの国々から相次いで報告されている7～11）．CMV角膜内皮炎は，進行すると水疱性角膜症に至る重症疾患であるにもかかわらず，新しく認識された疾患概念であるため，診断や治療法が確立されていないことが問題であった．近年，特発性角膜内皮炎研究班によってCMV角膜内皮炎診断基準が提唱され（表1），日本におけるレトロスペクティブな全国調査の結果が報告されるなど，その実態把握に関する研究が進められている11）．抗ヘルペスウイルス薬が奏効しない難治な角膜内皮炎や，角膜移植を繰り返す原因不明の水疱性角膜症のなかに，少なからずCMV角膜内皮炎の症例が含まれることから，角膜内皮障害の原因疾患の一つとして念頭に置いていただきたい疾患である．II臨床所見の特徴角膜内皮炎では，角膜後面沈着物（keraticprecipitates：KPs）を伴った限局性の角膜浮腫が認められる．円板状角膜炎などの角膜実質炎でも角膜浮腫を生じるが，角膜内皮炎では細胞浸潤や血管侵入を伴わないことが特徴で，半透明な“すりガラス”のような角膜浮腫が認められる．角膜内皮炎の臨床病型には大橋らの臨床分類が広く用いられており，角膜浮腫の分布パターンによって周辺部型2つと中央部型3つの計4つ（あるいは5つ）の型に分類される12,13）．CMV角膜内皮炎では，1型角膜内皮炎とよばれる周辺部から中央部に向かって角膜浮腫が進行するパターンをとることが多く，拒絶反応線に類似した線状のKPsや，円形に配列したKPsからなる衛星病巣（コインリージョン）を伴う症例が多い（図1，2）．線状のKPsやコインリージョンはとくにCMV＊NorikoKoizumi：同志社大学生命医科学部医工学科〔別刷請求先〕小泉範子：〒610-0321京都府京田辺市多々羅都谷1-3同志社大学生命医科学部医工学科0910-1810/15/\100/頁/JCOPY（27）637表1サイトメガロウイルス角膜内皮炎診断基準（平成24年度特発性角膜内皮炎研究班）I.前房水PCR検査所見①cytomegalovirusDNAが陽性②herpessimplexvirusDNAおよびvaricella-zostervirusDNAが陰性II.臨床所見①小円形に配列する白色の角膜後面沈着物様病変（コインリージョン）あるいは拒絶反応線様の角膜後面沈着物を認めるもの②角膜後面沈着物を伴う角膜浮腫があり，かつ下記のうち2項目に該当するもの・角膜内皮細胞密度の減少・再発性・慢性虹彩毛様体炎・眼圧上昇もしくはその既往＜注釈＞1.角膜移植術後の場合は拒絶反応との鑑別が必要であり，次のような症例ではサイトメガロウイルス角膜内皮炎が疑われる．①副腎皮質ステロイド薬あるいは免疫抑制薬による治療効果が乏しい．②host側にも角膜浮腫がある．2.治療に対する反応も参考所見となる．①ガンシクロビルあるいはバルガンシクロビルにより臨床所見の改善が認められる．②アシクロビル・バラシクロビルにより臨床所見の改善が認められない．＜診断基準＞典型例Iおよび，II-①に該当するもの．非典型例Iおよび，II-②に該当するもの．角膜内皮炎に特徴的な所見と考えられており，診断基準にも含まれている（表1）．ただしこれらの所見は，発症後の時間経過やステロイド薬による治療によって非典型的な形態を示すようになるため，コインリージョンなどがなくてもCMV角膜内皮炎を否定できるわけではない．CMV角膜内皮炎をはじめとするウイルス性角膜内皮炎では，角膜内皮細胞の脱落による角膜内皮細胞密度の低下を生じることが特徴であり，進行すると不可逆性の角膜内皮障害によって水疱性角膜症となる．虹彩毛様体炎や眼圧上昇，続発緑内障を伴う症例も多い．PosnerSchlossman症候群やFuchs虹彩異色性虹彩毛様体炎においてもHSVやCMVなどのウイルスの関与が報告されていることから，一部の症例ではこれらの前眼部炎症性疾患と角膜内皮炎は同一のウイルスによる一連の疾患の異なる病期をとらえている可能性がある．Suzukiらはこれらの前眼部炎症性疾患をanteriorchamber-associatedimmunedeviation（ACAID）-relatedsyndrome638あたらしい眼科Vol.32，No.5，2015として包括的にとらえる新しい概念を提唱しており13），今後，これらの疾患の病態解明に役立つ可能性がある．また，CMV角膜内皮炎は，CMV網膜炎とは異なり全身的な免疫不全のない患者に発症することが特徴である．III検査角膜内皮炎では病巣部からのウイルス分離は困難であり，前房水を用いたPCRによるウイルスDNA検査が行われる．PCRは非常に感度が高いため，病態とは無関係のウイルスDNAを検出する偽陽性を生じる可能性があることに注意しなくてはならない．とくにCMVは，正常人の前房水からも検出されることがあるため，検査のタイミングやPCRの感度によっては，病態とは関係のないウイルスDNAを検出することがある．ウイルスPCRの結果と臨床所見，抗ウイルス治療に対する反応などを総合的に判断してウイルス性角膜内皮炎と診断する必要がある．ヘルペス属ウイルスは成人の多くが既感（28）あたらしい眼科Vol.32，No.5，2015639（29）合には，CMV角膜内皮炎を強く疑わせる所見の組み合わせ，すなわち角膜内皮細胞密度の減少，再発性・慢性虹彩毛様体炎，眼圧上昇またはその既往のうちの2項目以上を満たした症例で，かつ前房水を用いたPCRでCMVが陽性，HSVやVZVが陰性を確認できれば，CMV角膜内皮の非典型例と診断される．代表的な典型例，非典型例の前眼部写真を図1～3に示す．染であるため，血清抗体価の上昇をもって原因ウイルスを特定することはできない．抗体陰性の場合は，原因ウイルスとして否定できるので診断の参考になる．最近では，リアルタイムPCRによって前房水中のウイルスDNA量の定量を行うことが可能になっており，病態の解明や治療効果の判定に有用な情報が得られることが期待される14～16）．また，CMV角膜内皮炎ではコンフォーカル顕微鏡によってコインリージョンの部分の角膜内皮細胞にCMV感染細胞で特徴的なOwl’seye（ふくろうの目）所見が認められることが報告されており17,18），角膜内皮細胞へのCMV感染を示唆する所見として注目されている．IVCMV角膜内皮炎の診断基準平成22年～24年度の厚生労働科学研究費の補助を受けて，特発性角膜内皮炎研究班が作成したCMV角膜内皮炎診断基準を表1に示す．線状のKPsや，コインリージョンとよばれる円形に配列するKP様病変は本疾患に特徴的であるため，これらが認められて，かつ前房水を用いたPCRによってCMVDNAが陽性，HSVやVZVが陰性であった場合には，CMV角膜内皮炎の典型例と診断される．一方，遷延した症例やステロイドによる治療が行われている症例では，コインリージョンなどの特徴的なKPsが認められないこともある．その場図1CMV角膜内皮炎の典型例（文献11より引用）限局性の角膜実質浮腫，上皮浮腫を認め，上方の透明角膜部分に円形に配列する角膜後面沈着物からなる衛星病巣（コインリージョン）が認められる（）．前房水からCMVDNAが検出され，CMV角膜内皮炎の典型例と診断された．図2CMV角膜内皮炎の典型例（角膜移植後眼）（文献11より引用）DSAEK術後に発症した角膜内皮炎．術後の定期受診の際に多発するコインリージョン（）が認められ，前房水からCMVDNAが検出された．図3CMV角膜内皮炎の非典型例（文献11より引用）前房水CMV陽性，角膜内皮障害，再発性虹彩毛様体炎，続発緑内障の既往よりCMV角膜内皮炎の非典型例と診断された症例．図1CMV角膜内皮炎の典型例（文献11より引用）限局性の角膜実質浮腫，上皮浮腫を認め，上方の透明角膜部分に円形に配列する角膜後面沈着物からなる衛星病巣（コインリージョン）が認められる（）．前房水からCMVDNAが検出され，CMV角膜内皮炎の典型例と診断された．図2CMV角膜内皮炎の典型例（角膜移植後眼）（文献11より引用）DSAEK術後に発症した角膜内皮炎．術後の定期受診の際に多発するコインリージョン（）が認められ，前房水からCMVDNAが検出された．図3CMV角膜内皮炎の非典型例（文献11より引用）前房水CMV陽性，角膜内皮障害，再発性虹彩毛様体炎，続発緑内障の既往よりCMV角膜内皮炎の非典型例と診断された症例．