あたらしい眼科

《原著》あたらしい眼科33（6）：895.897，2016cWavefront-guidedLaserInSituKeratomileusisによる回折型多焦点眼内レンズ挿入眼における屈折誤差矯正：術前波面収差解析装置の比較中村邦彦＊1,2大木伸一＊2田中みちる＊2弓山里穂＊2ビッセン宮島弘子＊2南慶一郎＊2＊1たなし中村眼科クリニック＊2東京歯科大学水道橋病院眼科Wavefront-guidedLaserInSituKeratomileusisRefractionCorrectionfollowingImplantationofDiffractiveMultifocalIntraocularLenses：ComparisonofWaveformAberrometerExaminationsKunihikoNakamura1,2）,ShinichiOki2）,MichiruTanaka2）,RihoYumiyama2）,HirokoBissen-Miyajima2）andKeiichiroMinami2）1）TanashiNakamuraEyeClinic,2）DepartmentofOphthalmology,TokyoDentalCollegeSuidobashiHospital回折型多焦点眼内レンズ挿入眼のwavefront-guidedlaserinsitukeratomiluesis（WFG-LASIK）による屈折誤差矯正において，波面収差解析装置による違いを検討した．波面収差解析装置iDesignとWaveScan（AbbotMedicalOptics）を用いて術前検査を行った．WFG-LASIK可能率，術中に虹彩紋理認証（IR）ができた率（IR率）を調べた．術後の自覚屈折，視力，コントラスト感度に差がないか比較した．対象は，iDesign検査症例は24例32眼，WaveScan検査症例は25例32眼であった．IR下でWFG-LASIK可能率は，iDesign検査症例（62.5％）がWaveScan検査症例（15.6％）より有意に高かった（p＝0.0001）．術後の自覚屈折，視力，コントラスト感度には差はなかった．新しい波面収差解析装置を用いたWFG-LASIKは乱視矯正には有効であると考えられた．Inwavefront-guidedlaserinsitukeratomileusis（WFG-LASIK）refractioncorrectionsfollowingimplantationofdiffractivemultifocalintraocularlenses,twowavefrontaberrometers,iDesignandWaveScan（AbbotMedicalOptics）werecompared.RatesatwhichWFG-LASIKwasselectedinpreoperativeexaminationsandirisregistration（IR）wasactivatedduringablationswerecalculated.Manifestrefractions,visualacuitiesbeforeandafterWFG-LASIK,andpostoperativecontrastsensitivitywerecompared.InusesofiDesign,WFG-LASIKwithIRcouldbeconductedin62.5％ofeyes,asignificantlyhighernumberthanwithWaveScan（15.6％,p＝0.0001）.Therewasnosignificantdifferenceinmanifestrefractions,visualacuitiesorcontrastsensitivity.WFG-LASIKwithuseofthenewwavefrontaberrometerwaseffectiveforrefractivecorrections.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）33（6）：895.897,2016〕Keywords：回折型多焦点眼内レンズ，屈折補正，wavefront-guidedLASIK，波面解析装置．diffractivemultifocalintraocularlens,refractioncorrection,wavefront-guidedlaserinsitukeratomiluesis,wavefrontaberrometer.はじめに可能となり，多くの臨床成績が報告されている1,2）．良好な回折型多焦点眼内レンズ（intraocularlens：IOL）を挿入遠近裸眼視力を得るためには，術後の屈折誤差を最小にするすることにより，術後に良好な遠方および近方の裸眼視力がことが求められる．IOL度数による屈折誤差や残留角膜乱視得られ，患者の術後QOL（qualityoflife）が改善することががある場合には，laserinsitukeratomiluesis（LASIK）によ〔別刷請求先〕中村邦彦：〒101-0061東京都千代田区三崎町2-9-18東京歯科大学水道橋病院眼科Reprintrequests：KunihikoNakamura,M.D.,DepartmentofOphthalmology,TokyoDentalCollegeSuidobashiHospital,2-9-18Misaki-cho,Chiyoda-ku,Tokyo101-0061,JAPAN0910-1810/16/\100/頁/JCOPY（135）895る屈折誤差矯正が行われることが多い．とくに，LASIKによる視機能の低下を最小限にするために，波面収差解析結果を用いたwavefront-guided（WFG）LASIKが選択される．WFG-LASIKの優位性は広く知られており，回折型多焦点IOL挿入後の屈折誤差矯正にも使用されている3）．また，このWFG-LASIKでは眼球回旋の影響を抑制するため，虹彩紋理を使ったaxisregistration法であるirisregistration（IR）が用いられる4）．IRの効果は，術前に行う波面収差解析機器の性能に依存し，虹彩紋理の認識率が重要となる．VISXレーザーシステム（AbbotMedicalOptics：AMO）では，波面収差解析装置WaveScan（AMO）を用いて波面収差測定していたが，近年，測定精度が向上した波面収差解析装置iDesign（AMO）が開発された．波面収差の高精度化に加えて，虹彩紋理の認識率の増加も期待される．しかし，国内外で両機器の比較を行った報告はほとんどない．本研究では，回折型多焦点IOL挿入眼に対してWFGLASIKによる屈折誤差矯正を行った症例の診療記録から，2種類の波面収差解析装置の虹彩紋理認識率，術後の視力と屈折値を比較検討した．I対象および方法回析型多焦点IOL挿入後に，2012年以降に東京歯科大学水道橋病院にてWFG-LASIKを用いて屈折誤差矯正を行った．2012年1月.2013年7月には，波面収差解析装置WaveScanを用いて術前検査を行い，2013年8月.2014年6月には波面収差解析装置iDesignを用いた．対象を使用した波面収差解析装置により2群に分けた．波面収差解析装置iDesignとWaveScanは，ともにHartman-Shack式の波面収差装置であり，その解析点数はそれぞれ1,275点，240点と，iDesignのほうが，高精度の収差測定が可能となった．さらに，虹彩紋理と角膜輪部の認証性能も向上された．LASIK術前に，2つの波面解析装置で検査を行い，両解析機器において，WFG-LASIKが可能となった割合（WFG可能率）を検討した．表1WFG-LASIK術前後の自覚屈折と視力iDesign群WaveScan群（n＝24）（n＝16）術前：.0.29±0.82術前：0.06±1.31自覚等価球面度数（D）術後：.0.23±0.31術後：.0.24±0.36術前：.1.07±0.64術前：.0.97±0.78自覚円柱度数（D）術後：.0.36±0.34術後：.0.30±0.34平均遠方視力術前：0.56/1.22術前：0.48/1.17（裸眼/矯正）術後：0.97/1.19術後：0.95/1.16平均近方視力術前：0.46/0.68術前：0.49/0.72（裸眼/遠方矯正下）術後：0.78/0.71術後：0.62/0.70896あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016LASIK手術は，フェムト秒レーザーIntraLaseRFSレーザー（AMO）にてフラップを作製した．WFG-LASIK可能眼に対しては，IRを試みた後に，エキシマレーザーSTARS4IR（AMO）を用いて正視狙いでレーザー照射を行った．WFG-LASIKが可能でなかった眼に対しては，conventionalLASIK（C-LASIK）照射を行った．WFG-LASIK可能眼に対して，IRが使用可能であったか割合（IR可能率）を調べた．WFG-LASIK可能眼に対して，術後1カ月における検査結果を調査した．検討事項は，自覚屈折（透過球面度数と円柱度数），遠方視力（裸眼，矯正），近方視力（裸眼，遠方矯正下），コントラスト感度とした．コントラスト感度は，CSV-1000（VectorVision）を用いて輝度85cd/m2下で測定した．術前後の比較にはWicoxon符号順位和検定，両群の比較には，Mann-WhitneyU検定を用いた．p＜0.05を有意差ありとした．結果は，平均±標準偏差で表示した．II結果対象症例は49例64眼で，WaveScanを用いた症例は25例32眼（平均年齢：64.7±7.3年，以下，WaveScan群），iDesignを用いた症例は24例32眼（平均年齢：65.1±12.5年，iDesign群）であった．挿入IOLの内訳は，アポダイズド回折型多焦点IOLReSTORR（Alcon）が34眼，TecnicMultifocalR（AMO）が26眼，それ以外が4眼であった．WFG可能率は，iDesign群は75.0％，WaveScan群は50.0％だった．WFG-LASIK照射時にIRができたIR可能率は，それぞれ，83.8％，31.3％と，iDesign群が有意に高かった（p＝.0012，Fisher直接確率）．この結果から，各群の全症例に対して，IR下でWFG-LASIK可能であった割合を求めると，iDesign群は62.5％に対してWaveScan群は15.6％と，iDesign群が有意に高かった（p＝.0001）．WFG-LASIK可能であった症例（iDesign群24眼，WaveScan群16眼）における，術前後の自覚屈折と視力の結果を表1に示す．自覚等価球面度数と自覚円柱度数において，両群で術前後の有意に変化がみられた（p＜.03，＜0.001）が，術後において群間差はなかった．視力においては，遠方，近方とも両群で裸眼視力は術後に有意に改善した（p＜.001，＜.003）が，術後において群間差はなかった．術後のコントラスト感度を図1に示す．測定可能症例数は，iDesign群は11眼，WaveScan群は15眼であった．全空間周波数において，群間に差はなかった．III考按回折型多焦点IOL挿入後のLASIKによる屈折誤差補正の効果を，2種類の波面収差測定装置で比較した．iDesign群（136）は，IR下でのWFG-LASIK照射がより高い割合で実施できた．しかし，自覚屈折，裸眼視力，コントラスト感度において，波面収差測定装置による差異はみられなかった．LASIKによる屈折誤差補正は，回折型多焦点IOLでは有効であったことは，Jendritzaらも報告している3）．Muftuogluらは，アポダイズ回折型多焦点IOLの屈折誤差補正において，conventionalLASIKとWFG-LASIKによる術後視力の差がないと報告している5）．一方，多焦点IOL挿入眼において，IRとWFG-LASIKを使用することで術後収差に有意な改善はみられないが，大きな劣化はないことが報告されている3）．本検討でも，WFG-LASIKによる屈折誤差が有効であると示唆された．iDesign群では，IR有のWFG-LASIKが62.5％の症例で可能であった．屈折誤差のうち球面度数成分はLASIKにより比較的安定して矯正できるが，円柱度数成分では度数に加えて軸ずれが問題となる．仰位への姿勢変化による眼回旋（平均4.4±2.8°程度）により生じた軸ずれにより，1°の軸ずれに対して約3％，乱視矯正効果が低下する6）．IRにより眼回旋の影響を最小限にすることが可能であるが4），本検討では，WaveScan群は84.4％でIRが行われていなかったにもかかわらず，自覚円柱度数に差はなかった．これは，矯正度数が，比較的低かったためと考えられた．混合乱視症例の検討では，IR機能有無効果は，高次収差，術後視機能に影響することが検証されている7）．多焦点IOLへの適用となる角膜乱視度数は，トーリック多焦点IOLの開発に伴って拡大しつつある．高度な角膜乱視を有するためにトーリック多焦点IOLを挿入した場合，IRなどのaxisregistration法を用いたLASIK乱視矯正を選択することが必須になると予想される．より度数の高い円柱度数を矯正する場合は，IR機能が重要となるため，IR可能率が高いiDesignの使用が望ましいと考える．【文献】1）AgrestaB,KnorzMC,KohnenTetal：Distanceandnearvisualacuityimprovementafterimplantationofmultifocalintraocularlensesincataractpatientswithpresby2.01.51.00.50.0空間周波数図1iDesign群とWaveScan群のコントラスト感度全周波数において有意な群間差はなかった．opia：asystematicreview.JRefractSurg28：426-435,20122）deVriesNE,NuijtsRM：Multifocalintraocularlensesincataractsurgery：literaturereviewofbenefitsandsideeffects.JCataractRefractSurg39：268-278,20133）JendritzaBB,KnorzMC,MortonS：Wavefront-guidedexcimerlaservisioncorrectionaftermultifocalIOLimplantation.JRefractSurg24：274-279,20084）MoshirfarM,ChenMC,EspandarLetal：EffectofirisregistrationonoutcomesofLASIKformyopiawiththeVISXCustomVueplatform.JRefractSurg25：493-502,20095）MuftuogluO,PrasherP,ChuCetal：Laserinsitukeratomileusisforresidualrefractiveerrorsafterapodizeddiffractivemultifocalintraocularlensimplantation.JCataractRefractSurg35：1063-1071,20096）SuzukiA,MaedaN,WatanabeHetal：Usingareferencepointandvideokeratographyforintraoperativeidentificationofastigmatismaxis.JCataractRefractSurg23：1491-1495,19977）KhalifaM,El-KatebM,ShaheenMS：Irisregistrationinwavefront-guidedLASIKtocorrectmixedastigmatism.JCataractRefractSurg35：433-437,2009対数コントラスト感度iDesignWaveScan3cpd6cpd12cpd18cpd＊＊＊（137）あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016897