V鑑別疾患診断基準には，注釈として角膜移植後眼における拒絶反応との鑑別のポイントが記載されている．拒絶反応ではKPsが移植片内に限局するのに対して，角膜内皮炎では移植片のみならずホスト角膜側にも角膜浮腫やKPsが存在することが特徴であるが，周辺部に角膜混濁がある症例では観察が困難なこともある．ステロイド点眼薬を使用している角膜移植後眼では，角膜浮腫がごく軽度でコインリージョンのみが認められる場合もある（図2）．ステロイド薬や免疫抑制薬による拒絶反応に対する治療を行っても角膜浮腫が改善しない場合には，ウイルス性角膜内皮炎を疑って前房水を用いたウイルスPCRを行う必要がある．原因不明の水疱性角膜症や，角膜移植後に拒絶反応様の炎症を繰り返し，複数回の角膜移植を繰り返しているような症例でも，ウイルス性角膜内皮炎，とくにCMV角膜内皮炎を念頭においてウイルス検索を行うことが望ましい．VI治療CMV角膜内皮炎は新しく報告された疾患概念であり，保険適用のある薬剤を用いた標準治療は確立されていない．しかし，放置すれば水疱性角膜症に至ることもあり，実際には大学病院などの倫理委員会の承認と患者からの同意を得て，抗CMV治療薬を用いた研究的治療が行われている．具体的な治療プロトコールの例を表2に示す．CMV角膜内皮炎と診断された症例では，CMV網膜炎に準じた方法により抗CMV薬の全身投与を行う．局所治療として自家調整の0.5％ガンシクロビル点眼と混合感染予防のために抗菌薬点眼を併用する．角膜内皮密度が1,000個/mm2以下の症例では，水疱性角膜症となるリ表2CMV角膜内皮炎に対する初期治療の例①ガンシクロビル5mg/kgを1日2回点滴投与，2週間（保険適用外）あるいはバルガンシクロビル900mg，1日2回内服，4～12週間（保険適用外）②0.5％ガンシクロビル点眼液（自家調整）1日4～8回（保険適用外）③0.1％フルオロメトロン点眼1日4回スクが高いため，急性期の炎症が沈静化された後も，ガンシクロビル点眼を1日2～4回で継続しながら定期的な経過観察を行う必要がある．ウイルス性角膜内皮炎では，角膜内皮細胞へのウイルス感染とともに，炎症によって角膜内皮細胞が脱落すると考えられる．そのため0.1％フルオロメトロンなどの副腎皮質ステロイド薬（ステロイド）を用いた消炎治療を併用する．ウイルス感染症に対するベタメタゾン点眼薬の使用については意見が分かれるところであるが，筆者らは局所のベタメタゾン点眼薬は極力，使用しないようにしている．炎症による角膜浮腫が高度な症例では，テロイド薬の内服（ベタメタゾン0.5～1mgあるいはプレドニゾロン5～10mg）を併用することがある．VII予後発症後早期に診断と治療が行われ，抗ウイルス治療に良好な反応を示す症例では，十分な角膜内皮細胞密度が維持され，良好な長期予後が得られることが多い．一方で，治療開始時にすでに角膜内皮障害が進行していた症例では，治療によって角膜の透明性が回復しても，長期的には水疱性角膜症となる場合がある．角膜内皮移植後にも再発を生じると移植片不全となることから，再発予防のための治療を継続することが重要である．文献1）KhodadoustAA,AttarzadehA：Presumedautoimmunecornealendotheliopathy.AmJOphthalmol93：718-722,19822）OhashiY,KinoshitaS,ManoTetal：DemonstrationofherpessimplexvirusDNAinidiopathiccornealendotheliopathy.AmJOphthalmol112：419-423,19913）AmanoS,OshikaT,KajiYetal：Herpessimplexvirusinthetrabeculumofaneyewithcornealendotheliitis.AmJOphthalmol127：721-722,19994）MaudgalPC,MissottenL,DeClercqEetal：Varicellazostervirusinthehumancornealendothelium：acasereport.BullSocBelgeOphtalmol190：71-86,19805）SinghK,SodhiPK：Mumps-inducedcornealendotheliitis.Cornea23：400-402,20046）KoizumiN,YamasakiK,KawasakiSetal：Cytomegalovirusinaqueoushumorfromaneyewithcornealendotheliitis.AmJOphthalmol141：564-565,20067）KoizumiN＊,SuzukiT＊,UnoTetal：Cytomegalovirusas640あたらしい眼科Vol.32，No.5，2015（30）-’

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細菌・真菌編-2：ブロードレンジPCRによる眼感染症診断

2015年5月31日日曜日

特集●眼感染症診断の温故知新あたらしい眼科32（5）：631～636，2015特集●眼感染症診断の温故知新あたらしい眼科32（5）：631～636，2015細菌・真菌編-2：ブロードレンジPCRによる眼感染症診断DiagnosisofOcularInfectiousDiseasesUsingBroad-rangePCR高瀬博＊はじめに角結膜などの眼表面または眼内の感染性疾患の原因は多岐にわたるが，その治療は病因特異的に行われる必要がある．これらのうち，細菌や真菌の検出には鏡検や培養がゴールドスタンダードであるが，病原体によっては培養が困難なものや検出に時間を要するもの，すでに抗菌療法がエンピリックに開始されているために検出できないものなどがある．このような場合に，病原体の遺伝子を増幅，検出できるポリメラーゼ鎖反応（polymerasechainreaction：PCR）（用語解説参照）は，迅速かつ高感度に病原体の存在を検出することができる検査として，臨床現場でも広く用いられつつある．また，細菌または真菌に起因する眼疾患のなかで，眼内炎が疑われる症例に対するPCRは，ヘルペス性眼内炎症疾患に対するPCRとともに，平成25年末に厚生労働省により先進医療として認められた．そのため，筆者らの施設においては従来行っている網羅的PCRシステムの一部として，平成26年より細菌・真菌による眼内炎が疑われる症例に対するブロードレンジPCRを先進医療検査として実施している（図1）．本稿では，細菌および真菌遺伝子の検出に用いられるブロードレンジPCRについて，その原理と有用性，問題点について，自験例を交えて概説する．I細菌，真菌に対するブロードレンジPCRの概要感染性眼疾患の病因診断のための解析対象となりえる眼組織検体には，眼脂，角膜擦過物および掻爬組織，前房水，硝子体液などがあげられる．このうち液性検体は，検体中の炎症細胞や組織の量に左右されるが，目安としては約100μlの検体量で解析を行う．これらの検体から抽出したDNAを用いて検査を行う．ブロードレンジPCRは，細菌と真菌それぞれの種のリボゾームRNAに保存されている種特異的な遺伝子領域を標的にしたものであり（図2），菌種の特定には至らないまでも細菌もしくは真菌の約60～80％を検出することが可能である1）．筆者らの施設では，細菌の検出には16SリボゾームRNA，真菌の検出には18Sまたは28SリボゾームRNAとよばれる遺伝子領域を増幅するようにプライマーを設計し，さらに増幅される遺伝子を定量するためにリアルタイムPCR（用語）を施行している2,3）．もしも真菌リボゾームRNAが陽性となった場合は，眼科領域でしばしば原因菌として検出されるカンジダまたはアスペルギルスを標的としたリアルタイムPCRを施行し，さらなる原因菌の特定を行っている4）．