《原著》あたらしい眼科33（6）：889.893，2016c国立病院機構東京医療センターにおける最近1年間の角膜移植成績および術式別短期視力評価秦未稀＊1,2福井正樹＊1,2,3水野嘉信＊1大野健治＊1,4野田徹＊1＊1国立病院機構東京医療センター眼科＊2慶應義塾大学医学部眼科学教室＊3南青山アイクリニック＊4東京慈恵会医科大学附属病院眼科SurgicalResultsofKeratoplastyatTokyoMedicalCenteroverOne-YearPeriodMikiHata1,2）,MasakiFukui1,2,3）,YoshinobuMizuno1）,KenjiOhno1,4）andToruNoda1）1）DepartmentofOphthalmology,NationalHospitalOrganization,TokyoMedicalCenter,2）UniversitySchoolofMedicine,3）MinamiaoyamaEyeClinic,4）DepartmentofOphthalmology,KeioDepartmentofOphthalmology,JikeiUniversitySchoolofMedicine目的：国立病院機構東京医療センター（NTMC）での過去1年間の角膜移植術の成績を検討した．方法：2014年1月1日.12月31日の間にNTMCで行った角膜移植術47例51眼の原因，術式，合併症，術後6カ月までの視力を後方視的に検討した．結果：原因は水疱性角膜症19眼（37％），再移植14眼（23％），角膜穿孔6眼（12％），その他（40％）であった．術式は全層移植術18眼（35％），内皮移植術18眼（35％），深層層状移植術10眼（24％），層状移植術15眼（10％）であった．合併症は術後二重前房7眼（14％），術中水晶体・眼内レンズ脱臼4眼（8％），術後高眼圧4眼（8％），その他9眼（18％）であった．矯正視力（logMAR換算）は術前平均で1.60±0.85，術後最高視力平均で0.69±0.66，術前より0.2以上改善したのが45眼（88％）であった．術式別視力上昇率では術後2週目に全層移植術が深層層状移植術より有意な視力上昇を認めた．結論：角膜移植術の術式が多様化したことで既報の合併症，術後視力から変化があったと考えられる．Wereporttheresultsofastudyof51eyesthatunderwentkeratoplastyattheDepartmentofOphthalmology,TokyoMedicalCenter,in2014.Theresultswerestudiedretrospectivelyforalleyesthathadundergonepenetratingkeratoplasty（PKP）,deeplamellarkeratoplasty（DALK）,endothelialkeratoplasty（EK）orlamellarkeratoplasty（LKP）.Theindicationswerebullouskeratopathy（19eyes）,replantation（14eyes）,cornealtrauma（6eyes）,andother（12eyes）.EKwasperformedon18eyes,PKPon18eyes,DALKon10eyesandLKPon5eyes；88％oftheeyesshowedpostoperativevisualacuityimprovementofmorethantwostepsonavision-testingchart.Wealsoevaluatedthevisualacuityimprovementrate,whichrevealedthatPKPimprovedsignificantlyearlierthanDALK.Themostcommoncomplicationwasdoublechamber（14％）.Wesuggestthatvisualacuityimprovementpost-surgeryandthedecreaseinseverecomplicationsareduetochangesinoperativeprocedures.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）33（6）：889.893,2016〕Keywords：角膜パーツ移植，視力上昇率，原因疾患，合併症．componentsurgeryofthecornea,improvementrateofvisualacuity,primarydisease,complication.はじめに角膜移植術は1905年E.Zirmが全層角膜移植を成功させた1）ことに始まり，全層角膜移植術（penetratingkeratoplasty：PKP），表層角膜移植術（lamellarkeratoplasty：LKP）の2種類に加え，20世紀末から，角膜移植の革命ともいわれるパーツ移植の概念・技術が進歩した．病変部のみを治療の標的として行うパーツ移植に，実質を標的とする深層角膜移植（deeplamellarkeratoplasty：DALK），内皮を標的とする内皮移植（endotherialkeratoplasty：EK）などが登場し，角膜移植術式の選択肢が広がったと考えられる2）．〔別刷請求先〕秦未稀：〒152-8902東京都目黒区東が丘2-5-1国立病院機構東京医療センター眼科Reprintrequests：MikiHata,M.D.,NationalInstituteofSensoryOrgans,NationalTokyoMedicalCenter,2-5-1Higashigaoka,Meguro-ku,Tokyo152-8902,JAPAN0910-1810/16/\100/頁/JCOPY（129）889また，術中の眼球解放状態（opensky）に伴う水晶体脱臼や駆逐性出血，拒絶反応，屈折異常などの合併症が低減できると考えられる．術式の多様化および普及に伴い，これまで多数の施設で角膜移植の成績が検討されている3.7）．今回，筆者らは，2014年1年間に国立病院機構東京医療センター（NationalHospitalOrganizationTokyoMedicalCenter：NTMC）で行った角膜移植術の内容を検討し，これらと2007年および2010年のNTMCで行った角膜移植術症例および既報3.7）を比較した．また，2014年の症例に関して，手術成績や短期の術式別の視力改善の早さを含めた考察を加え報告する．I対象および方法対象は2014年1月1日.12月31日の1年間に，NTMCで角膜移植眼を行った47例51眼（男性24症例25眼，女性23症例26眼），平均年齢は66.3±18.9歳（17.93歳）であった．対象症例について，原因疾患，術式〔PKP，EK（Descemetstrippingautomatedendotherialkeratoplasty（DSAEK）またはnon-Descemetstrippingautomatedendotherialkeratoplasty（nDSAEK），DALK，LKP〕，視力変化，合併症を後方視的に検討した．視力変化率はlogMAR換算視力（0.1未満の視力はlogMAR換算視力3.0とした）で術前から.0.2以下の変化を改善，＋0.2以上の変化を悪化とし，.0.2より大きく0.2より小さい変化を不変と定義した．また，術後1週間ごとの視力を評価するために視力上昇率を（術後logMAR換算視力-術前logMAR換算視力）÷（術後6カ月間でのlogMAR換算最高視力-術前logMAR換算視力）×100とし，PKP，DALK，EKの術式ごとに4週間の期間で検討した．また，術式間に有意差があるかをMann-WhitneyU検定を行い，有意水準5％で判定を行った．合併症は術中および術後6カ月以内に起きたものを検討した．Primarygraftfailureは角膜移植後一度も透明化しなかったものと定義した．なお，原因疾患，術式，合併症については2007年および2010年にNTMCで行った角膜移植および既報3.7）を比較した．II結果1.原因疾患原因疾患は水疱性角膜症19眼（37％），再移植14眼（23％），角膜穿孔6眼（12％），角膜変性症4眼（10％），角膜混濁4眼（10％），円錐角膜3眼（6％），角膜拡張症1眼（2％）であった．再移植の内訳は，PKP，EK後の移植片機能不全がそれぞれ8眼，2眼，角膜穿孔2眼，角膜混濁1眼，残り1眼はDALK後二重前房が消退せずPKPを行った症例であった（図1a）．890あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016過去の移植例，既報3.7）との比較では，水疱性角膜症と角膜変性の割合が経時的に増えており，角膜混濁の割合が減っているように感じられた（図1b）．2.術式角膜移植術を行った全51眼の術式の内訳は，PKP：18眼（35％）〔うち2眼が水晶体.外摘出術（ECCE）＋眼内レンズ（IOL）挿入術併用〕，EK：18眼（35％），DALK：10眼（24％），LKP：5眼（10％）であった．EKは水疱性角膜症18眼に行い，PKP18眼は水疱性角膜症12眼（うち9眼が再移植，2眼がECCE＋IOL併用），円錐角膜2眼，角膜混濁2眼（うち1眼が再移植），角膜変性症1眼，角膜穿孔1眼（再移植）であった．円錐角膜2眼は術中Descemet膜穿孔しPKPに術式変更した症例であった．DALK10眼は角膜変性症4眼，角膜混濁3眼，円錐角膜2眼，角膜拡張症1眼，LKP5眼はすべて角膜穿孔に行った（図1c）．過去の移植例，既報3.7）との比較ではEKとDALKの割合が経時的に増えており，PKPの割合が減っているように感じられた（図1d）．3.視力変化角膜移植全体のlogMAR換算視力は術前平均1.60±0.85，術後6カ月以内の最高視力平均0.69±0.66であった．術式ごとでは術前平均/術後6カ月以内の最高視力平均でPKP2.04±0.89/0.86±0.70，EK1.29±0.47/0.39±0.32，DALK1.16±0.88/0.76±0.57，LKP1.81±1.04/1.17±1.60であった（表1）．視力変化率（％）は改善/不変/悪化の順に角膜移植全体で88.2/11.1/2.0，PKPで88.9/3.9/0，EK100/0/0，DALK70/20/10，LKP80/20/0であった（表1）．術式別の視力上昇率（％）は1週，2週，3週，4週の順にPKP.8.5±147.85，67.9±29.0，51.4±60.2，60.9±29.0，EK12.0±75.3，34.9±53.5，45.1±34.5，64.7±42.5，DALK.30.1±85.9，11.4±52.9，14.1±58.2，70.2±55.0であった．2週目でPKPがDALKに比べて有意に上昇率が高く（p＝0.040），PKPがEKに比べ上昇率が高い傾向にあった（p＝0.053）が，その他は術式間で有意な差を認めなかった（図2）．4.合併症術中合併症は水晶体・IOL眼脱臼4眼（PKP4眼），Descemet膜穿孔（PKPへ術式変更）2眼，（DALK2眼），術後合併症は二重前房がもっとも多く7眼（DALK6眼，EK1眼），ステロイド起因性緑内障4眼（PKP2眼，DALK2眼），graft離開3眼（PKP1眼，LKP2眼），primarygraftfailure2眼（EK2眼），細菌性角膜炎1眼（PKP1眼），ヘルペス角膜炎再発1眼（PKP1眼）であった（表2）．なお，当院での角膜移植では重篤な合併症の代表である駆逐性出血，感染（130）表1国立病院機構東京医療センター（NTMC）1年間の角膜移植術前および術後最高logMAR換算視力の成績平均術後最高視力術前logMAR換算視力術後最高logMAR換算視力上昇不変悪化全症例49眼1.60±0.850.69±0.6643眼（88.2％）5眼（11.1％）1眼（2.0％）PKP18眼2.04±0.890.86±0.7016眼（88.9％）2眼（11.1％）0眼（0.0％）EK18眼1.29±0.470.39±0.3218眼（100.0％）0眼（0.0％）0眼（0.0％）DALK10眼1.16±0.880.76±0.577眼（70.0％）2眼（20.0％）1眼（10.0％）LKP3眼1.81±1.041.17±1.602眼（66.7％）1眼（33.3％）0眼（0.0％）PKP：全層角膜移植術，EK：角膜内皮移植術，DALK：深層層状角膜移植術，LKP：層状角膜移植術視力はlogMAR換算視力（0.1未満の視力はlogMAR換算視力3.0と定義）．視力変化率を示す，術後最高視力の「上昇」・「不変」・「悪化」はlogMAR換算視力で術前から.0.2以下の変化を「改善」，＋0.2以上の変化を「悪化」とし，.0.2より大きく0.2より小さい変化を「不変」と定義した．（131）あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016891原因疾患の内訳角膜拡張性1眼水疱性角膜症30眼（再移植11眼）角膜混濁5眼（再移植1眼）角膜穿孔円錐角膜6眼（再移植2眼）角膜変性症5眼4眼ac図1角膜移植術の原因疾患および術式の内訳：国立病院機構東京医療センター（NTMC）および既報の比較PKP：全層角膜移植術，EK：角膜内皮移植術，DALK：深層層状角膜移植術，LKP：層状角膜移植術，ALTK：表層角膜移植．a：国立病院機構東京医療センター（NTMC）の2014年1年間の角膜移植術の原因疾患の内訳．b：角膜移植術の原因疾患の内訳；2014年・2007年・2010年のNTMCおよび既報の比較．c：NTMCの2014年1年間の角膜移植術式の内訳．d：角膜移植術式の内訳；2014年・2007年・2010年のNTMCおよび既報の比較．なお，b.およびd.の既報は文献3.7）より作成PKP18眼（うち2眼がECCE＋IOL併用）EK18眼DALK10眼LKP5眼■PKP■EK■DALKLKP■ALTKNTMC2014.1～2014.12NTMC2010.1～2010.12NTMC2007.1～2007.12富山大学2004.2～2010.5東京医科歯科大学2000.6～2002.10秋田大学1993.1～2002.1今泉西病院1982～2002旭川医科大学1997～2001角膜移植術式の内訳35.3％35.3％19.6％9.8％20.7％10.3％6.9％13.8％48.3％63.6％9.1％15.2％6.1％6.1％7.5％12.5％80.0％100.0％88.0％6.0％6.0％10.7％3.3％86.0％91.7％2.8％5.6％100％90％80％70％60％50％40％30％20％10％0％NTMC2014.1～2014.12NTMC2010.1～2010.12NTMC2007.1～2007.12富山大学2004.2～2010.5東京医科歯科大学2000.6～2002.10秋田大学1993.1～2002.1今泉西病院1982～2002旭川医科大学1997～2001bd58.8％19.6％11.8％9.8％10.3％10.3％17.2％27.6％34.5％27.3％24.2％3.0％39.4％6.1％10.0％30.0％20.0％15.0％25.0％44.8％13.8％10.3％31.0％60.0％10.0％6.0％24.0％35.8％12.0％11.7％40.5％52.8％14.8％5.6％26.9％100％90％80％70％60％50％40％30％20％10％0％水疱性角膜症■角膜変性■角膜穿孔■角膜混濁■その他性眼内炎はなく，半年間での術後経過観察期間ではあるが拒絶反応も認めなかった．III考按パーツ移植の開発・普及に伴い，角膜移植はこの20年間，術式，合併症，視力予後と大きく変化したと考えられる．当院の過去の症例および既報3.7）では全術式中でPKPがもっ250200150100視力上昇率（％）術後週数（週）500－50Mann-Whitney-U※p＝0.040※※p＝0.053※※※全層角膜移植内皮移植深層層状角膜移植01234図2術後4週間の術式別視力上昇率視力上昇率（％）＝（術後logMAR換算視力.術前logMAR換算視力）（術後6カ月間での最高logMAR換算視力.術前logMAR換(÷)算視力）×100術後1,3,4週では各術式間に有意な差はないが，術後2週で全層角膜移植が深層層状角膜移植より有意に上昇率が高く，内皮移植より上昇率が高い傾向にあった．とも多かったが，2014年1年間の術式を対象とした本検討では，PKP，EKが同数であり，層状移植（DALK＋LKP）もそれに匹敵する症例数となっている．EK，DALKでは対象とする疾患が異なるため，今後両者の占める割合の変化は原因疾患の変化によると考えられるが，過去にPKPを行っていた疾患でパーツ移植が適応になる疾患はパーツ移植に移行していくと考えられ，PKPの割合が今後も減るのではないかと考えられる．しかし，NTMCでの全層移植は再移植が多いのが特徴であり，これはNTMCの角膜移植術が2003年から行われており，10年以上の歴史があることによると思われる．PKPの再移植はPKPで行うことが多いことから，近い将来にPKPの需要がなくなることはないと考える．NTMCにおける角膜移植術の原因疾患は水疱性角膜症が多く，NTMCの過去症例および既報と異なる点である．これは水疱性角膜症の増加，他の疾患の減少があり得るが，増加の要因としては角膜内皮移植術，とくにDSAEK，nDSAEKが普及してその成績や術式が安定してくると，これまで角膜内皮数が少なかったり，内皮機能が悪いと考えられたりした症例にも，白内障をはじめとする内眼手術を積極的に行うことができるようになるからと考えられる．また，日本人の寿命が延びれば延びるほど水疱性角膜症の症例数は理論的に増えると考えられる．