それ以外の菌種に関しても，細菌または真菌のリボゾームRNAを増幅したPCR産物を用いて，シークエンサーにより遺伝子配列を解析して菌種の同定を迅速に行うことが可能であり2），今後のさらなる臨床応用が期待さ＊HiroshiTakase：東京医科歯科大学大学院医歯学総合研究科眼科学〔別刷請求先〕高瀬博：〒113-8519東京都文京区湯島1-5-45東京医科歯科大学大学院医歯学総合研究科眼科学0910-1810/15/\100/頁/JCOPY（21）631眼内液，眼内組織から抽出したDNA眼内液，眼内組織から抽出したDNA細菌保存領域16SrRNA真菌保存領域28SrRNA先進医療ぶどう膜炎，角膜炎セット結核，梅毒，バルトネラトキソカラ，トキソプラズマアカントアメーバ眼内リンパ腫IgH，TCR遺伝子再構成ウイルスセット検査項目HHV1～8ブロードレンジPCRマルチプレックスPCRPCRスクリーニング検査HTLV-1プロウイルス遺伝子配列解析→菌種の特定サイトカイン解析サザンブロットリアルタイムPCR（カンジダ，アスペルギルス）リアルタイムPCR二次検査図1東京医科歯科大学眼科における眼内液に対する網羅的検査システム眼内液または眼組織から抽出したDNAを用いて，細菌・真菌に対するブロードレンジPCR，ヘルペスウイルス・結核・梅毒などに対するマルチプレックスPCR，また，B細胞・T細胞の遺伝子再構成をPCRで検出する．細菌または真菌による眼内炎が疑われる症例に対するPCRと，ヘルペス性ぶどう膜炎が疑われる症例に対するPCRは，それぞれ先進医療として施行している．rRNA：リボソームRNA，HHV：ヒトヘルペスウイルス，IgH：免疫グロブリン重鎖，TCR：T細胞受容体．細菌遺伝子細菌16SリボゾームRNAV1V2V3V4V5V6V7V8V916SBac349FBac806RBac56F保存領域可変領域(V1.V9)Bac349F:ForwardprimerAGGCAGCAGTDRGGAATBac806R:ReverseprimerGGACTACYVGGGTATCTAATBac56F:蛍光プローブ6FAM-TGCCAGCAGCCGCGGTAATACRDAG-iowaBK図2細菌に対するブロードレンジPCRの原理細菌の遺伝子配列の中には16SリボゾームRNAとよばれる領域があり，これはほとんどの細菌種に共通遺伝子配列を有する保存領域と，菌種によって異なる遺伝子配列の可変領域で構成される．この保存領域に結合するプライマーとプローブを用いてPCRを行うことで，既知の細菌または真菌の60～80％を検出することができる．また，増幅産物の遺伝子配列を明らかにすれば，そこに含まれる保存領域の遺伝子配列から菌種を同定できることとなる．632あたらしい眼科Vol.32，No.5，2015（22）あたらしい眼科Vol.32，No.5，2015633（23）薬治療を行い，後日に培養検査でその裏付けがとれたものである．一方で，ブロードレンジPCRは除外診断にも有用であり，その一例を紹介する．80歳女性の両眼の加齢白内障に対して手術を施行した．術中に合併症はなく，経過は良好であったが，約1カ月後に左眼の視力低下と眼痛を自覚して来院した．左眼の前房には多数の浸潤細胞と線維素が析出し，前房蓄膿が生じていた（図4）．前部硝子体にも細胞浸潤があり，びまん性硝子体混濁もみられた．白内障術後眼内炎を疑い，同日にバンコマイシンとセフタジジムの硝子体注射を施行し，同時に前房水を採取した．採取した前房水は，培養検査とマルチプレックスPCRおよびブロードレンジPCRに提出した．しかし，その後も眼内炎症は改善の兆しがなく，また培養検査およびPCRはすべて陰性だった．そのため，硝子体手術と眼内レンズ摘出術を施行し，バンコマイシンとセフタジジムの灌流下で硝子体手術を施行した．手術開始時に，灌流開始前に硝子体を約1ml採取し，培養検査，病理細胞診ならびにPCRに提出した．しかし，やはり培養検査，PCRともにすべて陰性だった．そのため，本症例が無菌性眼内炎であることを疑いステロイドの局所頻回投与を行ったところ，炎症は消退し，その後再発も生じなかった．本症例は後に，眼内レンズに起因する無菌性眼内炎と判明した症例であった．れる．IIブロードレンジPCRの臨床使用例ブロードレンジPCRの利点は，その結果が得られるまでの迅速さと感度の高さであるといえる．その一例として最初に示すのは，硝子体注射後に生じた感染性眼内炎の症例である．左眼の加齢黄斑変性症に対して抗VEGF薬の硝子体注射を受けた68歳男性が，眼痛と充血を主訴に紹介受診した．初診時の左眼所見は，強い毛様充血，前房には線維素析出と大型の前房細胞浸潤が多数みられ，前房蓄膿を生じており，眼底は透見できなかった（図3）．感染性眼内炎を疑い，同日にバンコマイシンとセフタジジムの灌流下で硝子体手術を施行した．手術開始時に，灌流開始前に硝子体を約1ml採取し，培養検査，病理細胞診ならびにPCRに提出した．PCRではヘルペスウイルス属などを候補遺伝子としたマルチプレックスPCR（用語解説参照）と，細菌および真菌を標的としたブロードレンジPCRを含めた網羅的PCRを施行した．その結果，細菌16SリボゾームRNAが検出され，細菌感染による眼内炎が強く疑われた．術後，眼内炎症は消退傾向となったが，抗菌薬の全身投与を継続した．後日，培養検査では表皮ブドウ球菌が同定された．本症例は臨床的に感染性眼内炎が疑われ，ブロードレンジPCRで早期診断を行うことで抗菌ab図368歳，男性．細菌性眼内炎の左眼前眼部写真抗VEGF抗体の硝子体注射から3日後に左眼の眼痛と充血を主訴に受診した．強い毛様充血，前房には線維素析出と前房蓄膿（a），大型の前房細胞浸潤が多数みられた（b）．硝子体手術を施行し，採取した硝子体液を培養，PCRで検査した．その結果，ブロードレンジPCRで細菌16SリボゾームRNAが検出され，培養検査では表皮ブドウ球菌が同定された．抗菌薬治療により眼内炎症は消退した．ab図368歳，男性．細菌性眼内炎の左眼前眼部写真抗VEGF抗体の硝子体注射から3日後に左眼の眼痛と充血を主訴に受診した．強い毛様充血，前房には線維素析出と前房蓄膿（a），大型の前房細胞浸潤が多数みられた（b）．硝子体手術を施行し，採取した硝子体液を培養，PCRで検査した．その結果，ブロードレンジPCRで細菌16SリボゾームRNAが検出され，培養検査では表皮ブドウ球菌が同定された．抗菌薬治療により眼内炎症は消退した．634あたらしい眼科Vol.32，No.5，2015（24）3例目に示すのは，臨床的に判断に迷う症例に対してブロードレンジPCRの結果が治療の後押しとなった症例である．糖尿病のため眼底検査目的で定期通院していた73歳の男性が，約10日前からの左眼の違和感と頭痛を主訴に受診した．左眼矯正視力はそれまでの1.0から0.06に低下していた．角膜中央部には円形の角膜上皮.離があり，その辺縁に沿って斑状の実質混濁が点在していた（図5）．角膜実質には強いDescemet膜皺襞，前房には浸潤細胞が多数観察された．当初は抗生物質の点眼，内服を施行していたが角膜所見には改善なく，ピマリシン眼軟膏の追加に対しても反応を示さなかった．そのため，病変部を擦過し，培養とPCRに提出した結果，真菌28SリボゾームRNAが検出された．この結果から，菌種は不明のままポリコナゾールの自家調整点眼およびイトラコナゾール100mgの内服を開始したところ，角膜病変は徐々に消退した．培養検査からはその後真菌は検出されず，カンジダおよびアスペルギルス遺伝子に対するリアルタイムPCRを施行したが，これも陰性だった．この症例は，培養による真菌検出の裏付けはとれず，PCRによる菌種の特定にも至らなかったが，抗真菌薬投与への反応から真菌性角膜炎と考えられた．ここまで，ブロードレンジPCRが診断に有用であっab図480歳，女性．術後非感染性眼内炎の左眼前眼部写真加齢性白内障に対する手術から1カ月後に，左眼の視力低下と眼痛を自覚して来院した．左眼の前房には多数の浸潤細胞と線維素析出（a），前房蓄膿（b）が生じていた．白内障術後眼内炎を疑い，抗菌薬の硝子体注射を施行し，同時に前房水を採取したが，培養検査およびPCRはすべて陰性だった．硝子体手術と眼内レンズ摘出術を施行し，バンコマイシンとセフタジジムの灌流下で硝子体手術を施行しが，手術時に採取した硝子体に対する培養検査，PCRはともにすべて陰性だった．本症例は後に，眼内レンズに起因する無菌性眼内炎と判明した．図573歳，男性．真菌性眼内炎の左眼前眼部写真糖尿病で経過観察中の男性が，約10日前からの左眼の違和感と頭痛を主訴に受診した．左眼角膜中央部には円形の角膜上皮.離があり，その辺縁に沿って斑状の実質混濁が点在していた．また，角膜実質には強いDescemet膜皺襞，前房には浸潤細胞が多数観察された．病変部を擦過し，培養とPCRに提出した結果，真菌28SリボゾームRNAが検出された．抗真菌薬の局所および全身投与を追加し，角膜病変は消退した．培養検査からはその後真菌は検出されず，カンジダおよびアスペルギルス遺伝子に対するリアルタイムPCRも陰性だった．ab図480歳，女性．術後非感染性眼内炎の左眼前眼部写真加齢性白内障に対する手術から1カ月後に，左眼の視力低下と眼痛を自覚して来院した．左眼の前房には多数の浸潤細胞と線維素析出（a），前房蓄膿（b）が生じていた．白内障術後眼内炎を疑い，抗菌薬の硝子体注射を施行し，同時に前房水を採取したが，培養検査およびPCRはすべて陰性だった．硝子体手術と眼内レンズ摘出術を施行し，バンコマイシンとセフタジジムの灌流下で硝子体手術を施行しが，手術時に採取した硝子体に対する培養検査，PCRはともにすべて陰性だった．本症例は後に，眼内レンズに起因する無菌性眼内炎と判明した．図573歳，男性．真菌性眼内炎の左眼前眼部写真糖尿病で経過観察中の男性が，約10日前からの左眼の違和感と頭痛を主訴に受診した．左眼角膜中央部には円形の角膜上皮.離があり，その辺縁に沿って斑状の実質混濁が点在していた．また，角膜実質には強いDescemet膜皺襞，前房には浸潤細胞が多数観察された．病変部を擦過し，培養とPCRに提出した結果，真菌28SリボゾームRNAが検出された．抗真菌薬の局所および全身投与を追加し，角膜病変は消退した．培養検査からはその後真菌は検出されず，カンジダおよびアスペルギルス遺伝子に対するリアルタイムPCRも陰性だった．あたらしい眼科Vol.32，No.5，2015635（25）このように，PCRの結果が実際の臨床経過に矛盾する症例や，眼局所から検出されても病態への関与が明らかにできないものも複数ある．したがって，PCRの結果を安易に診断の根拠とすることは行ってはならず，臨床経過の慎重な観察に加え，従来から行われている検体検査，すなわち塗抹，培養，抗体測定，病理組織細胞診などは可能な限り行うべきである．おわりにブロードレンジPCRによる細菌・真菌の検出について，その原理と臨床応用について概説した．本検査は，眼内炎が疑われるものに関しては先進医療に認められており，今後のより多くの施設における臨床使用の拡大が期待される．一方で，PCRに対する一般眼科医の期待たと思われる例について述べた．それでは，これらの感度と特異度はどのようになっているのだろうか．網羅的PCRシステムを用いた多施設共同研究のデータから考えてみたい．IIIブロードレンジPCRの診断力と問題点どのような検査にもその診断には偽陽性，偽陰性となる可能性がある．PCRは感度が高い検査であるがゆえに，環境に存在する微生物を検出してしまう危険性が常にあり，その解釈には慎重さを要する．現在，筆者らの研究室で運用しているブロードレンジPCRを含む網羅的PCRシステムは，東京医科歯科大学眼科を中心とした国内5施設の共同研究で，その有用性を検証したものである5）．対象は500例のぶどう膜炎患者の前房水または硝子体液で，そのうち眼内炎症を伴わない白内障，裂孔原性網膜.離，増殖糖尿病網膜症，網膜静脈閉塞症などに対して原疾患治療を目的に手術を施行した100例から得られた前房水または硝子体液を用いた．その結果，ぶどう膜炎患者500例の眼内液からは33例（6.6％）で細菌16SリボソームRNAが，11例（2.2％）で細菌18Sまたは28SリボゾームRNAが検出された一方で，原疾患を目的に手術を施行した100例から採取した眼内液検体はいずれも陰性となった．細菌リボゾームRNAが検出された33例のうち，26例は細菌性眼内炎，3例は特発性ぶどう膜炎，4例は他の感染性ぶどう膜炎から同時検出されたものと最終診断された．一方，真菌リボゾームRNAが陽性となった11例では，9例が真菌性眼内炎，1例が特発性ぶどう膜炎，1例が他の感染性ぶどう膜炎からの同時検出と最終診断された．しかし，これらの患者のその後の経過，治療に対する反応，他の検査結果などから総合的に診断を行った結果をあわせると，上記の結果に偽陽性および偽陰性症例が含まれることも明らかとなった．細菌リボゾームRNAが検出された症例のうち3例については，その後の解析で偽陽性と判定された．また，ブロードレンジPCRでは陰性となった症例のうち，12例が細菌性眼内炎，2例が真菌性眼内炎と最終診断され，これらは偽陰性症例と判定された．■用語解説■ポリメラーゼ鎖反応（polymerasechainreaction：PCR）：反応チューブ内に，患者眼内液から抽出したDNA，プライマー（標的遺伝子領域に特異的に結合する1対の短い核酸断片），DNA合成酵素，DNA合成のための基質などを混合し，PCR装置で以下の3つのステップで温度を変化させる．①熱変性：94℃に加熱すると，2本鎖構造であるDNAが変性して1本鎖DNAとなる．②アニーリング：60℃に急速冷却すると1本鎖DNAとプライマーが結合する．③伸長：72℃まで加熱するとDNA合成酵素が活性化し，それによりプライマーがDNA合成を開始し，2本鎖DNAが複製される．この①～③を1つのサイクルとして，20～30サイクル程度反応を繰り返すことで，目的のDNAを大量に複製することができる．PCRによる増幅の有無は，アガロースゲルなどへの電気泳動や，蛍光色素の発色の有無などで判定する．リアルタイムPCR：PCRの際に，複製したDNAを定量する方法．PCRの標的となるDNA領域に特異的に結合するプローブとよばれる短い核酸断片に蛍光色素を標識したもの，またはDNAそのものに結合する蛍光物質を用い，DNAの複製が進むに従って強まる蛍光発色を経時的に測定し，DNA量を測定するもの．マルチプレックスPCR：複数の標的遺伝子に対して，1つの反応系で同時にPCRを行う方法．異なる融解温度（Tm値）をもつように設計された複数のプライマーを混合し，1本の反応チューブ内で反応させたPCR産物に対して融解曲線分析を行うことで，特定の遺伝子の増幅を検出することができる．■用語解説■ポリメラーゼ鎖反応（polymerasechainreaction：PCR）：反応チューブ内に，患者眼内液から抽出したDNA，プライマー（標的遺伝子領域に特異的に結合する1対の短い核酸断片），DNA合成酵素，DNA合成のための基質などを混合し，PCR装置で以下の3つのステップで温度を変化させる．①熱変性：94℃に加熱すると，2本鎖構造であるDNAが変性して1本鎖DNAとなる．②アニーリング：60℃に急速冷却すると1本鎖DNAとプライマーが結合する．③伸長：72℃まで加熱するとDNA合成酵素が活性化し，それによりプライマーがDNA合成を開始し，2本鎖DNAが複製される．この①～③を1つのサイクルとして，20～30サイクル程度反応を繰り返すことで，目的のDNAを大量に複製することができる．PCRによる増幅の有無は，アガロースゲルなどへの電気泳動や，蛍光色素の発色の有無などで判定する．リアルタイムPCR：PCRの際に，複製したDNAを定量する方法．PCRの標的となるDNA領域に特異的に結合するプローブとよばれる短い核酸断片に蛍光色素を標識したもの，またはDNAそのものに結合する蛍光物質を用い，DNAの複製が進むに従って強まる蛍光発色を経時的に測定し，DNA量を測定するもの．マルチプレックスPCR：複数の標的遺伝子に対して，1つの反応系で同時にPCRを行う方法．異なる融解温度（Tm値）をもつように設計された複数のプライマーを混合し，1本の反応チューブ内で反応させたPCR産物に対して融解曲線分析を行うことで，特定の遺伝子の増幅を検出することができる．-

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細菌・真菌編-1：細菌性角膜炎・真菌性角膜炎の臨床所見の見分け方

2015年5月31日日曜日