一方，他疾患の減少の要因であるが，遺伝性疾患や円錐角膜などの変性疾患の割合は変わらないと考えられるが，梅毒性角膜実質炎後や結核性角膜実質炎後などの感染性角膜実質炎後の角膜混濁は，感染の制御が進んでい表2角膜移植術の合併症の内訳：国立病院機構東京医療センター（NTMC）および既報の比較術中合併症駆逐性出血水晶体・IOL脱臼硝子体脱出虹彩損傷NTMC（2014）51眼4NTMC（2010）29眼1NTMC（2007）33眼2東京医科歯科大学29眼秋田大学50眼旭川医科大学108眼411術後合併症眼内炎Primarygraftfailure拒絶反応Graft離開PKP二重前房高眼圧感染症他術式変更NTMC（2014）232742NTMC（2010）131NTMC（2007）1342東京医科歯科大学1314秋田大学139旭川医科大学1142PKP：全層角膜移植術．上：角膜移植術中の合併症の内訳；国立病院機構東京医療センター2014年・2010年・2007年および既報の比較．下：角膜移植術後の合併症の内訳；国立病院機構東京医療センター2014年・2010年・2007年および既報の比較．なお，既報は文献3,5,6）より作成．892あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016（132）ることから減少している可能性がある．これらの理由あるいは両者の理由から，水疱性角膜症の増加が反映されているかもしれない．さて，今回筆者らは短期の術後視力推移を，視力上昇率を求めることで評価した．通常は術後の視力を最終視力や術前からの視力の上昇で評価することが多いが，もともと術後視力が1.0以上を期待できなかったり，術式で最終の期待視力が異なったり，併存疾患があっても評価ができる方法として視力上昇率を用いた．これにより，各手術での術後の視力の立ち上がりの早さを比べることができると考えられる．本研究では直近の手術を検討したため術後の経過観察期間が短いこと，施設によってはルーチンに角膜移植後6カ月以降で縫合糸抜糸を行うところがあることから，6カ月以内での術前視力，術後最高視力を用いて視力上昇率を求めた．その結果，術後4週間での術式別視力上昇率は，1，3，4週目では有意差がないものの，2週目でPKPがDALKより有意に上昇が早く，PKPがEKより上昇が早い傾向がみられた．これはPKP，EK，DALKの順に視力上昇が得られることが示唆され，層間接着の要素が必要なEK，層間接着と縫合といったEKとPKPの両方の特徴を兼ねるDALKがさらに上昇が遅延することを示唆していると推測される．合併症については当院では観察期間が6カ月と短期間であるため，拒絶反応の発症率は0％であったが，これは角膜パーツ移植の増加に伴い拒絶反応の発症率を抑制した可能性も期待したい．術後眼内炎や駆逐性出血が起きていないのも同様の理由である．一方，パーツ移植が増えたことで術後二重前房，DALK術中のDescemet膜穿孔といった術中の手技にかかわる合併症が多い結果となっている．今回，筆者らは1年間の組み入れ期間，半年間の観察期間という短期の検討を行ったが，過去の報告と比べること，また，視力上昇率という新たな指標を用いることでパーツ移植という角膜移植の新時代の現況を評価できたと考える．これをさらに継続して検討していくことで，より正確な状況や継時的な変化も評価できると考える．角膜移植は手術手技が多様化したことにより，今後ますます手術の特徴を考慮し，個々の患者背景に合わせて術式を選択していく必要があると考える．文献1）ZirmEK：EineerfolgreichetotaleKeratoplastik（Asuccessfultotalkeratoplasty）.1906.RefractCornealSurg5：258-261,19892）福井正樹，榛村重人：角膜パーツ移植．眼科54：639-647,20123）村松治，五十嵐羊羽，花田一臣ほか：旭川医科大学眼科における過去5年間の角膜移植術の成績．あたらしい眼科21：1229-1232,20044）星兵仁，川島千鶴子，百瀬皓：今泉西病院における角膜移植手術20年の成績．眼紀56：264-269,20055）早川宏一，昆野清輝，徐カイイほか：秋田大学眼科における角膜移植成績．眼紀55：475-478,20046）山田由希子，佐々木秀次，佐々木環ほか：東京医科歯科大学眼科における角膜移植術後成績．あたらしい眼科20：1699-1702,20037）矢合隆昭，柳沢秀一郎，柚木達也ほか：最近6年間の角膜移植手術成績．臨紀4：609,2011＊＊＊（133）あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016893

《原著》あたらしい眼科33（6）：875.887，2016c細菌性外眼部感染症分離菌株のGatifloxacinに対する感受性調査（2005，2007，2009および2014年のまとめ）末信敏秀＊1松崎薫＊2小山英明＊2岸直子＊2松本哲＊2秦野寛＊3＊1千寿製薬株式会社研究開発本部育薬研究推進部＊2株式会社LSIメディエンス＊3ルミネはたの眼科InvestigationofBacterialIsolatesRecoveredfromOcularInfections,RegardingSusceptibilityToshihideSuenobu1）,KaoruMatsuzaki2）,HideakiKoyama2）,NaokoKishi2）,SatoruMatsumoto2）andHiroshiHatano3）1）MedicalScienceDepartment,SenjuPharmaceuticalCo.,Ltd.,2）LSIMedienceCorporation,3）LumineHatanoEyeClinic細菌性外眼部感染症由来の各種臨床分離株のgatifloxacin（GFLX）および他の点眼用抗菌薬に対する感受性動向を検討するため，2005年，2007年，2009年および2014年の各1年間に，全国の一次医療機関の細菌性外眼部感染症患者より分離された2,498菌株を対象に，GFLXおよびその他の点眼用抗菌薬に対する感受性を測定した．グラム陽性菌では，計4回の調査を通じてGFLXに対する感受性の低下は認められず，moxifloxacin（MFLX）およびtosufloxacin（TFLX）に対する感受性とほぼ同等であった．また，2014年分離株のうちStreptococcusspp.およびEnterococcusspp.はlevofloxacin（LVFX）よりも，Corynebacteriumspp.はMFLXおよびLVFXよりも，GFLXに高い感受性を示した．一方，グラム陰性菌においても，GFLXに対する感受性の低下は認められず，LVFXおよびTFLXに対する感受性とほぼ同等であった．また，2014年分離株のうちPseudomonasaeruginosaはMFLXよりもGFLXに高い感受性を示した．以上，2004年の発売から10ヵ年にわたって，外眼部感染症分離菌のGFLXに対する感受性に経年的な耐性化傾向は認められなかったことから，GFLXは細菌性外眼部感染症に対して有用な抗菌薬であると考えられた．Isolatesrecoveredfromocularinfectiouspatientsbetween2005and2014wereassessedinvitroregardingtheirsusceptibilitiestogatifloxacin（GFLX）andotherophthalmicantimicrobialagents.TheinvitroactivityofGFLXagainsttheisolateswascomparedtothatoflevofloxacin（LVFX）,tosufloxacin（TFLX）,moxifloxacin（MFLX）andcefmenoxime（CMX）.TheactivitiesofGFLXagainstgram-positiveand-negativebacteriascarcelychangedduringtheinvestigationperiod.TheactivityofGFLXagainstgram-positiveisolatewasalmostequaltothoseofMFLXandTFLX.Againstgram-negativeisolates,GFLXantibacterialactivitywasalmostequaltothoseofLVFXandTFLX.SinceGFLXdidnotexhibitdiminishedactivityduringtheperiodofthisinvestigation,theagentisconcludedtobepotentlyactiveagainstbacterialisolatesfromocularinfectiouspatients.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）33（6）：875.887,2016〕Keywords：ガチフロキサシン，感受性，サーベイランス，フルオロキノロン，眼感染症．gatifloxacin,susceptibility,surveillance,fluoroquinolones,ocularinfection.はじめにGatifloxacin（GFLX）点眼薬が2004年に上市されてから10年が経過するなか，筆者らは2005年，2007年および2009年の計3回，外眼部感染症分離菌のGFLXに対する感受性を検討し，経年的な耐性化傾向を認めなかったことを報告した1）．現時点においても，GFLXをはじめとするフルオロキノロン系点眼薬は，細菌性外眼部感染症に対する第一選択薬の座を譲っていない．言い換えれば，フルオロキノロン系薬に代わる新しい作用機序をもつ有用な抗菌薬が，世に登場していないともいえる．フルオロキノロン系薬は，細菌のDNA合成に関与するDNAgyraseおよびtopoisomeraseIVという酵素を阻害することで抗菌活性を示し，GFLXでは，〔別刷請求先〕末信敏秀：〒541-0046大阪市中央区平野町2-5-8千寿製薬株式会社研究開発本部育薬研究推進部Reprintrequests：ToshihideSuenobu,MedicalScienceDepartment,SenjuPharmaceuticalCo.,Ltd.,2-5-8Hiranomachi,Chuo-ku,Osaka541-0046,JAPAN0910-1810/16/\100/頁/JCOPY（115）875表1試験菌株各回の収集株数試験菌目標収第1回第2回第3回第4回集株数（2005年）（2007年）（2009年）（2014年）StaphylococcusStaphylococcusaureus（Methicillin-susceptibleS.aureus：MSSA，100100100100100Methicillin-resistantS.aureus：MRSA）CoagulasenegativeStaphylococcus（CNS）100100100100100StreptococcusStreptococcuspneumoniae5050505050Streptococcusspecies（S.pneumoniae以外）2525252525Enterococcusspecies2525252525Corynebacteriumspecies2525252525Moraxella（Branhamella）catarrhalis2525252525EnterobacteriaceaeCitrobacterspecies1010101010Klebsiellaspecies1010101010Serratiaspecies2525252525Morganellamorganii1010101010NonglucosefermentativegramnegativerodPseudomonasaeruginosa5050505050Pseudomonasspecies（P.aeruginosa以外）2525252525Sphingomonaspaucimobilis2576187Stenotrophomonasmaltophilia1010101010Acinetobacterspecies2525252525Haemophilusinfluenzae5050505050嫌気性菌Propionibacteriumacnes5050505050計640622621633622キノロン環8位のメトキシ基が両酵素の阻害活性を高め，変異株の出現頻度低減に寄与することで，耐性菌が生じにくいことが示唆されている2）．一方，抗菌薬にとって，その使用量に伴う耐性化は一般的に不可避である．したがって，継続的に新規作用機序を有する抗菌薬の創薬が必要である一方，既存薬の適正使用を推進し耐性化を最小限に止めることが重要である．すなわち，医療現場における適正使用の根拠となる「推定起因菌の感受性動向」の情報に基づいて，適切な抗菌薬が選択される必要がある．そこで筆者らは，継続して眼科臨床分離株の感受性を監視し，感受性動向の情報を医療現場と共有することが重要であると考え，前回報告の2009年から5ヵ年が経過した2014年に分離された細菌性外眼部感染症由来の各種臨床分離株のGFLXおよび他の点眼用抗菌薬に対する感受性を検討することを目的として，4回目の調査を実施したので報告する．なお，本調査は感受性動向を把握することを主たる目的とすることから，過去の成績1）とあわせて報告する．876あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016I材料および方法1.試験薬剤今回の試験では，継続的な感受性動向の調査対象薬剤としてgatifloxacin（GFLX），levofloxacin（LVFX），tosufloxacin（TFLX），moxifloxacin（MFLX）およびcefmenoxime（CMX）に加え，erythromycin（EM）およびtobramycin（TOB）の7薬剤を用いた．なお，Staphylococcusspp.にはoxacillin（MPIPC），StreptococcuspneumoniaeにはpenicillinG（PCG），Haemophilusinfluenzaeにはampicillin（ABPC）を追加した．2.試験菌株表1に示した菌種について，各回（1年間）における目標収集株数を設定し，全国の一次医療機関の細菌性外眼部感染症患者より検体採取，分離，同定された順に，目標株数に達するまでの収集菌株（総数2,498株）を試験菌株とした．試験菌株は分離後，最小発育阻止濃度（MIC）測定時まで保存液（スキムミルク）中にて.70℃以下で保存した．なお，これらの試験菌株は，「疫学研究に関する倫理指針」（平成14（116）年文部科学省・厚生労働省告示第2号）を遵守して使用した．3.薬剤感受性測定試験菌株の薬剤感受性測定は，ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute（CLSI）に準じた微量液体希釈法にて実施した．微量液体希釈法による測定にはフローズンプレート（栄研化学）を使用した．測定培地は，S.pneumoniae，Streptococcusspp.およびCorynebacteriumspp.については，2％ウマ溶血液添加cation-adjustedMuellerHintonbroth（CAMHB）を用い，H.influenzaeにはHTMbroth（hematin15μg/mL，b-NAD15μg/mLおよびyeastextract0.5％添加CAMHB）を用い，その他の好気性菌にはCAMHBを用いた．嫌気性菌については，5％馬溶血液添加brucellabroth（hemin5μg/mLおよびvitaminK11μg/mLも添加）を用いた．好気性菌は約5×104.1×105CFU/well，嫌気性菌は約1.2×105CFU/wellとなるように各wellに菌を接種後，好気性菌は35℃，20.24時間，好気培養，嫌気性菌は35℃，46.48時間，嫌気培養を行った．判定は，対照に用いた薬剤不含有培地における菌の発育を確認した後，菌の発育が認められない最小薬剤濃度をMICとした．4.耐性基準各菌種の耐性の定義はCLSIの基準に従い，以下のとおりとした．S.aureusは，MPIPCのMIC値が2μg/mL以下のものをsusceptible（MSSA），4μg/mL以上のものをresistant（MRSA）とした．coagulasenegativeStaphylococcus（CNS）は，MPIPCのMIC値が0.25μg/mL以下のものをsusceptible（MSCNS），0.5μg/mL以上のものをresistant（MRCNS）とした．S.pneumoniaeはPCGのMIC値が0.06μg/mL以下のものをsusceptible（PSSP），0.12.1μg/mLのものをintermediate（PISP），2μg/mL以上のものをresistant（PRSP）とした．5.GFLXと対象薬剤のMIC値の相関過去3回の調査結果から，GFLXのMICrangeが比較的幅広いことが予測される菌種について，GFLXと対象薬剤のMIC値との相関について検討した．すなわち，第4回調査の分離株のうち，S.aureusおよびCNS（各100株）に対するMPIPC，CMX，EMおよびTOBのMIC値との相関をSpearman順位相関係数を用いて検討した（JMP10forWindows,SASInstituteInc,Cary,NorthCarolina,USA）．同様に，Corynebacteriumspp.（25株）およびPseudomonasaeruginosa（50株）についてはCMX，EMおよびTOBのMIC値との相関について検討した．また，MIC値相関の検討では，羽藤らの報告3）を参考に，（117）分位点密度を等高線パターンとして描出（同JMP10）し，視覚的な評価を試みた．II結果1.グラム陽性菌2005年（第1回），2007年（第2回），2009年（第3回）および2014年（第4回）の各年に外眼部感染症患者から分離された菌株に対する各種抗菌薬のMICの成績を表2に示した．その結果，4回の調査においてS.aureus100株に占めるMRSAの割合は20％程度で，GFLXのMIC90は32.128μg/mLであり大きな変動は認められず，MFLXのMIC90は32.64μg/mL，LVFXおよびTFLXのMIC90は，それぞれ＞128および＞16μg/mLであった．また，MSSAに対するGFLXのMIC90は0.12.0.25μg/mLであり，他のフルオロキノロン系薬と同様に大きな変動は認められなかった．CNSに占めるMRCNSの割合は40％程度であり，GFLXのMIC90は2μg/mLで，過去3回の調査成績と変化はなかった．また，MSCNSについては，GFLXのMIC90は0.12.2μg/mLであり，第4回調査でもっとも高かったが，他のフルオロキノロン系薬についても同様の傾向を示した．PSSPおよびPISPに対するGFLXのMIC90は4回の調査を通じて0.25.0.5μg/mLであり，MFLXおよびTFLXと同等であった．また，PRSPの収集株数は，すべての調査において10株未満と少なかったが，GFLXのMICはPSSPおよびPISPに対するMICとほぼ同等であった．Streptococcusspp.に対するGFLXのMIC90は4回の調査を通じて0.5μg/mLであり，変動は認められなかった．また，他のフルオロキノロン系薬においてもMIC90の著明な変動は認められなかったが，第4回調査におけるGFLXのMIC90（0.5μg/mL）はLVFX（2μg/mL）より低かった．Enterococcusspp.に対するGFLXのMIC90は0.5.1μg/mLであり，上昇は認められなかった．他のフルオロキノロン系薬においてもMIC90の変動は認められなかったが，第4回調査におけるGFLXのMIC90は0.5μg/mLであり，LVFXの2μg/mLより低かった．一方，CMXのEnterococcusspp.に対するMIC90は4回の調査すべてにおいて＞128μg/mLであった．Corynebacteriumspp.に対するGFLXのMIC90は8.16μg/mLであり，第4回調査のGFLXのMIC90（8μg/mL）は，LVFXおよびMFLXの64μg/mLおよび32μg/mLより低かった．ただし，CMXのMIC90は0.25.1μg/mL，TOBでは2μg/mLであり，フルオロキノロン系薬よりも低値を示した．計4回の調査におけるP.acnesに対するGFLXのMIC90は0.25.0.5μg/mLであり，MFLXと同等で他のフルオロキノロン系薬よりも低値であった．また，CMXのMIC90は0.25.0.5μg/mLでありあたらしい眼科Vol.33，No.6，2016877表2外眼部感染症由来分離株に対するgatifloxacinおよび他の対象薬のMIC推移MIC：μg/mL菌名（株数）Drug第1回（2005年）第2回（2007年）第3回（2009年）第4回（2014年）MICrangeMIC50MIC90MICrangeMIC50MIC90MICrangeMIC50MIC90MICrangeMIC50MIC90グラム陽性菌MSSAGFLX≦0.06-4≦0.060.12≦0.06-20.120.12≦0.06-40.120.25≦0.06-320.120.25第1回（81株）LVFX0.12-80.250.250.12-40.250.250.12-80.250.50.12-＞1280.250.5第2回（78株）TFLX≦0.06-8≦0.06≦0.06≦0.06-2≦0.06≦0.06≦0.06-4≦0.060.12≦0.06-＞16≦0.060.25第3回（76株）MFLX≦0.06-2≦0.06≦0.06≦0.06-1≦0.06≦0.06≦0.06-2≦0.060.12≦0.06-16≦0.060.12第4回（81株）CMX1-4221-2121-2220.5-422EM0.25-＞1280.5＞128TOB0.25-640.516MRSAGFLX0.12-＞1284128≦0.06-642320.12-＞12881280.12-64464第1回（19株）LVFX0.25-＞1288＞1280.25-＞1288＞1280.25-＞12832＞1280.25-＞12816＞128第2回（22株）TFLX≦0.06-＞164＞16≦0.06-＞164＞16≦0.06-＞16＞16＞16≦0.06-＞16＞16＞16第3回（24株）MFLX≦0.06-128264≦0.06-32232≦0.06-128864≦0.06-64864第4回（19株）CMX8-＞128＞128＞1284-＞12864＞1288-＞128＞128＞1284-＞12816＞128EM0.5-＞128＞128＞128TOB0.5-＞1281＞128MSCNSGFLX≦0.06-2≦0.060.12≦0.06-20.121≦0.06-20.120.12≦0.06-20.122第1回（60株）LVFX0.12-80.120.250.12-80.2520.12-40.250.250.12-80.254第2回（52株）TFLX≦0.06-16≦0.06≦0.06≦0.06-＞16≦0.062≦0.06-4≦0.06≦0.06≦0.06-8≦0.064第3回（60株）MFLX≦0.06-2≦0.06≦0.06≦0.06-4≦0.060.5≦0.06-1≦0.060.12≦0.06-2≦0.061第4回（60株）CMX0.25-20.510.25-10.510.25-10.510.25-10.51EM0.12-＞1280.25128TOB≦0.06-＞1280.2516MRCNSGFLX≦0.06-212≦0.06-222≦0.06-6412≦0.06-3212第1回（40株）LVFX0.12-16240.12-16480.12-＞128480.12-＞12844第2回（48株）TFLX≦0.06-1624≦0.06-＞1648≦0.06-＞1628≦0.06-＞1644第3回（40株）MFLX≦0.06-40.51≦0.06-412≦0.06-3212≦0.06-3211第4回（40株）CMX2-16480.5-164161-8481-16416EM0.25-＞12864＞128TOB0.12-＞128864PSSPGFLX0.12-0.50.250.250.12-0.50.250.250.12-0.50.250.250.12-0.50.250.25第1回（38株）LVFX0.25-10.510.25-1110.5-1110.5-111第2回（32株）TFLX≦0.06-0.250.120.12≦0.06-0.250.120.12≦0.06-0.250.120.25≦0.06-0.250.120.12第3回（29株）MFLX≦0.06-0.250.120.12≦0.06-0.250.120.12≦0.06-0.250.120.25≦0.06-0.250.120.25第4回（30株）CMX≦0.06-0.250.120.25≦0.06-0.250.120.25≦0.06-0.50.120.25≦0.06-0.50.250.25EM≦0.06-＞1284＞128TOB8-321632菌名（株数）Drug第1回（2005年）第2回（2007年）第3回（2009年）第4回（2014年）MICrangeMIC50MIC90MICrangeMIC50MIC90MICrangeMIC50MIC90MICrangeMIC50MIC90グラム陽性菌MSSAGFLX≦0.06-4≦0.060.12≦0.06-20.120.12≦0.06-40.120.25≦0.06-320.120.25第1回（81株）LVFX0.12-80.250.250.12-40.250.250.12-80.250.50.12-＞1280.250.5第2回（78株）TFLX≦0.06-8≦0.06≦0.06≦0.06-2≦0.06≦0.06≦0.06-4≦0.060.12≦0.06-＞16≦0.060.25第3回（76株）MFLX≦0.06-2≦0.06≦0.06≦0.06-1≦0.06≦0.06≦0.06-2≦0.060.12≦0.06-16≦0.060.12第4回（81株）CMX1-4221-2121-2220.5-422EM0.25-＞1280.5＞128TOB0.25-640.516MRSAGFLX0.12-＞1284128≦0.06-642320.12-＞12881280.12-64464第1回（19株）LVFX0.25-＞1288＞1280.25-＞1288＞1280.25-＞12832＞1280.25-＞12816＞128第2回（22株）TFLX≦0.06-＞164＞16≦0.06-＞164＞16≦0.06-＞16＞16＞16≦0.06-＞16＞16＞16第3回（24株）MFLX≦0.06-128264≦0.06-32232≦0.06-128864≦0.06-64864第4回（19株）CMX8-＞128＞128＞1284-＞12864＞1288-＞128＞128＞1284-＞12816＞128EM0.5-＞128＞128＞128TOB0.5-＞1281＞128MSCNSGFLX≦0.06-2≦0.060.12≦0.06-20.121≦0.06-20.120.12≦0.06-20.122第1回（60株）LVFX0.12-80.120.250.12-80.2520.12-40.250.250.12-80.254第2回（52株）TFLX≦0.06-16≦0.06≦0.06≦0.06-＞16≦0.062≦0.06-4≦0.06≦0.06≦0.06-8≦0.064第3回（60株）MFLX≦0.06-2≦0.06≦0.06≦0.06-4≦0.060.5≦0.06-1≦0.060.12≦0.06-2≦0.061第4回（60株）CMX0.25-20.510.25-10.510.25-10.510.25-10.51EM0.12-＞1280.25128TOB≦0.06-＞1280.2516MRCNSGFLX≦0.06-212≦0.06-222≦0.06-6412≦0.06-3212第1回（40株）LVFX0.12-16240.12-16480.12-＞128480.12-＞12844第2回（48株）TFLX≦0.06-1624≦0.06-＞1648≦0.06-＞1628≦0.06-＞1644第3回（40株）MFLX≦0.06-40.51≦0.06-412≦0.06-3212≦0.06-3211第4回（40株）CMX2-16480.5-164161-8481-16416EM0.25-＞12864＞128TOB0.12-＞128864PSSPGFLX0.12-0.50.250.250.12-0.50.250.250.12-0.50.250.250.12-0.50.250.25第1回（38株）LVFX0.25-10.510.25-1110.5-1110.5-111第2回（32株）TFLX≦0.06-0.250.120.12≦0.06-0.250.120.12≦0.06-0.250.120.25≦0.06-0.250.120.12第3回（29株）MFLX≦0.06-0.250.120.12≦0.06-0.250.120.12≦0.06-0.250.120.25≦0.06-0.250.120.25第4回（30株）CMX≦0.06-0.250.120.25≦0.06-0.250.120.25≦0.06-0.50.120.25≦0.06-0.50.250.25EM≦0.06-＞1284＞128TOB8-321632（118）（119）あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016879第1回（2005年）第2回（2007年）第3回（2009年）第4回（2014年）菌名（株数）DrugMICrangeMIC50MIC90MICrangeMIC50MIC90MICrangeMIC50MIC90MICrangeMIC50MIC90PISPGFLX0.12-0.250.250.250.12-0.250.250.250.12-0.250.250.250.12-0.50.250.5第1回（10株）LVFX第2回（14株）TFLX第3回（15株）MFLX第4回（13株）CMXEMTOBPRSPGFLX第1回（2株）LVFX第2回（4株）TFLX第3回（6株）MFLX第4回（7株）CMXEMTOBStreptococcusspp.GFLX第1回（25株）LVFX第2回（25株）TFLX第3回（25株）MFLX第4回（25株）CMXEMTOBEnterococcusspp.GFLX第1回（25株）LVFX第2回（25株）TFLX第3回（25株）MFLX第4回（25株）CMXEMTOBCorynebacteriumspp.GFLX第1回（25株）LVFX第2回（25株）TFLX第3回（25株）MFLX第4回（25株）CMXEMTOB0.5≦0.06≦0.060.250.2510.120.120.5≦0.060.12≦0.06≦0.06≦0.060.510.250.258≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.0610.120.1210.510.250.2521211＞1281612816320.50.50.120.120.5─────0.250.50.120.12≦0.060.510.250.251288324160.120.50.120.121─────0.510.250.250.25120.50.5＞12816648320.50.5≦0.06≦0.060.120.2510.120.120.5≦0.060.12≦0.06≦0.06≦0.060.2510.250.251≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.0610.120.1210.520.50.540.520.50.54120.50.5＞128＞128＞128＞166410.50.120.120.25─────0.250.50.120.12≦0.060.510.50.5640.250.50.50.250.2510.120.120.5─────0.510.250.25≦0.06120.50.5＞128166416320.250.5≦0.06≦0.06≦0.060.2510.120.120.50.120.25≦0.06≦0.06≦0.060.2510.250.258≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.0610.250.12140.520.250.252120.50.5＞12832＞128＞16640.50.50.120.120.5─────0.2510.120.12≦0.060.510.50.51280.250.50.250.120.2510.120.121─────0.510.250.250.25120.50.5＞12816128＞16320.50.-15≦0.06-0.25≦0.06-0.25-0.50.121-＞1288-320.250.-150.120.120.-251-＞12816-32-0.50.120.-225≦0.06-0.5≦0.06-0.25≦0.06-2≦0.06-＞1282-320.-251–0.50.25-0.50.258-＞128-＞1280.258-＞128≦0.06-16≦0.06-128≦0.06-＞16≦0.06-32≦0.06-2≦0.06-＞128≦0.06-810.120.120.25216───────0.510.250.25≦0.06≦0.06160.510.250.25128＞12816832160.120.12≦0.0610.250.250.5＞12832───────0.520.250.250.254320.520.50.5＞128＞128＞128864832182第1回（2005年）第2回（2007年）第3回（2009年）第4回（2014年）菌名（株数）DrugMICrangeMIC50MIC90MICrangeMIC50MIC90MICrangeMIC50MIC90MICrangeMIC50MIC90P.acnesGFLX0.250.250.250.25-0.50.250.50.25-0.50.250.50.25-0.50.250.5第1回（50株）LVFX第2回（50株）TFLX第3回（50株）MFLX第4回（50株）CMXEMTOB-0.50.250.5-10.12-0.25≦0.06-0.50.510.25≦0.060.510.250.50.