特集●眼感染症診断の温故知新あたらしい眼科32（5）：625.629，2015特集●眼感染症診断の温故知新あたらしい眼科32（5）：625.629，2015細菌・真菌編-1：細菌性角膜炎・真菌性角膜炎の臨床所見の見分け方ClinicalFindingsofBacterialandFungalKeratitis子島良平＊はじめに感染性角膜炎を引き起こす病原微生物には，現在，細菌，真菌，原虫，ウイルスが知られている．この4つの病原微生物のうち，細菌性角膜炎は臨床においてもしばしば遭遇する．真菌性角膜炎の頻度はさほど多くはないが，重症化することもあり注意を要する疾患である．細菌性角膜炎，真菌性角膜炎を診察する際には，ただ漫然と「見る」ではなく，特徴的な所見を「観る」ことが重要である．感染巣の場所や形態，上皮欠損の有無や細胞浸潤の深さなどポイントを押さえて観察する必要がある．細胞浸潤の深さや広がりを観察する際には，スリット光の幅を狭くして，斜め方向から光を当てるよう弱拡大にする（図1）．細菌性，真菌性角膜炎には起因菌により特徴的な臨床所見が存在する場合がある．たとえば，匐行性角膜潰瘍，輪状膿瘍，カラーボタン様膿瘍，羽毛状混濁などである．これらの特徴的な臨床所見をマスターすれば，ある程度起因菌を絞り込んでいくことが可能となる．本稿では，細菌性角膜炎，真菌性角膜炎それぞれの特徴的な臨床所見を概説する．I細菌性角膜炎の臨床所見細菌性角膜炎の起因菌は，グラム染色による染色性からグラム陽性，グラム陰性に，形態から球菌，桿菌の計強拡大図1角膜炎症例における細胞浸潤の観察法スリット光の幅を狭く絞り，斜め方向から光を当てる．強拡大で観察することで細胞浸潤の深さを確認できる（○囲み）．＊RyoheiNejima：宮田眼科病院〔別刷請求先〕子島良平：〒885-0051宮崎県都城市蔵原町6-3宮田眼科病院0910-1810/15/\100/頁/JCOPY（15）625図2表皮ブドウ球菌による角膜炎図3肺炎球菌による角膜炎コンタクトレンズの誤使用が原因となった表皮ブドウ球菌外傷を契機として発症した肺炎球菌による角膜炎．膿瘍がによる角膜炎．傍中央部に小さな限局性の膿瘍を認める這い回ったような所見および角膜の2時方向の菲薄化を認（○囲み）．める（○囲み）．角膜穿孔をきたし，最終的に角膜移植を行った．あたらしい眼科Vol.32，No.5，2015627（17）4.グラム陰性桿菌グラム陰性桿菌による角膜炎の特徴的な臨床所見には，輪状膿瘍，スリガラス状混濁，角膜浮腫，ブラシ状混濁，カラーボタン様膿瘍，前房蓄膿などがあげられる．起因菌としては緑膿菌やモラクセラがある．緑膿菌は，コンタクトレンズ関連角膜炎の起因菌として報告されており，臨床所見は，初期では円型の膿瘍を疑った場合には塗抹検鏡を併せて行うことが重要である．ニューキノロン系抗菌薬に対する耐性化が進行しているため，通常はセフェム系抗菌薬（セフトリアキソンなど）が第一選択となるが，近年ではセフトリアキソン耐性株の報告もあり，薬剤感受性試験の結果を参考に治療薬を選択する必要がある5）．図6緑膿菌による角膜炎コンタクトレンズの誤使用で発症した緑膿菌による角膜炎．輪状膿瘍（○囲み）を認め，周囲の角膜は浮腫をきたしスリガラス状混濁を呈している．前房蓄膿も認めた．図4コリネバクテリウムによる角膜炎高齢者に発症したコリネバクテリウムによる角膜炎．角膜傍中央部に軟らかそうな白色病変（○囲み）および周辺角膜への細胞浸潤を認めた．図7モラクセラによる角膜炎糖尿病患者に発症したモラクセラによる角膜炎．角膜中央部にカラーボタン様膿瘍（○囲み），前房蓄膿を認めた．図5淋菌による角結膜炎20代の女性に発症した淋菌性角結膜炎．大量の眼脂，充血を認めた．経過観察中に角膜周辺部が菲薄化した（○囲み）．図6緑膿菌による角膜炎コンタクトレンズの誤使用で発症した緑膿菌による角膜炎．輪状膿瘍（○囲み）を認め，周囲の角膜は浮腫をきたしスリガラス状混濁を呈している．前房蓄膿も認めた．図4コリネバクテリウムによる角膜炎高齢者に発症したコリネバクテリウムによる角膜炎．角膜傍中央部に軟らかそうな白色病変（○囲み）および周辺角膜への細胞浸潤を認めた．図7モラクセラによる角膜炎糖尿病患者に発症したモラクセラによる角膜炎．角膜中央部にカラーボタン様膿瘍（○囲み），前房蓄膿を認めた．図5淋菌による角結膜炎20代の女性に発症した淋菌性角結膜炎．大量の眼脂，充血を認めた．経過観察中に角膜周辺部が菲薄化した（○囲み）．628あたらしい眼科Vol.32，No.5，2015（18）性のカラーボタン様膿瘍である．カンジダがおもな起因菌であり，ステロイド点眼薬の使用や糖尿病など免疫機能不全患者での感染が多い．臨床所見は，傍中央部にかけて比較的小さい，境界がやや不明瞭なカラーボタン様の膿瘍を認める（図8）．糸状菌に比べると角膜深層部への進展は少なく，表在性の病態を呈する．治療にはポリエン系，アゾール系，ファンギン系の抗真菌薬を使用する．2.糸状真菌糸状真菌による角膜炎の臨床所見の特徴的な臨床所見は，hyphateulcer，endothelialplaqueである．起因菌としてフサリウムやアスペルギルスなどがあり，原因として外傷（とくに植物）が多い．臨床所見は，境界が不明瞭な羽毛状の混濁（hyphateulcer）や，その部位に一致した角膜裏面の沈着物（endothelialplaque）を認める（図9）．角膜深層部へ進展し，角膜穿孔をきたすことも多い6）．治療にはポリエン系，アゾール系抗真菌薬を使用するが，予後不良の症例も多く，注意が必要である．III特殊な所見を呈する感染性角膜炎：infec-tiouscrystallinekeratopathy（ICK）ICKは，角膜実質内で細菌や真菌が炎症を伴わず，バイオフィルムを形成した状態である．ステロイドを使認めるが，進行すると潰瘍部の中央が抜けてみえる輪状膿瘍を呈する．また，膿瘍部の周囲にブラシ状の混濁を呈することもある．潰瘍周辺の角膜は浮腫をきたし，スリガラス状に混濁をきたすことも特徴的な所見である（図6）．モラクセラによる角膜炎は，角膜中央から傍中央部にカラーボタン様の膿瘍を呈し，緑膿菌と同様に周辺部の角膜浮腫，スリガラス状混濁を呈する．緑膿菌，モラクセラともに進行すると前房蓄膿を伴うようになる（図7）．治療にはニューキノロン，アミノグリコシド系の抗菌薬を使用する．II真菌性角膜炎の臨床所見真菌性角膜炎の起因菌は，その形状から酵母状真菌と糸状菌に分類される．代表的な菌種として，酵母状真菌ではカンジダ，糸状真菌ではフサリウム，アスペルギルスなどがあげられる．1.酵母状真菌酵母状真菌による角膜炎の特徴的な臨床所見は，表在図8カンジダによる角膜炎ぶどう膜炎に対しステロイドを使用中にカンジダによる真菌性角膜炎を発症した症例．傍中央部にカラーボタン様膿瘍を認め（○囲み），塗抹検鏡で酵母状真菌を認めた．図9フサリウムによる角膜炎外傷を契機に発症したフサリウム角膜炎．3時方向の角膜周辺部に羽毛状の混濁を認め（→），同部位の角膜裏面に沈着物を認めた．周辺角膜は穿孔し，虹彩が陥嵌していた（○囲み）．図8カンジダによる角膜炎ぶどう膜炎に対しステロイドを使用中にカンジダによる真菌性角膜炎を発症した症例．傍中央部にカラーボタン様膿瘍を認め（○囲み），塗抹検鏡で酵母状真菌を認めた．図9フサリウムによる角膜炎外傷を契機に発症したフサリウム角膜炎．3時方向の角膜周辺部に羽毛状の混濁を認め（→），同部位の角膜裏面に沈着物を認めた．周辺角膜は穿孔し，虹彩が陥嵌していた（○囲み）．あたらしい眼科Vol.32，No.5，2015629（19）3）佐埜弘樹，江口洋，宮本龍郎ほか：1.5％レボフロキサシン点眼薬が奏効したキノロン耐性Corynebacterium角膜炎．あたらしい眼科31：1683-1686,20144）EguchiH,KuwaharaT,MiyamotoTetal：High-levelfluoroquinoloneresistanceinophthalmicclinicalisolatesbelongingtothespeciesCorynebacteriummacginleyi.JClinMicrobiol46：527-532,20085）OhnishiM,SaikaT,HoshinaSetal：Ceftriaxone-resistantNeisseriagonorrhoeae,Japan.EmergInfectDis17：148.149,20116）鈴木崇，宇野敏彦，宇田高広ほか：糸状菌による角膜真菌症における病型と予後の検討．