-150.12-20.25-0.5≦0.06-0.50.510.250.12110.50.250.-150.5-10.25-0.5≦0.06-0.50.510.250.12110.50.50.-150.510.-1511-0.50.250.250.5≦0.06-0.50.120.50.120.120.1216-646464グラム陰性菌M.（B.）catarrhalisGFLX第1回（25株）LVFX第2回（25株）TFLX第3回（25株）MFLX第4回（25株）CMXEMTOBCitrobacterspp.GFLX第1回（10株）LVFX第2回（10株）TFLX第3回（10株）MFLX第4回（10株）CMXEMTOBKlebsiellaspp.GFLX第1回（10株）LVFX第2回（10株）TFLX第3回（10株）MFLX第4回（10株）CMXEMTOBSerratiaspp.GFLX第1回（25株）LVFX第2回（25株）TFLX第3回（25株）MFLX第4回（25株）CMXEMTOB≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.0610.250.250.250.50.120.120.120.120.511120.5≦0.06≦0.06≦0.06≦0.060.25≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.060.12≦0.06≦0.06≦0.06≦0.060.5≦0.06≦0.06≦0.060.120.12≦0.06≦0.06≦0.060.120.250.50.250.250.50.5≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.0610.50.250.25110.250.50.5110.5≦0.06≦0.06≦0.06≦0.060.12≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.060.12≦0.060.250.120.120.250.12≦0.06≦0.06≦0.06≦0.060.50.50.250.2510.25≦0.06≦0.06≦0.060.12≦0.060.50.250.2510.5≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.060.50.120.250.120.1211122≦0.06≦0.06≦0.06≦0.060.25≦0.06≦0.06≦0.06≦0.060.12≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.060.120.120.120.250.12≦0.06≦0.06≦0.06≦0.060.5≦0.06≦0.06≦0.060.120.25≦0.06≦0.06≦0.060.120.120.50.250.250.51≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06-10.50.-1120.25-0.250.120.12≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06-0.12≦0.06≦0.06-0.12≦0.0664-＞1281280.-1250.5≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06-0.12≦0.06≦0.06≦0.0664＞1281280.50.250.5≦0.06-0.50.12≦0.06-0.250.12≦0.06-0.250.12≦0.06-0.50.25≦0.06-0.50.1264-＞1281280.-4252≦0.06≦0.06≦0.06≦0.060.50.12≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.061280.5≦0.06≦0.06≦0.060.12≦0.06＞1280.50.250.120.120.50.25＞1284（120）菌名（株数）Drug第1回（2005年）第2回（2007年）第3回（2009年）第4回（2014年）MICrangeMIC50MIC90MICrangeMIC50MIC90MICrangeMIC50MIC90MICrangeMIC50MIC90M.morganiiGFLX≦0.06-0.12≦0.060.12≦0.06-1≦0.060.25≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06-0.12≦0.060.12第1回（10株）LVFX≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06-1≦0.060.12≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06第2回（10株）TFLX≦0.06-0.12≦0.060.12≦0.06-2≦0.060.25≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06-0.12≦0.060.12第3回（10株）MFLX≦0.06-0.250.120.25≦0.06-40.120.5≦0.06-0.120.120.12≦0.06-0.250.120.25第4回（10株）CMX≦0.06-1≦0.06≦0.06≦0.06-0.25≦0.060.25≦0.06-0.12≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06EM128＞128＞128＞128TOB0.250.50.50.5P.aeruginosaGFLX0.25-320.520.25-80.510.25-40.510.25-40.50.5第1回（50株）LVFX0.25-640.510.25-80.510.25-40.510.25-40.50.5第2回（50株）TFLX0.12-＞160.250.50.12-40.250.50.12-20.250.50.12-20.250.25第3回（50株）MFLX0.5-128140.5-16120.5-8120.5-812第4回（50株）CMX16-＞128163216-12832648-＞12816648-＞1283232EM64-＞128＞128＞128TOB0.25-20.51Pseudomonasspp.GFLX≦0.06-0.50.120.5≦0.06-40.510.12-10.51≦0.06-10.120.5第1回（25株）LVFX≦0.06-0.50.120.25≦0.06-40.50.50.12-10.51≦0.06-10.120.5第2回（25株）TFLX≦0.06-0.25≦0.060.25≦0.06-10.250.5≦0.06-0.50.250.5≦0.06-0.50.120.25第3回（25株）MFLX≦0.06-10.251≦0.06-8120.25-2120.12-20.251第4回（25株）CMX0.12-12816640.5-＞1283212816-128326416-643264EM8-＞12832＞128TOB≦0.06-0.5≦0.060.5S.paucimobilisGFLX≦0.06-0.5──≦0.06-1──≦0.06-10.121≦0.06-0.5──第1回（7株）LVFX0.12-1──≦0.06-2──0.12-20.2520.12-1──第2回（6株）TFLX≦0.06-0.5──≦0.06-1──≦0.06-2≦0.061≦0.06-0.5──第3回（18株）MFLX≦0.06-0.5──≦0.06-2──≦0.06-2≦0.061≦0.06-0.25──第4回（7株）CMX2-32──1-＞128──2-＞128326416-64──EM2-4──TOB0.12-1──S.maltophiliaGFLX0.25-40.51≦0.06-320.540.25-2110.25-111第1回（10株）LVFX0.5-40.520.12-32140.5-2120.5-212第2回（10株）TFLX0.12-20.51≦0.06-＞160.520.12-10.50.50.12-0.50.50.5第3回（10株）MFLX0.12-20.251≦0.06-320.520.12-10.50.50.25-0.50.50.5第4回（10株）CMX2-＞128128＞12832-＞128128＞1284-＞128128＞12832-＞128128＞128EM128-＞128128＞128TOB8-＞128128＞128菌名（株数）Drug第1回（2005年）第2回（2007年）第3回（2009年）第4回（2014年）MICrangeMIC50MIC90MICrangeMIC50MIC90MICrangeMIC50MIC90MICrangeMIC50MIC90M.morganiiGFLX≦0.06-0.12≦0.060.12≦0.06-1≦0.060.25≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06-0.12≦0.060.12第1回（10株）LVFX≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06-1≦0.060.12≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06第2回（10株）TFLX≦0.06-0.12≦0.060.12≦0.06-2≦0.060.25≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06-0.12≦0.060.12第3回（10株）MFLX≦0.06-0.250.120.25≦0.06-40.120.5≦0.06-0.120.120.12≦0.06-0.250.120.25第4回（10株）CMX≦0.06-1≦0.06≦0.06≦0.06-0.25≦0.060.25≦0.06-0.12≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06EM128＞128＞128＞128TOB0.250.50.50.5P.aeruginosaGFLX0.25-320.520.25-80.510.25-40.510.25-40.50.5第1回（50株）LVFX0.25-640.510.25-80.510.25-40.510.25-40.50.5第2回（50株）TFLX0.12-＞160.250.50.12-40.250.50.12-20.250.50.12-20.250.25第3回（50株）MFLX0.5-128140.5-16120.5-8120.5-812第4回（50株）CMX16-＞128163216-12832648-＞12816648-＞1283232EM64-＞128＞128＞128TOB0.25-20.51Pseudomonasspp.GFLX≦0.06-0.50.120.5≦0.06-40.510.12-10.51≦0.06-10.120.5第1回（25株）LVFX≦0.06-0.50.120.25≦0.06-40.50.50.12-10.51≦0.06-10.120.5第2回（25株）TFLX≦0.06-0.25≦0.060.25≦0.06-10.250.5≦0.06-0.50.250.5≦0.06-0.50.120.25第3回（25株）MFLX≦0.06-10.251≦0.06-8120.25-2120.12-20.251第4回（25株）CMX0.12-12816640.5-＞1283212816-128326416-643264EM8-＞12832＞128TOB≦0.06-0.5≦0.060.5S.paucimobilisGFLX≦0.06-0.5──≦0.06-1──≦0.06-10.121≦0.06-0.5──第1回（7株）LVFX0.12-1──≦0.06-2──0.12-20.2520.12-1──第2回（6株）TFLX≦0.06-0.5──≦0.06-1──≦0.06-2≦0.061≦0.06-0.5──第3回（18株）MFLX≦0.06-0.5──≦0.06-2──≦0.06-2≦0.061≦0.06-0.25──第4回（7株）CMX2-32──1-＞128──2-＞128326416-64──EM2-4──TOB0.12-1──S.maltophiliaGFLX0.25-40.51≦0.06-320.540.25-2110.25-111第1回（10株）LVFX0.5-40.520.12-32140.5-2120.5-212第2回（10株）TFLX0.12-20.51≦0.06-＞160.520.12-10.50.50.12-0.50.50.5第3回（10株）MFLX0.12-20.251≦0.06-320.520.12-10.50.50.25-0.50.50.5第4回（10株）CMX2-＞128128＞12832-＞128128＞1284-＞128128＞12832-＞128128＞128EM128-＞128128＞128TOB8-＞128128＞128（121）あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016881菌名（株数）Drug第1回（2005年）MICrangeMIC50MIC90第2回（2007年）MICrangeMIC50MIC90第3回（2009年）MICrangeMIC50MIC90第4回（2014年）MICrangeMIC50MIC90Acinetobacterspp.GFLX≦0.06-16≦0.060.25第1回（25株）LVFX≦0.06-160.120.5第2回（25株）TFLX≦0.06-＞16≦0.060.12第3回（25株）MFLX≦0.06-16≦0.060.25第4回（25株）CMX4-1281632EMTOBH.influenzaeGFLX≦0.06≦0.06≦0.06第1回（50株）LVFX≦0.06≦0.06≦0.06第2回（50株）TFLX≦0.06≦0.06≦0.06第3回（50株）MFLX≦0.06≦0.06≦0.06第4回（50株）CMX≦0.06-0.5≦0.060.5EMTOBABPC0.12-＞1280.54≦0.06-0.5≦0.060.12≦0.06-0.50.120.25≦0.06-0.25≦0.06≦0.06≦0.06-1≦0.060.121-641664≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06-0.12≦0.06≦0.06≦0.06-0.50.250.50.12-160.54≦0.06-0.12≦0.060.12≦0.06-0.250.120.25≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06-0.12≦0.060.124-641632≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06-0.12≦0.06≦0.06≦0.06-0.50.120.50.12-6414≦0.06-0.12≦0.06≦0.06≦0.06-0.250.120.12≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06-0.12≦0.06≦0.064-3216324-6416160.25-20.51≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06≦0.06-0.50.250.52-16880.25-4220.12-＞128132収集株数が10株未満であった場合は，MIC50およびMIC90を算定せず．フルオロキノロン系薬と同程度であったが，EMのMIC値は全株で0.12μg/mLであり，フルオロキノロン系薬よりも低値を示した．2.グラム陰性菌計4回の調査のM.（B.）catarrhalisに対するGFLXのMIC90は0.06μg/mL以下であり，LVFX，TFLXおよびMFLXと同等であった．Citrobacterspp.に対するGFLXのMIC90は，第2回調査で0.5μg/mLと高値であった以外は0.06μg/mL以下であり，上昇を認めなかった．Klebsiellaspp.に対するGFLXのMIC90は，計4回の調査を通じて0.06μg/mL以下であり，LVFXおよびTFLXと同等であった．Serratiaspp.に対するGFLXのMIC90については，0.25.0.5μg/mLであり，上昇を認めなかった．M.morganiiに対するGFLXのMIC90は≦0.06.0.25μg/mLであり，第2回調査におけるMIC90がやや高かったが，他のフルオロキノロン系薬も同様の傾向であった．P.aeruginosaに対するGFLXのMIC90は0.5.2μg/mLで大きな変動はなく，他のフルオロキノロン系薬と同様の傾向であった．また，第4回調査におけるGFLXのMIC90は0.5μg/mLであり，MFLXの2μg/mLより低かった．Pseudomonasspp.に対するGFLXのMIC90についても0.5.1μg/mLであり，他のフルオロキノロン系薬のMIC90とほぼ同等であった．S.paucimobilisについては，第3回調査を除いて収集株数が少なくMIC90は算出していないが，MICrangeは≦0.06.1μg/mLであり，TFLXおよびMFLXと同等であった．S.maltophiliaに対するGFLXの計4回の調査におけるMIC90は1.4μg/mLであり，第2回調査で若干の上昇を認めたが，他のフルオロキノロン系薬と同様に経年的なMIC90の上昇は認められなかった．Acinetobacterspp.に対するGFLXの過去4回の調査におけるMIC90は≦0.06.0.25μg/mLであり，LVFX，TFLXおよびMFLXとほぼ同等であった．H.influenzaeに対するGFLXのMIC90は，計4回の調査を通じて0.06μg/mL以下であり，LVFXおよびTFLXと同等であった．一方，MFLXではMICが0.12μg/mLを示す菌株が認められた．3.GFLXと対象薬剤のMIC値の相関図1に示したとおり，S.aureusに対するGFLXのMIC値は，MPIPCおよびCMXと相関が認められた．MPIPCとの比較では，MSSAとMRSAで等高線パターンが異なり，MSSAではGFLXのMIC値として0.12μg/mL付近の分位点密度がもっとも高く，MRSAでは4μg/mL付近でもっとも高かった．その他の対象薬剤との比較では，GFLXあるいは対象薬剤のいずれかに低感受性である群，両方に低感受性である群の存在が認められた．一方，CNSでは，GFLXのMIC値はMPIPCおよびTOBと相関が認められた（図2）．MSCNSおよびMRCNSでは，それぞれGFLXのMIC値と（122）図1S.aureus（100株）に対するGFLXおよび対象薬剤のMIC値の相関（Spearman順位相関係数）分位点密度等高線（二変量の密度を推定し，各等高線より下に位置する点の割合を示す）■：10％，■：20％，■：30％，■：40％，■：50％，■：60％，■：70％，■：80％，■：90％して0.12および2μg/mL付近の分位点密度がもっとも高く，等高線パターンはX軸方向に大きく拡がっていた．その他の対象薬剤との比較においても，等高線パターンはX軸方向に拡大していた．図3,4に示したとおり，Corynebacteriumspp.（25株）およびP.aeruginosa（50株）では，GFLXと対象薬剤のMIC値に相関は認められなかった．Corynebacteriumspp.およびP.aeruginosaに対するGFLXのMIC値としては，それぞれ8および0.5μg/mL付近で分位点密度がもっとも高かった．また，Corynebacteriumspp.ではX軸あるいはY軸方向への等高線拡大が認められた一方で，P.aeruginosaでの等高線には拡大が認められなかった．III考按細菌感染症の治療の多くは，病巣の塗抹検鏡から起因菌を（123）予測し，経験的治療（empirictherapy）として抗菌薬の投与が開始される．ついで，培養による起因菌の同定ならびに薬剤感受性の検査結果に基づく抗菌薬の最適化が図られ，標的治療（definitivetherapy）へと移行する．このような治療方針は，外眼部における細菌感染症も例外ではなく，経験的治療としては，広域抗菌スペクトラムを有するフルオロキノロン系薬の点眼剤が汎用されている．1987年のOFLXの登場にはじまり，現在では，第4世代フルオロキノロン4.6）と称されるGFLXおよびMFLXが臨床使用されている．MRSAやMRCNSのGFLXおよびMFLXに対する耐性化は，LVFXおよびTFLXに対する耐性化とは異なり段階的7.9）で，GFLXまたはMFLX感性株のなかにはLVFX耐性株が存在する9）．10ヵ年の調査では，GFLXおよびMFLXのMIC90がLVFXに比して若干低く，またGFLXおあたらしい眼科Vol.33，No.6，2016883図2CoagulaseNegativeStaphylococcus（CNS）（100株）に対するGFLXおよび対象薬剤のMIC値の相関（Spearman順位相関係数）分位点密度等高線（二変量の密度を推定し，各等高線より下に位置する点の割合を示す）■：10％，■：20％，■：30％，■：40％，■：50％，■：60％，■：70％，■：80％，■：90％よびMFLXのMIC90の推移に明らかな上昇傾向は認められなかったが，MRSAに対する抗菌活性がMRCNSに比べ弱い傾向にあった．また，S.aureusに対するGFLXのMIC値はMPIPCおよびCMXと相関したことから，mecA（MPIPC，CMXなどへの耐性化に関与する遺伝子）獲得株では，同時にgrlA（topoisomeraseIVをコードする遺伝子）およびgyrA（DNAgyraseをコードする遺伝子）に変異を有する確率が高いことが示唆された．さらにEMおよびTOBではMIC90が高かったことから，MRSAが起因菌であると判明した際は，クロラムフェニコールなどの感受性を示す抗菌薬の選択を考慮すべきと考えられた．このほか，分位点密度等高線パターンの検討から，S.aureusは多様な薬剤感受性パターンを示し，第4回調査ではMSSAのなかにフルオロキノロン系薬全般のMIC値が高い株が存在したことから，引き続き注視する必要がある．CNSに対するフルオロキノロン系薬のMIC90は，過去3回の調査においては，いずれもMSCNSに比してMRCNSで高かったが，第4回調査におけるMSCNSおよびMRCNSに対するフルオロキノロン系薬のMIC90は同程度であった．したがって，MSCNSの薬剤感受性動向にも注視する必要があると考えられる．ただし，分位点密度等高線パターンから，GFLXはCMX，EMおよびTOBに比して優秀な抗菌活性を有しているといえる．一方，CNSに対するGFLXのMIC値は，S.aureusと同様にMPIPCおよびCMXと相関（CMXとは弱い相関）するとともに，TOBとも相関した．したがって，GFLX耐性（あるいは低感受性）のCNSでは，（124）あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016885（125）程度であった．グラム陰性菌に対するフルオロキノロン系薬のMIC値は，他の系統の薬剤に比べて低く，耐性化も認められず，優れた抗菌活性を示した．グラム陰性菌のうち，とくに角膜炎の起因菌として重要なP.aeruginosaについても耐性化傾向は認められなかった．また，P.aeruginosaに対して，第4回調査の対象薬剤としたTOBはGFLXと同程度のMIC90を示し，GFLXよりも高感受性の株も存在したことから，P.aeruginosaが起因菌として疑われる場合は，GFLXとTOBの組合せが有効であると考えられた．一方，P.aerugi-nosaの分位点密度等高線パターンは非常に特徴的であり，EMに対しては，全株が感受性を示さないという傾向が認められた．P.acnesは，フルオロキノロン系薬に高い感受性を示し，10ヵ年の調査を通じて感受性の低下傾向はみられなかった．一方，第4回調査のP.acnes全株がEMに対して高い感受性を示したことから，P.acnesが起因菌である場合はEMも有効な選択肢であると考えられた．aac（6’）-aph（2’’）（アミノグリコシドへの耐性化遺伝子）10）を有する確率が高いことが示唆された．S.pneumoniaeに対するフルオロキノロン系薬の抗菌活性はPSSP，PISPおよびPRSPに対して同等であり，PCGに対する耐性度には影響されなかった．また，S.pneumoniaeを含むレンサ球菌属に対してはb-ラクタム系およびマクロライド系が第一選択薬として推奨5）されているが，GFLXは同程度の抗菌活性を示した．Corynebacteriumspp.に対するフルオロキノロン系薬のMICrangeは比較的幅広く，抗菌活性は優秀とは言い難いが，フルオロキノロン系薬のなかではGFLXおよびTFLXのMIC90が低かった．一方，Corynebacteriumspp.に対してもっとも強い抗菌活性を示した薬剤はCMXであり，GFLXのMIC値とも相関しなかったことから，Corynebac-teriumspp.を起因菌とする場合はCMXが最適な選択肢であると考えられた．また，第4回調査の対象薬剤としたEMおよびTOBの抗菌活性については，CMXについでTOBが高く，EMでは低感受性株の存在を認めたがGFLXと同図3Corynebacteriumspp.（25株）に対するGFLXおよび対象薬剤のMIC値の相関（Spearman順位相関係数）分位点密度等高線（二変量の密度を推定し，各等高線より下に位置する点の割合を示す）■：10％，■：20％，■：30％，■：40％，■：50％，■：60％，■：70％，■：80％，■：90％あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016885（125）程度であった．グラム陰性菌に対するフルオロキノロン系薬のMIC値は，他の系統の薬剤に比べて低く，耐性化も認められず，優れた抗菌活性を示した．グラム陰性菌のうち，とくに角膜炎の起因菌として重要なP.aeruginosaについても耐性化傾向は認められなかった．また，P.aeruginosaに対して，第4回調査の対象薬剤としたTOBはGFLXと同程度のMIC90を示し，GFLXよりも高感受性の株も存在したことから，P.aeruginosaが起因菌として疑われる場合は，GFLXとTOBの組合せが有効であると考えられた．一方，P.aerugi-nosaの分位点密度等高線パターンは非常に特徴的であり，EMに対しては，全株が感受性を示さないという傾向が認められた．P.acnesは，フルオロキノロン系薬に高い感受性を示し，10ヵ年の調査を通じて感受性の低下傾向はみられなかった．一方，第4回調査のP.acnes全株がEMに対して高い感受性を示したことから，P.acnesが起因菌である場合はEMも有効な選択肢であると考えられた．aac（6’）-aph（2’’）（アミノグリコシドへの耐性化遺伝子）10）を有する確率が高いことが示唆された．S.pneumoniaeに対するフルオロキノロン系薬の抗菌活性はPSSP，PISPおよびPRSPに対して同等であり，PCGに対する耐性度には影響されなかった．また，S.pneumoniaeを含むレンサ球菌属に対してはb-ラクタム系およびマクロライド系が第一選択薬として推奨5）されているが，GFLXは同程度の抗菌活性を示した．Corynebacteriumspp.に対するフルオロキノロン系薬のMICrangeは比較的幅広く，抗菌活性は優秀とは言い難いが，フルオロキノロン系薬のなかではGFLXおよびTFLXのMIC90が低かった．一方，Corynebacteriumspp.に対してもっとも強い抗菌活性を示した薬剤はCMXであり，GFLXのMIC値とも相関しなかったことから，Corynebac-teriumspp.を起因菌とする場合はCMXが最適な選択肢であると考えられた．また，第4回調査の対象薬剤としたEMおよびTOBの抗菌活性については，CMXについでTOBが高く，EMでは低感受性株の存在を認めたがGFLXと同図3Corynebacteriumspp.（25株）に対するGFLXおよび対象薬剤のMIC値の相関（Spearman順位相関係数）分位点密度等高線（二変量の密度を推定し，各等高線より下に位置する点の割合を示す）■：10％，■：20％，■：30％，■：40％，■：50％，■：60％，■：70％，■：80％，■：90％以上，2004年の発売から10ヵ年にわたって，外眼部感染症分離菌のGFLXに対する感受性について検討した結果，経年的な耐性化傾向は認められなかった．したがって，GFLX点眼薬は現時点においても，外眼部感染症に対して有用であると考えられ，今後も外眼部感染症に対する経験的治療（empirictherapy）の主軸として使用されることに問題はないと考えられる．また，第4回調査の分離菌のうちStreptococcusspp.，Enterococcusspp.，Corynebacteriumspp.およびP.aeruginosaは，他のフルオロキノロン系薬に比してGFLXに高い感受性を示した．このうち，Corynebacteriumspp.は重篤な角膜炎の起因菌11）として，P.aeruginosaはコンタクトレンズ装着に伴う角膜炎の起因菌12）として問題視されている．一方，Streptococcusspp.およびEnterococcusspp.は外眼部感染症の起因菌のみならず，濾過胞感染13）や術後眼内炎14）の起因菌としても重要であることから，GFLXは外眼部感染症に対する経験的治療のほか，周術期管理においても有用な選択肢であると考えられる．しかしながら，近年ではフルオロキノロン系薬耐性菌の出現と増加7,15,16）に加886あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016図4P.aeruginosa（50株）に対するGFLXおよび対象薬剤のMIC値の相関（Spearman順位相関係数）分位点密度等高線（二変量の密度を推定し，各等高線より下に位置する点の割合を示す）■：10％，■：20％，■：30％，■：40％，■：50％，■：60％，■：70％，■：80％，■：90％え，新しい抗菌薬開発のモチベーションが世界的に減衰17）しており，新規作用機序を有する抗菌薬の登場には時間を要すると考えられる．したがって，現存の抗菌薬に対する耐性菌の拡大を最小化することがきわめて重要であり，さらなる抗菌薬の適正使用の推進が必要と考えられる．適正使用は，適切な抗菌薬の選択に始まる．すなわち，推定起因菌の感受性に関する最新情報18），各抗菌薬の製剤としての特性も考慮し，経験的治療を開始することが非常に重要である．加えて，当該起因菌の薬剤感受性結果に基づく抗菌薬の最適化，投与期間の最短化への介入も重要である19）．今回，筆者らは，眼科臨床由来の2005，2007，2009および2014年分離株の感受性について報告したが，引き続き，感受性動向を監視し，最新情報を医療現場と共有していく必要があると考える．文献1）末信敏秀，石黒美香，松崎薫ほか：細菌性外眼部感染症（126）分離菌株のGatifloxacinに対する感受性調査．あたらしい眼科28：1321-1329,20112）FukudaH,KishiiR,TakeiMetal：Contributionofthe8-methoxygroupofgatifloxacintoresistanceselectivity,targetpreference,andantibacterialactivityagainstStreptococcuspneumoniae.AntimicrobAgentsChemother45：1649-1653,20013）羽藤晋，南川洋子，山田昌和：結膜.から分離されたブドウ球菌に対する二変量ノンパラメトリック密度を用いた薬剤感受性分布解析．あたらしい眼科24：663-667,20074）ChawlaB,AgarwalP,TandonRetal：Invitrosusceptibilityofbacterialkeratitisisolatestofourth-generationfluoroquinolones.EurJOphthalmol20：300-305,20105）井上幸次，大橋裕一，浅利誠志ほか：感染性角膜炎診療ガイドライン第2版作成委員会：感染性角膜炎診療ガイドライン第2版．日眼会誌117：467-509,20136）DuggiralaA,JosephJ,SharmaSetal：Activityofnewerfluoroquinolonesagainstgram-positiveandgram-negativebacteriaisolatedfromocularinfections：Aninvitrocomparison.IndianJOphthalmol55：15-19,20077）McDonaldM,BlondeauJM：Emergingantibioticresistanceinocularinfectionsandtheroleoffluoroquinolones.JCataractRefractSurg36：1588-1598,20108）NoguchiN,OkiharaT,NamikiYetal：Susceptibilityandresistancegenestofluoroquinolonesinmethicillin-resistantStaphylococcusaureusisolatedin2002.IntJAntimicrobAgents25：374-379,20059）星最智：正常結膜.