臨眼58：2153-2157,20047）OrmerodLD,RuoffKL,MeislerDMetal：Infectiouscrys-tallinekeratopathy.Roleofnutritionallyvariantstrepto-cocciandotherbacterialfactors.Ophthalmology98：159-169,19918）OsakabeY,YaguchiC,MiyaiTetal：DetectionofStrep-tococcusspeciesbypolymerasechainreactionininfec-tiouscrystallinekeratopathy.Cornea25：1227-1230,2006用中の患者に認めることがあり，ステロイドによる消炎効果が発症に関連していると考えられている．臨床所見として，角膜実質内に刺状や針状の白色の混濁を認める（図10）．起因菌には，緑色レンサ球菌や表皮ブドウ球菌，カンジダなどが報告されている7,8）．治療は，検出菌に合わせて抗菌薬や抗真菌薬を使用するが，反応性に乏しく，移植が必要となる場合もある．おわりに感染性角膜炎を診断し，治療することは，推理小説の謎解きに似ている．聞き取り調査を行い（問診），現場に残された遺留品（臨床所見）から犯人（起因菌）を類推し，確たる証拠を突きつけ（塗抹検鏡，培養検査），難事件を解決（治癒）する．今回は感染性角膜炎のうち細菌，真菌について臨床所見を概説したが，これはあくまでも，診断のプロセスの一つにしかすぎない．感染性角膜炎を治癒するためには，臨床所見以外の問診や塗抹検鏡，培養検査といったプロセスも同等に重要である．忙しい臨床現場では，十分な問診ができない場合もあるかもしれない．また，多くの施設では，塗抹検鏡や培養検査まで行うことはむずかしい．しかし，事件解決には初動が重要であるように，感染性角膜炎においても，感染初期の特徴的な臨床所見を見逃さず的確な診断を行うことができれば，より良い結果が待っている．Miserablesな患者を増やさないために，本稿が一助となれば幸いである．文献1）宇野敏彦，福田昌彦，大橋裕一ほか：重症コンタクトレンズ関連角膜感染症全国調査．日眼会誌115：107-115,20112）春畑裕二，山田昌和，大竹雄一郎ほか：アトピー性皮膚炎患者のメチシリン耐性黄色ぶどう球菌（MRSA）術後感染例の検討．日眼紀50：471-475,1999図10Infectiouscrystallinekeratopathy角膜移植後の患者で認めたICKの症例．角膜実質内に針状の形態をした混濁を認める（○囲み）．図10Infectiouscrystallinekeratopathy角膜移植後の患者で認めたICKの症例．角膜実質内に針状の形態をした混濁を認める（○囲み）．

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検査編-2：MALDI-TOF MSによる菌種同定

2015年5月31日日曜日

特集●眼感染症診断の温故知新あたらしい眼科32（5）：619～624，2015特集●眼感染症診断の温故知新あたらしい眼科32（5）：619～624，2015検査編-2：MALDI-TOFMSによる菌種同定BacteriaIdentificationbyMALDI-TOFMS宮本仁志＊はじめに細菌の同定には，集落の性状，染色所見，菌の形態や配列，血清型，同定キットや自動同定機器が用いられているが，現法では同定困難な菌種もあり，信頼のある菌名同定には16SrRNAのシークエンスによる系統解析が用いられている．遺伝子解析法には，①多くの検体を一度に解析できない，②操作方法が煩雑である，などの欠点があり，各検査室レベルでの対応は困難である．これらの欠点を解決し，日常検査での対応を可能としたのが質量分析装置，MALDI-TOFMS（MatrixAssistedLaserDesorption/Ionization-TimeofFlightMassSpectrometer）で，日本語に訳すと「マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計」である．質量分析法による細菌同定装置として，MALDIBiotyper（ブルカー・ダルトニクス）とVITEKMS（シスメックス・ビオメリュー）の2機種があるが，今回は前者のMALDIBiotyperを中心に述べる．I質量分析法「質量分析（massspectrometry）」とは蛋白質の重さ（質量）を量ることであり，英語のmassspectrometryの頭文字からMSと略記されるので，慣用的に「マス」といわれている．蛋白質は各々固有の重さをもっているので，この重さの違いを計測すれば，分子量から蛋白質の名前やその濃度を知ることができる．細菌の同定に使用されている質量分析装置は，マトリックスという試薬と試料を混合して「レーザー」を照射することによってイオン化し（図1），真空中のある一定の距離をイオンが飛んで行く時間を計測して質量を割り出す組み合わせで構成されている．軽い分子は速く走り，重い分子は遅れて走るので検出器には質量の軽いものから順に検出される（図2左）．この現象を横軸に時間（時間から質量に変換），縦軸に検出強度としてプロットした波形がマススペクトルである（図2右）．マススペクトルは図3に示すように，菌種によってピークと強度のパターンが異なっているため，さまざまな菌種のさまざまな菌株をデータベースに登録しておき，未知の菌株のマススペクトルがどの菌種のパターンと一致しているかをデータベースの中から探し，マススペクトルのパターンマッチングにより同定を行う．現在（MALDIBiotyperVer.3.1），データベース中の菌種登録は一般菌で2,290菌種にも上る．同定結果は，ライブラリーとのマッチングで近似性の高い菌株からスコアの順に10菌種表示される（図4）．ScoreValueが2.0以上の場合は緑色で表示され高い確率で菌種が一致することを意味する．ScoreValueが1.700～1.999は黄色で属名までの一致に留まり，1.699以下は赤色で不一致の可能性を示唆している．図4の例では，Rank9位までStreptococcusagalactiaeで．Rank8位までScoreValue2.000以上であるため本菌種と同定して問題ないが，10位に別の菌名が表示されている．これはデータベース登録菌数が菌種によって異なり，S.agalactiaeは9菌種であることに原因がある．同定結果＊HitoshiMiyamoto：愛媛大学医学部附属病院検査部〔別刷請求先〕宮本仁志：〒791-0295愛媛県東温市志津川愛媛大学医学部附属病院検査部0910-1810/15/\100/頁/JCOPY（9）619620あたらしい眼科Vol.32，No.5，2015（10）を確認する場合は，登録菌数も参考にして判断する必要がある．脱離およびイオン化レーザーによるマトリックスの励起レーザー光H＋H＋H＋…試料…マトリックス試料台試料台図1質量分析（MALDI-TOF）測定原理1（試料中成分のイオン化）マトリックスという試薬と試料を混合してレーザーを照射し，イオン化する．電極検出器レーザー光飛行時間の測定飛行時間軽い分子の方が速く飛行する（飛行時間が短い）t1質量（m/z）m2m1m3t2t3マススペクトル（MS）相対強度相対強度真空中を飛行加速図2質量分析（MALDI-TOF）測定原理2（イオンの分離とマススペクトルの取得）軽い分子（赤色）は速く走り，重い分子（青色）は遅れて走るので検出器には質量の軽いものから順に検出される（左）．イオンが飛んで行く時間を計測して質量を割り出し，マススペクトルを取得する（右）．StaphylococcusepidermidisStaphylococcusaureusEnterococcusfaecalisPseudomonasaeruginosaHaemophilusinfluenzae図3菌種により異なるスペクトルパターン（マススペクトル）菌種により，それぞれ異なったパターンを示す．