から分離されたメチシリン耐性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌におけるフルオロキノロン耐性の多様性．あたらしい眼科27：512-517,201010）MartineauF,PicardFJ,LansacNetal：CorrelationbetweentheresistancegenotypedeterminedbymultiplexPCRassaysandtheantibioticsusceptibilitypatternsofStaphylococcusaureusandStaphylococcusepidermidis.AntimicrobAgentsChemother44：231-238,200011）DasS,RaoAS,SahuSKetal：Corynebacteriumsppascausativeagentsofmicrobialkeratitis.BrJOphthalmol：bjophthalmol-2015-306749PublishedOnlineFirst：13November201512）KondaN,MotukupallySR,GargPetal：Microbialanalysesofcontactlens-associatedmicrobialkeratitis.OptomVisSci91：47-53,201413）YamamotoT,KuwayamaY,KanoKetal：Clinicalfeaturesofbleb-relatedinfection：a5-yearsurveyinJapan.ActaOphthalmol91：619-624,201314）鈴木崇，戸所大輔，小早川信一郎ほか：腸球菌による白内障術後眼内炎の臨床像の検討．日眼会誌118：22-27,201415）EguchiH,KuwaharaT,MiyamotoTetal：High-levelfluoroquinoloneresistanceinophthalmicclinicalisolatesbelongingtothespeciesCorynebacteriummacginley.JClinMicrobiol46：527-532,200816）HooperDC：Mechanismsoffluoroquinoloneresistance.DrugResistUpdat2：38-55,199917）InfectiousDiseasesSocietyofAmerica：The10x’20initiative：pursuingaglobalcommitmenttodevelop10newantibacterialdrugsby2020.ClinInfectDis50：10811083,201018）OliveiraAD,Hofling-LimaAL,BelfortRJretal：Fluoroquinolonesusceptibilitiestomethicillin-resistantandsusceptiblecoagulase-negativeStaphylococcusisolatedfromeyeinfection.ArqBrasOftalmol70：286-289,200719）厚生労働省医政局地域医療計画課：「薬剤耐性菌対策に関する提言」の送付について．事務連絡，平成27年4月1日＊＊＊（127）あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016887

《第35回日本眼薬理学会原著》あたらしい眼科33（6）：867.873，2016c培養ヒト結膜上皮細胞における高浸透圧ストレス負荷に対するカテキンの抑制効果木崎順一郎＊1,2宇高結子＊1佐々木晶子＊1辻まゆみ＊1友寄英士＊1,2當重明子＊1,2岩井信市＊1,3小口勝司＊1＊1昭和大学医学部薬理学講座医科薬理学部門＊2昭和大学医学部眼科学講座＊3昭和大学薬学部社会健康薬学講座医薬品評価薬学部門Anti-inflammatoryEffectsofEGCGorEGCG3MeagainstHyperosmotic-inducedInflammationinHumanConjunctivalEpitheliumCellsJunichiroKizaki1,2）,YukoUdaka1）,AkikoSasaki1）,MayumiTsuji1）,EijiTomoyori1,2）,AkikoToju1,2）,ShinichiIwai1,3）andKatsujiOguchi1）1）DepartmentofPharmacology,ShowaUniversitySchoolofMedicine,2）DepartmentofOphthalmology,ShowaUniversitySchoolofMedicine,3）DepartmentofResearchandDevelopmentforInnovativeMedicalNeeds,Health,ShowaUniversitySchoolofPharmacyドライアイは，涙液層の浸透圧上昇と，これに伴う眼表面の炎症がおもな病態と考えられている．近年，茶カテキン，とくに（-）-EpigallocatechinGallate（EGCG）および，（-）-Epigallocatechin3-（3”-O-Methyl）Gallate（EGCG3”Me）の高い生理活性が報告されている．本研究では，培養ヒト結膜上皮細胞株を用い，培養液にスクロースを添加することで高浸透圧ストレス負荷を施し，アポトーシス解析，MAPK（ERK，JNK，p38MAPK）リン酸化能およびIL-6生成量を測定し，さらにEGCG，EGCG3”Meを前処置による抑制効果を検討した．その結果，高浸透圧ストレス負荷により，アポトーシス細胞の割合，JNK，p38MAPKリン酸化能およびIL-6生成量が有意に増加した．これに対し，EGCG3”MeはIL-6生成量とp38MAPK活性の上昇を有意に抑制したが，EGCGではIL-6生成の抑制は認めなかった．以上より高浸透圧ストレス誘発性炎症に対し，EGCG3”Meはp38MAPKリン酸化を抑制することで，IL-6生成を抑え，抗炎症作用を示すものと考えた．Osmoticpressureoftearsindryeyepatientsisusuallyhigherthaninnormalpersons.Itisassociatedwithincreasedosmolarityofthetearfilmandinflammationoftheocularsurface.Inaddition,teacatechinssuchas（-）-EpigallocatechinGallate（EGCG）and（-）-Epigallocatechin3-（3”-O-Methyl）Gallate（EGCG3Me）havemultiplebiologicalactions,includinganti-allergy,anti-inflammatoryandanti-canceractivity.Inthisstudy,weexaminedwhetherEGCGandEGCG3Meattenuatethehyperosmosis-inducedinflammationinhumanconjunctivalepitheliumcells（HCEcells）.HCEcellswereexposedtohyperosmoticmedium（423mOsm,i.e.,123mMsucroseinmedium）,andthenexaminedastotherateofapoptosis,IL-6levelsandactivityofMAPKs（ERK,JNKandp38MAPK）.EGCG3MesignificantlysuppressedtheincreaseinIL-6levelandelevationofphosphorylatedp38MAPK.EGCG3MeinductionofinflammationmorepotentthanEGCGwasalsoindicated.TheseresultssuggestthatEGCG3Memightbeuseableasatherapeuticapproachindryeye.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）33（6）：867.873,2016〕Keywords：結膜，ドライアイ，炎症，高浸透圧，カテキン．conjunctiva,dryeye,inflammatory,hyperosmolarity,catechin.〔別刷請求先〕木崎順一郎：〒142-8555東京都品川区旗の台1丁目5-8昭和大学医学部薬理学講座医科薬理学部門Reprintrequests：JunichiroKizaki,M.D.,DepartmentofPharmacology,ShowaUniversitySchoolofMedicine,1-5-8Hatanodai,Shinagawa,Tokyo142-8555,JAPAN0910-1810/16/\100/頁/JCOPY（107）867はじめに近年，生活環境の変化（高齢化，コンタクトレンズ装用者の増加，エアコン普及，パソコン，スマートフォン，ゲームなどのデジタル機器（visualdisplayterminals：VDT）の長時間使用などにより，ドライアイの有病率が増えている．とくにオフィスワーカーの約6割がドライアイもしくはその疑いがあり，QOLの低下や作業効率の低下などにつながるという報告もあり1），いわば現代病の一つといっても過言ではない．ドライアイの発症のメカニズムとして，眼表面の浸透圧の上昇が指摘されている．涙液の産生低下，あるいは蒸発亢進による涙液量の減少により眼表面の浸透圧が上昇すると炎症反応が起こり，結膜傷害，ゴブレット細胞の減少を引き起こし，涙液層の不安定化などにつながる．その結果，さらに涙液が減少するなどの悪循環を起こすこと2）が示されている．米国では，とくにこの考え方が強く，ドライアイの診断において眼表面の浸透圧上昇を重視しており，治療の中心は抗炎症薬投与になっている3）．近年，日本緑茶に豊富に含まれるポリフェノール（greenteapolyphenol）のうち，カテキン類には，抗酸化作用，抗腫瘍作用，抗転移作用，血圧抑制作用，動脈硬化抑制作用，脂質代謝改善作用，抗菌作用，抗ウイルス作用，抗う蝕作用，抗アレルギー作用といった多様な生理作用を有することが報告されている．とくに，（-）-Epigallocatechingallate（EGCG）は，茶特有のポリフェノール成分で4），上記作用が強力に出ることが多数報告されている．いわゆる緑茶の代表的な品種「やぶきた」には，カテキン類が10.20％の割合で含まれており，その約半分をこのEGCGが占めるとされている．一方，EGCGの3つの水酸基のうちortho位をメチル化した（-）-Epigallocatechin3-（3”-O-Methyl）gallate（EGCG3”Me）の強い生理活性が最近注目されている．これは「べにふうき」「べにふじ」「べにほまれ」などの品種の茶葉に多く含まれ，「やぶきた」には含まれていない．EGCG3”Meは高い抗酸化活性を持ち，とくに抗アレルギー作用はEGCGの約2.5倍との報告がある．そこで今回，筆者らは，培養ヒト結膜上皮（humanconjunctivalepithelium：HCE）細胞を用いて，眼表面のドライアイ病態を想定した高浸透圧ストレス負荷状態における炎症誘発経路を明らかにするとともに，これに対するEGCGとEGCG3”Meの抗炎症作用およびその有用性を比較検討した．なお，今回使用した細胞株は，ヒト子宮頸癌由来上皮細胞（HeLa細胞）の混入が疑われているが，株化したヒト結膜上皮細胞の代用がないため，HCE細胞とHeLa細胞の比較検討を行った．I材料および方法1.細胞培養ヒト眼球由来結膜上皮細胞株（Clone-1-5c-4：HCE細胞）をDSファーマメディカル（大阪）より購入，細胞は2mMGlutamine＋10％FetalBovineSerum（FBS）含有Medium199（Sigma-AldrichCo.,MO,USA）培地中，5％CO2，37℃にて培養した．ヒト子宮頸癌由来上皮細胞（ATCCCCL2.2：HeLa細胞）は，FBS含有E-MEMmedium培地中，5％CO2，37℃にて培養した．2.高浸透圧ストレスFBS非含有medium（289mOsm/L）に123mMのスクロース（和光純薬工業，大阪）を添加し，Hyperosmoticmedium（423mOsm/L）を調整し5），培養液をこれに置換することで，高浸透圧ストレス負荷（Hyper）群とした．対照として，スクロース非添加群をコントロール（Cont）群とした．3.使用薬物カテキン類はそれぞれEGCGを和光純薬工業から，EGCG3”Meを長良サイエンス（岐阜）から購入した．Mitogen-activatedproteinkinaseinhibitor（MAPKi）は，p38MAPKinhibitor（p38i）としてSB203585，extracellularsignal-regulatedkinase（ERK）inhibitor（ERKi）としてPD98059をSigma-AldrichCo.（MO,USA）から購入，c-JunN-terminalkinase（JNK）inhibitor（JNKi）としてSP600125を和光純薬工業（東京）から購入した．4.実験プロトコール細胞を測定項目に応じて適切な濃度に調整して播種し，24時間培養後，Cont群には高浸透圧ストレス負荷の1時間前に，p38i1μM，JNKi10μM，ERKi10μM，EGCG5,10,20μM，およびEGCG3”Me5,10,20μMを添加した．その1時間後，Hyper群は培養液を高浸透圧ストレスmediumに置換し，ただちに，各MAPKiおよびカテキン類をCont群と同じ濃度で添加した．両群ともその状態で培養を続け，各時点のサンプルを実験に供した．5.高浸透圧負荷後のアポトーシス細胞の経時的解析HCE細胞を3×105cells/mLに調整し6穴プレートに播種し，先に示した条件で24時間培養後，高浸透圧負荷を行った．その後1,3,6,15,24時間時点で抽出し，MuseRCellAnalyzer（MerckMillipore,Germany）にて，MuseTMAnnexinVandDeadCellKit（EMDMilliporeCorporation,USA）を用いて，アポトーシス細胞の表面に提示されたホスファチジルセリン（PS）とアネキシンV-PEが結合する割合から，アポトーシス細胞の割合を検出した．6.高浸透圧負荷後のIL.6生成量の経時的変化測定HCE細胞を3×105cells/mLに調整し6穴プレートに播種868あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016（108）し，24時間培養後，高浸透圧負荷を行った．その後1,3,6,15,24時間時点の上清をサンプルとし，Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay（ELISA法）にてHRP標識抗リン酸化IL-6抗体と発色試薬を用いてIL-6を検出し，HumansIL-6InstantELISA（eBioscience,AffymetrixInc,CA,USA）を用いて，マイクロプレートリーダーにて波長450nmでの吸光度を測定した．7.高浸透圧負荷1時間後のMAPK（ERK，JNK，p38MAPK）リン酸化能測定HCE細胞，HeLa細胞を1×105cells/mLに調整し，96穴プレートに播種し，24時間培養した．その後，各MAPKiおよび，HCE細胞については5,10,20μMEGCG，EGCG3”Meを，HeLa細胞については10μMEGCG,EGCG3”Meを添加し，その1時間後，高浸透圧ストレス負荷を行い，1時間後のMAPKリン酸化能を測定した．細胞は，HRP標識抗リン酸化各MAPK抗体と発色基質を用いてリン酸化各MAPKをそれぞれ検出し〔RayBioRCell-Basedp38（Thr180/Tyr182）ELISAkit，RayBioRCell-basedJNK（Thr183/Tyr185）ELISAkit，RayBioRCell-BasedERK（Thr180/Tyr182）ELISAkit（以上，RayBiotech,Inc.,GA,USA）〕を用いてマイクロプレートリーダーにて波長450nmでの吸光度を測定した．