脱離およびイオン化レーザーによるマトリックスの励起レーザー光H＋H＋H＋…試料…マトリックス試料台試料台図1質量分析（MALDI-TOF）測定原理1（試料中成分のイオン化）マトリックスという試薬と試料を混合してレーザーを照射し，イオン化する．電極検出器レーザー光飛行時間の測定飛行時間軽い分子の方が速く飛行する（飛行時間が短い）t1質量（m/z）m2m1m3t2t3マススペクトル（MS）相対強度相対強度真空中を飛行加速図2質量分析（MALDI-TOF）測定原理2（イオンの分離とマススペクトルの取得）軽い分子（赤色）は速く走り，重い分子（青色）は遅れて走るので検出器には質量の軽いものから順に検出される（左）．イオンが飛んで行く時間を計測して質量を割り出し，マススペクトルを取得する（右）．StaphylococcusepidermidisStaphylococcusaureusEnterococcusfaecalisPseudomonasaeruginosaHaemophilusinfluenzae図3菌種により異なるスペクトルパターン（マススペクトル）菌種により，それぞれ異なったパターンを示す．属はかなり一致高い確率で菌種一致高い確率で属は一致、種もかなり一致一致していると言えない属はかなり一致高い確率で菌種一致高い確率で属は一致、種もかなり一致一致していると言えない図4同定結果レポートライブラリーとのマッチングで近似性の高い菌株から順に表示，スコア化される．ScoreValueが2.0以上（菌種一致）は緑，1.700～1.999（属一致）は黄色，1.699以下（不一致）は赤で表示される．例では，Rank9位までStreptococcusagalactiaeで，Rank8位までScoreValue2.000以上であるため本菌種と同定した．②Neisseriagonorrhoeae①Serratiamarcescens③Corynebacteriummacginleyi図5従来の同定法①腸内細菌同定用6種類の確認培地によるSerratiamarcescensの同定（18～24時間）．②IDテスト・HN-20ラピッドによるNeisseriagonorrhoeaeの同定（4～6時間）．③APICoryneによるCorynebacteriummacginleyiの同定（24時間）④マススペクトルの取得②マトリックスの添加①ターゲットプレートに塗布③装置に装填図6質量分析法による菌株同定の行程①コロニーを釣菌し，ターゲットプレートに薄く塗布．②マトリックスの添加．③乾燥後，装置に装.．④スペクトルの取得．622あたらしい眼科Vol.32，No.5，2015（12）MALDI-TOFMSの同定結果は16SrRNA解析と一致しており信頼性の高いものであり，迅速性および正確性に優れている同定結果であるといえる．III問題点質量分析装置による同定結果は，16SrRNA解析と比較してかなりの確率で一致しており，同定キットや自動同定機器による生化学的な手法より優れている．しかし，本法はおもにリボソーム由来の蛋白の違いで同定を行っているため，16SrRNAの配列相同性が高い類縁菌種の同定はむずかしい傾向がある．たとえばEscherichiacoli（大腸菌）とShigellaspp.（赤痢菌），またはStreptococcuspneumoniae，Streptococcusmitis，Streptococcusoralisの3菌種のように，相同性が高い類縁菌種においては区別が困難であるといった点を考慮して結果を解釈する必要がある．おわりに以上述べてきたように，質量分析装置による同定は一般細菌だけでなく，抗酸菌，酵母様真菌，糸状菌にも利用できることが大きな利点であり，臨床検査に大きな技術革新をもたらすものであり，臨床の現場に大いに貢献できるものと考える．文献1）大楠清文：知っておきたい質量分析法を用いた細菌の同定，いま知りたい臨床微生物検査実践ガイド．p120～135，医歯薬出版，2013角膜擦過物のグラム染色図7角膜擦過物のグラム染色所見好中球に貪食されたグラム陰性桿菌が確認され，Moraxellaspp.を疑う．MoraxellanonliquefaciensMoraxellalacunataMoraxellaosloensis35℃,CO2,48時間培養後のコロニー（血液寒天培地）図8各種Moraxella属の血液寒天培地上でのコロニーコロニーからMoraxellanonliquefaciens，Moraxellalacunata，Moraxellaosloensisの区別は不可能である．（13）あたらしい眼科Vol.32，No.5，2015623表1Moraxellaspp.の同定結果No.キットMALDI-TOFMS16SrRNA解析1M.non/lacunataM.nonliquefaciensM.nonliquefaciens2M.non/lacunataM.nonliquefaciensM.nonliquefaciens3M.non/lacunataM.nonliquefaciensM.nonliquefaciens4M.non/lacunataM.nonliquefaciensM.nonliquefaciens5M.non/lacunataM.nonliquefaciensM.nonliquefaciens6M.non/lacunataM.nonliquefaciensM.nonliquefaciens7M.non/lacunataM.nonliquefaciensM.nonliquefaciens8M.non/lacunataM.lacunataM.lacunata9M.non/lacunataM.lacunataM.lacunata10M.non/lacunataM.lacunataM.lacunata11M.osloensisM.osloensisM.osloensis12M.osloensisM.osloensisM.osloensisキットはIDテスト・HN-20ラピッドを使用し同定した．キットでMoraxellaosloensisは同定可能であるが，MoraxellanonliquefaciensとMoraxellalacunataは区別できない．MoraxellanonliquefaciensMoraxellaosloensisMoraxellalacunata図9Moraxella属の異なるスペクトルパターン（マススペクトル）キットで区別できなかったMoraxellanonliquefaciensとMoraxellalacunataもマススペクトルが異なるため同定可能である．624あたらしい眼科Vol.32，No.5，2015（14）

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検査編-1：塗抹検査－知っておくべきいくつかのポイント－

2015年5月31日日曜日

特集●眼感染症診断の温故知新あたらしい眼科32（5）：613.617，2015特集●眼感染症診断の温故知新あたらしい眼科32（5）：613.617，2015検査編-1：塗抹検査―知っておくべきいくつかのポイント―Microscopy─SomeKeyPointsthatYouShouldKnow砂田淳子＊はじめに塗抹検査は感染部位で起こっている現象や特徴的な所見を観察することができる重要な検査である．検査材料中の微生物を検出することはもちろん，炎症細胞の種類，数，鮮度などは感染症の病期を推測するうえで重要な情報であり，有効な治療薬を選択する指標となる．I塗抹検査の利点・欠点・注意点1.利点：迅速な感染症情報の入手塗抹検査は標本作成から結果判読まで30分程度で行える迅速性に優れた検査である．検査材料中の菌の特徴（形態・グラム染色性など）や炎症細胞の有無，白血球の貪食像，さらに臨床所見を総合的に判定することにより，起因微生物の推定が可能となる．病巣部に新しい炎症細胞（図1）が多く見られる場合は急性感染症であり，新旧の炎症細胞が混在している場合，感染症が慢性化している可能性が高い．また，炎症細胞がほとんど見られないか古い炎症細胞（図2）のみを認める場合，感染症が治癒に向かっている可能性があるなど炎症細胞を観察することにより感染症の病期の推定をすることができる1）．2.欠点：低い検出感度と結果のばらつき培養検査に比較して，塗抹検査の菌の検出感度は低図1肺炎球菌を貪食している好中球（グラム染色，図2過分葉をした好中球（グラム染色，1,000倍）1,000倍）時間が経過した炎症部では細胞の形が不明瞭で過分葉を起好中球の核と細胞質が明瞭に識別できる．し，4.6核の好中球が見られる．＊AtsukoSunada：大阪大学医学部附属病院臨床検査部〔別刷請求先〕砂田淳子：〒565-0871大阪府吹田市山田丘2-15大阪大学医学部附属病院臨床検査部0910-1810/15/\100/頁/JCOPY（3）613614あたらしい眼科Vol.32，No.5，2015（4）3.スライドへの塗抹検体の塗抹は厚すぎても薄すぎてもよい結果は得られない．検出感度を上げるため，できるだけ多くの材料を塗抹するとよいが，鏡検可能な厚みにする必要がある（逆に広範囲に広げすぎると検鏡に時間がかかる）．材料を厚く塗抹すると乾燥までに時間を要し，細胞の萎縮，変形や染色ムラができるため検鏡がむずかしくなる（図4）．また，染色時に材料が水分を含み流れ落ちることがある．材料が十分ある場合，リング付きスライドの左右のリング内に濃度差（濃い目と薄い目）をつけて塗抹する．そうすることで，一方が観察しにくい場合でも他方にて観察することができる．複数の染色法を実施予定の場合，可能であれば染色法ごとにスライドを用意するとよい．重染色を行うことは可能であるが，単独染色よりも観察がしにくい場合がある．4.塗抹標本の乾燥と固定自然乾燥にて塗抹面を十分乾燥させた後に固定を行う（乾燥を急ぐ場合は，ドライヤーの冷風を用いる）．固定はメタノール固定（約1分）が細胞の変性も少ないため推奨されている．スライド標本を検査室に提出する場合は，標本表面を傷つけないためにスライドケースに入れて搬送する（図5）．5.染色法の選択一般的な細菌・真菌を検出するためにはグラム染色を実施する．しかし，グラム染色では抗酸菌，クラミジア，ウイルスなどの検出ができないため，目的微生物に応じた染色法を選択する必要がある．a.細菌感染症を疑う場合グラム染色を行う．グラム染色は細胞壁の構造によって染色性（グラム陽性：濃青.暗紫色，グラム陰性：ピンク.赤色）が異なるため，抗菌薬選択のひとつの指標となる．グラム染色試薬はフェイバーG法やバーミー変法などがあり，使用する試薬により色調が若干異なる．b.真菌感染を疑う場合グラム染色，ファンギフローラY染色を行う．一般的に真菌は病巣での菌量が細菌よりも少ないとされており，グラム染色よりも観察しやすい蛍光染色を併用するく，菌量が105.106/ml以上存在しないと検出することがむずかしい2）．眼感染症を起こす微生物は細菌，真菌，ウイルス，原虫など多様であり，グラム染色では染まりにくい微生物もいるため，それぞれに適した染色法を実施する必要がある．さらに，検査材料の保存方法や検査実施者の経験によって検査結果にばらつきが生じることがある．3.注意点：新鮮な検体で塗抹する採取後，時間が経った検査材料中では生体細胞が融解し，細胞構造が不鮮明になるため，できるだけ新鮮な材料を用いる．検鏡がすぐに実施できない場合でもスライドガラスに塗抹し，アルコール固定まで行っておくとよい．有効な抗菌薬投与後は微生物や炎症細胞が変形や消失する可能性があるため，起因菌の検出や炎症細胞の確認のためにはできるだけ抗菌薬投与前に材料を採取する．しかし，抗菌薬投与開始後，菌量の減少や炎症細胞の消失を経時的に確認することで治療効果を短時間で判断できる場合がある3）．II塗抹標本作成のポイント1.検査材料の採取と検査項目眼からの検査材料は採取量が少ないため，どの検査項目を実施するかを検査材料採取前に考える必要があり，塗抹・培養・遺伝子検査などの必要量に応じて材料を分割し，採取容器に取り分けておくべきである．検査項目が多く，検体を分割するとそれぞれの検査の検体量が少なくなり，感度（菌の検出率）が低下するが，検査開始後，検体の再分割は不可能であることが多い．2.スライドガラスの選択少量の材料を確実に観察するには，スライドガラスの上のどの位置に材料を塗布したかを明確にしておくことが大切である．市販のリングマーク付きのスライドガラスを用いるか，非水溶性のガラス鉛筆を用いて直径10.15mm程度の円を書き用意するとよい（図3）．漿液性の材料は染色時に水洗で材料が流れてしまうことがあるため，MASコートスライドガラスを用いるとよい．図3ガラス鉛筆とリング付きスライドガラス図4角膜組織片の塊ガラス鉛筆を用いて作成したリング付きスライドガラスと塗抹が厚いため染色液の顆粒が残留し観察がしにくい．市販品（高撥水性印刷黒2穴15fMASコート：松浪ガラス）．図5スライドガラスケース検査室や検査センターへスライドを提出する場合はスライドガラスケースに入れて提出する（塗抹面が傷つかず，他の検査材料が汚染されない）．～図6酵母様真菌（グラム染色，1,000倍）図7糸状菌（グラム染色，1,000倍）検査材料中の酵母様真菌は糸状菌のように発育する．通常検査材料中の真菌は細胞の周りが染まらず，白い縁取りがはグラム陽性に染まるが，染色されず，白色の筋のみが見見える場合がある．える場合がある．図8アカントアメーバ（グラム染色，200倍.1,000倍）細胞質中に空胞と貪食した酵母様真菌が見られる．図9コリネバクテリウムとコアグラーゼ陰性ブドウ球菌（グラム染色，1,000倍）少し脱色しすぎ？塗抹では連鎖状球菌かブドウ球菌かが判定できない場合がある．図10モラクセラ属（グラム染色，1,000倍）グラム陰性球桿菌，一部のモラクセラは莢膜を有する．あたらしい眼科Vol.32，No.5，2015617（7）が抜けない．しかし，新しい検査法である遺伝子検査以上に多くの情報を提供してくれる重要な検査法であることを忘れてはいけない．塗抹検査は培養検査などに比較し操作は非常に簡単であるがその判定はむずかしく，参考となるアトラスを用意しておくとよい．眼感染症学会主催の「塗抹検鏡スキルトランスファー」などの実技講習会に参加することもお勧めである．文献1）菅野治重：感染症所見の読み方1─感染のメカニズム．検査と技術37（増刊号）：916-918,20092）秦野寛：塗抹標本検査．目の感染症（下村嘉一編集），p12-17，金芳堂，20103）相原雅典：感染症所見の読み方2─感染症病期の所見．検査と技術37（増刊号）：919-921,20094）IkedaI,NishimotoK,SakamotoKetal：Alkalinetrypanblueasastainforsuperficialfungi.BrJDermato158：1373-1374,2008すべてのシストが2分間で染色された．実際の検査材料での染色は数症例のみであるが，図11，12のようにアメーバを確認することができた．KOHは細胞を融解し真菌やアメーバシストを観察しやすくするが，KOHとの接触後，アメーバの栄養型は数秒で破壊される．アメーバのシスト型も長時間おくと膨化し，特徴的な形態が観察できなくなるため注意が必要である．まとめ感染症は早期診断・早期治療が予後を決定する．塗抹検査は治療に直結する緊急検査であるため使用する染色液の特徴（利点と欠点）を十分理解し，正しい塗抹検査方法を実施するべきである．近年，抗菌薬の適正使用と耐性菌対策の重要性により，塗抹検査は利用価値が高まりつつある．グラム染色は130年以上前に発表された染色法である．蛍光染色や免疫染色など新しく開発された染色方法もあるが，塗抹検査自体のレトロなイメージab図11コンタクトレンズ保存液中のアカントアメーバシストと栄養型（400倍）シストはトリパンブルーによって染色された（a）が，栄養型は染色されずに活動を続けていた（b）．図12トリパンブルー染色角膜組織中のアカントアメーバシスト．このスライドはすでに乾燥固定されたものであったため，KOH処理は行っていない．ab図11コンタクトレンズ保存液中のアカントアメーバシストと栄養型（400倍）シストはトリパンブルーによって染色された（a）が，栄養型は染色されずに活動を続けていた（b）．図12トリパンブルー染色角膜組織中のアカントアメーバシスト．このスライドはすでに乾燥固定されたものであったため，KOH処理は行っていない．

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