8.EGCG,EGCG3”Me添加による高浸透圧負荷24時間後のIL.6生成量の測定HCE細胞，HeLa細胞を3×105cells/mLに調整し6穴プレートに播種し，24時間培養後，EGCG（5,10,20μM），EGCG3”Me（5,10,20μM）およびp38i（1μM），JNKi（10μM），ERKi（10μM）を添加し，その1時間後，高浸透圧ストレス負荷を行い，24時間後のIL-6生成量をHumansIL-6InstantELISA（eBioscience,Inc.,CA,USA）を用いて，マイクロプレートリーダーにて波長450nmでの吸光度を測定した．9.67kDaLaminineReceptor（67LR）の免疫細胞染色HCE細胞を3×105cells/mLに調整し，ChamberSlideTMで24時間培養後，EGCG（10μM）,EGCG3”Me（10μM）を添加し，その1時間後に浸透圧負荷を行った．負荷後1時間で細胞をホルマリン固定し，ENVISION染色システムを用い，一次抗体〔Anti-67kDaLamininReceptor抗体MLuC5（ab3099）；Abcam,UK〕，を2時間反応させ，その後，二次抗体とパーオキシダーゼが結合しているデキストランポリマー試薬を反応させて，核や細胞質の染色を行った．10.統計処理実験結果は平均±標準偏差（n＝3.12）で示した．HCE細胞，HeLa細胞におけるHyper群でのパラメーターはt検定を用いてCont群と比較検討した．また，HCE細胞における高浸透圧ストレス負荷後のMAPKリン酸化能，IL-6生成量（109）に対するカテキン類の抑制効果についてはANOVA-Bonferroni多重比較検定を用いてHyper群と比較検討し，p＜0.05以下を有意とした．II結果1.高浸透圧ストレス負荷によるアポトーシス細胞の経時的変化図1AにHCE細胞に高浸透圧ストレス負荷を施した後の1,3,5,15,24時間後のアポトーシス細胞の経時的変化を，AnnexinVを用いてアポトーシス細胞の割合（％）で示した．Hyper群は高浸透圧ストレス負荷後，アポトーシス細胞の割合が経時的に上昇し，6時間以降，Cont群と比べ有意な増加を認めた（n＝6,p＜0.01）．図1BにHCE細胞とHeLa細胞の高浸透圧ストレス負荷24時間後のアポトーシス細胞の割合（％）を示した．HeLa細胞においても，高浸透圧ストレス負荷によりアポトーシス細胞の割合は有意に上昇した（n＝3,p＜0.01）．2.高浸透圧ストレス負荷によるIL.6生成量の経時的変化図2AにHCE細胞に高浸透圧ストレス負荷1,3,6,15,24時間後のIL-6生成量の経時的変化を示した．Hyper群は高浸透圧ストレス負荷により，IL-6生成量が経時的に上昇し，15時間以降，Cont群と比べ有意に上昇した（n＝6,p＜0.01）．図2BにHCE細胞とHeLa細胞の高浸透圧ストレス負荷24時間後のIL-6生成量を示した．HeLa細胞もHyper群はCont群に比べ有意な増加を認めたが，その生成量はHCE細胞に比べ明らかに低値を示した．3.HCE細胞における高浸透圧ストレス負荷によるERK，JNKおよびp38MAPKリン酸化能とカテキン類の抑制効果図3にHCE細胞における高浸透圧ストレス負荷1時間後のERK（A），JNK（B），p38MAPK（C）のリン酸化能を示した．高浸透圧ストレス負荷によるERKリン酸化能の変化は認められなかった（n＝6）．高浸透圧ストレス負荷後1時間での，JNKおよびp38MAPKのリン酸化能はCont群と比較し有意に上昇した．JNKリン酸化能の上昇に対し，EGCGはいずれの濃度においても有意な抑制を示した（n＝12,p＜0.01）．一方，p38MAPKリン酸化能の上昇に対しては，EGCG3”Meで濃度依存的に有意な抑制を示した（n＝6,p＜0.01,0.05）が，EGCGは5μMで有意な抑制効果を示した（n＝6,p＜0.05）が，10,20μMでは変化は認められなかった．一方，HeLa細胞においては，高浸透圧ストレス負荷による，ERK，JNK，p38MAPKのリン酸化能に有意差は認めなかった．（ERK：Cont群1.525±0.058,Hyper群1.590±0.055；n＝6.JNK：Cont群1.472±0.075,Hyper群1.556±あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016869ABA2（％）1.8（％）#$1001001.690＊＊＊＊901.4Phosphop38/totalp38ratioPhosphoJNK/totalJNKratioPhosphoERK/totalERKratio＊＊80RateofApoptoticcells1.210.80.60.40.270605040303020200（μM）1010001361524Incubationtime（hours）HCEcellsHeLacellsBContHyper21.81.61.4図1高浸透圧ストレス負荷後のアポトーシス細胞の割合HCE細胞またはHeLa細胞における高浸透圧ストレス負荷後のアポトーシス細胞の割合を，MuseTMCellAnalyzerにてAnnexinVを用いて測定した．A：HCE細胞に対する高浸透圧ストレス負荷後1,3,6,15,24時間後のアポトーシス細胞の経時的変化．平均±標準偏差，n＝6，＊p＜0.05，＊＊p＜0.01vsCont（t検定）．B：高浸透圧ストレス負荷24時間後のHCE細胞とHeLa細胞におけるアポトーシス細胞の比較．平均±標準偏差，n＝3，#p＜0.01，＄p＜0.01vsCont（t検定）．AB＊＊1.2＊＊＊＊＊＊1＊＊0.80.60.40.20（μM）（pg/mL）（pg/mL）C24504501.81.61.41.2＊＊1＊＊0.8＊＊＊＊0.60.40.2400（24h）（24h）（24h）（24h）400$#350＊＊＊＊350300300IL-6levels2502502002001501501001005050000（1361524μM）Incubationtime（hours）HyperContHCEcellsHeLacells図2高浸透圧ストレス負荷後のIL.6生成量HCE細胞またはHeLa細胞における高浸透圧ストレス負荷後のIL-6生成量を，ELISA法を用いて測定した．A：HCE細胞に対する高浸透圧ストレス負荷後のIL-6生成量の1,3,6,15,24時間後の経時的変化．平均±標準偏差，n＝6．＊p＜0.05，＊＊p＜0.01vsCont（t検定）．B：高浸透圧ストレス負荷後24時間のHCE細胞とHeLa細胞におけるIL-6生成量の比較．平均±標準偏差，n＝3，#p＜0.01，＄p＜0.01vsCont（t検定）870あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016図3高浸透圧負荷1時間後のMAPK（ERK，JNK，p38MAPK）リン酸化能とカテキン類による抑制効果HCE細胞にMAPKi，EGCG（5,10,20μM），EGCG3Me（5,10,20μM）を添加し，1時間後に高浸透圧ストレスを負荷した．その後1時間インキュベートし，各MAPKのリン酸化能をELISA法にて測定した．結果は，全MAPKに対するリン酸化されたMAPKの割合で示した．A：ERKリン酸化能，B：JNKリン酸化能，C：p38MAPKリン酸化能．平均±標準偏差，n＝6.12，＊p＜0.05，＊＊p＜0.01vsHyper（ANOVA-Bonferroni多重比較検定）．（110）0350400450（pg/mL）＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊（ContHyperp38i（1）（10）EGCG（5）（10）（20）（5）（10）（20）0350400450（pg/mL）＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊（ContHyperp38i（1）（10）EGCG（5）（10）（20）（5）（10）（20）IL-6levels300250200150図4高浸透圧負荷後24時間後のIL.6生成量に対するカテキン類の抑制効果100HCE細胞にJNKi，p38MAPKi，EGCG（5,10,20μM），50EGCG3Me（5,10,20μM）を添加し，1時間後に高浸透圧ストレスを負荷した．その後24時間インキュベートし，培養液の上清を用い，ELISA法にてIL-6生成量を測定した．平均±標準偏差，n＝6．＊p＜0.05，＊＊p＜0.01vsHyper（ANOVA-Bonferroni多重比較検定）．μM）ContHyperEGCGEGCG3”Me図5高浸透圧ストレス負荷後1時間の67LRに対する免疫細胞染色HCE細胞に，EGCG（10μM）またはEGCG3Me（10μM）を添加し，1時間後に高浸透圧ストレスを負荷した．その後1時間インキュベートし，細胞をホルマリン固定後，ENVISION染色システムを用い，一次抗体として抗67LR抗体を2時間反応させた後，二次抗体とペルオキシダーゼが結合しているデキストランポリマー試薬を1時間反応させて，核や細胞質の染色を行った（×200）．（111）あたらしい眼科Vol.33，No.6，20168710.080；n＝6.p38MAPK：Cont群0.529±0.060,Hyper群0.529±0.014；n＝6）．4.HCE細胞における高浸透圧ストレス負荷24時間後のIL.6生成に対するカテキン類の抑制効果図4にHCE細胞における高浸透圧ストレス負荷24時間後のIL-6生成量に対するEGCG,EGCG3”Meの抑制効果を示した．高浸透圧ストレス負荷後24時間で，Cont群と比べIL-6生成量は有意に上昇した（n＝12,p＜0.01）．これに対しEGCG3”MeでIL-6生成量は濃度依存的に抑制され，20μMで有意な抑制効果を認めた（n＝6,p＜0.01）．一方，EGCGでは抑制効果は認められなかった．5.高浸透圧ストレス負荷による67LR発現誘導の免疫細胞染色図5にEGCGまたはEGCG3”Meを添加したHCE細胞における高浸透圧ストレス負荷1時間後の67LRの免疫細胞染色を示す．67LRは，カテキンの受容体として見出されている膜蛋白で6），EGCGで67LRの明らかな発現誘導が確認された．一方，EGCG3”Meではcontrolと比べ変化は認められなかった．III考按ドライアイ患者においては，涙液浸透圧とドライアイの重症度が相関するといわれている．米国でのドライアイ診断基準にあたるDryEyeWorkShop（DEWS）Reportによると，涙液浸透圧の正常カットオフ値は316mOsm/Lとされている2,7）．ドライアイ患者における涙液浸透圧は平均326.9±22.1mOsm/Lであり，健常人の平均302±9.7mOsm/Lに比べかなり高く7），涙液中に炎症性サイトカインが増加するという報告がある8,9）．角膜細胞を用いて塩化ナトリウムまたはスクロースを添加した培養液（350.600mOsm/L）を用いて高浸透圧ストレス負荷を施した報告が散見され，とくに450mOsm/L以上の高浸透圧負荷により，炎症性サイトカインの著明な上昇を認めたなどの報告10,11）がある．そこで今回，HCE細胞に高浸透ストレス負荷（423mOsm/L）を行った結果，アポトーシスの割合と，炎症性サイトカイン（IL-6）の生成量の経時的増加が確認され，炎症が惹起されていることが確認された．今回，データは示していないが，TNF-a，IL-1bも同様に測定した結果，TNF-a生成量は有意差はなく，IL-1bは検出限界以下であった．細胞外からの種々刺激により活性化され，核へのシグナル伝達を媒介するMAPKリン酸化能を測定した結果，高浸透圧ストレス負荷1時間でJNKとp38MAPKリン酸化能の有意な上昇が確認されたが，ERKでは変化が認められなかった．MAPKのなかでもとくに，JNK,p38MAPKは，UV，ROS（reactiveoxygenspecies），高浸透圧，熱ショックなどの物理化学的ストレスなどによって活性化されるストレス応答キナーゼで，アポト872あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016ーシス誘導などに深く関与している．今回の高浸透圧ストレス負荷により，HCE細胞ではJNK，p38MAPKの活性化およびIL-6生成量の明らかな増加が確認されたが，HeLa細胞においてはいずれも認めなかった．このことから，このストレスはHCE細胞に由来するものと判断し，カテキン類による抑制効果を検討した．近年，カテキン類を代表とする茶葉成分に関する研究報告が散見される．緑茶に含まれるEGCGは茶特有のポリフェノール成分で，他の植物には見出されていない4）．最近，新規カテキンのEGCG3”Meが見出された．日本緑茶の「べにふうき」「べにふじ」といった品種に多く含まれており，いわゆる代表的な品種である「やぶきた」にはまったく含まれていない．先にも述べたが，緑茶カテキンには多彩な生理機能が解明されており，なかでも，抗腫瘍作用や抗アレルギー作用は，EGCGが多種の細胞の細胞膜表面に局在している67kDalamininereceptor（67LR）に結合することで活性を示すことが報告されている6）．EGCGは67LRを介した癌細胞における細胞増殖抑制作用のほか，ヒト好塩基球細胞株におけるヒスタミン放出抑制作用やIgE受容体発現低下作用などが報告されている12）．今回のHCE細胞に対する高浸透圧ストレス負荷では，JNK，p38MAPKを介してIL-6を生成することで，炎症が惹起されていることが示唆された．この炎症に対する，EGCGまたはEGCG3”Meの抑制効果について検討した結果，JNKリン酸化能はEGCGで，p38MAPKリン酸化能はEGCG3”Meで抑制されることが示唆された．また，IL-6生成量はEGCG3”Meで濃度依存的に抑制されたのに対し，EGCGでは変化がないか高濃度では逆に増加する結果となった．これまでに，腫瘍細胞に対するEGCGの抗腫瘍効果なども報告されており12,13），高濃度のEGCGによる細胞障害作用が現れたものと考えられる．EGCGおよびEGCG3”Meを添加し，高浸透圧ストレス負荷1時間後，67LRの免疫細胞化学染色を行った結果，EGCG3”MeよりもEGCGで強い発現誘導が確認された．このことから，EGCGはおもに67LRへの結合を介してシグナル伝達されているのに対し，EGCG3”Meには67LRとは別の経路が関与していることが示唆された．すなわち，EGCG3”MeはEGCGに比べ脂溶性が高いことから，膜を直接透過する可能性が考えられる．以上のことから，それぞれ異なった細胞内シグナル伝達経路を介して抗炎症作用を示し，その作用はEGCGよりもEGCG3”Meのほうがより効果的である可能性が示唆された．Leeら14）は，0.1％EGCG溶液の点眼により角膜上皮障害が改善したと報告している．さらに，EGCGやEGCG3”Meは飲用後，血中への移行も確認されている．すなわち，毛細血管が豊富である結膜に移行し，眼表面の抗炎症作用を示す（112）可能性は高い．市販のペットボトル入りべにふうき緑茶を，約200ml飲用したときの摂取量とAUC（areaunderthebloodconcentration-timecurve）の割合で比較すると，移行の割合はEGCG3”MeのほうがEGCGに比べて6.5倍高いことが示されている15）．また，アレルギー性鼻炎患者を対象としたヒト介入試験において，EGCG3”Me摂取により眼の痒みや流涙を含む花粉症症状の明らかな軽減作用がみられたと報告されており，その際のEGCG3”Me摂取量は34mg/dayとされている16）．これは市販のペットボトル1.5本分（約750ml）の飲用に相当する．涙液浸透圧と血漿浸透圧に強い相関があり，飲水自体に涙液浸透圧を下げるとの報告17,18）があることから，日常的に茶を飲用する習慣がある日本人にはドライアイによる高浸透圧ストレス誘発炎症に対しても，抗炎症効果が期待できるかもしれない．以上のことから，べにふうき緑茶飲用がドライアイ治療に有用である可能性が示唆された．利益相反：利益相反公表基準に該当なし文献1）UchinoM,YokoiN,UchinoYetal：Prevalenceofdryeyediseaseanditsriskfactorsinvisualdisplayterminalusers：theOsakastudy.AmJOphthalmol156：759-766,20132）MichaelAL,GaryNF：Thedefinitionandclassificationofdryeyedisease.OculSurf5：75-92,20073）SternME,PflugfelderSC：Inflammationindryeye.OculSurf2：124-130,20044）山本（前田）万里：抗アレルギー効果のある茶葉成分．日本補完代替医療学雑誌3：53-60,20065）CavetME,HarringtonKL,VollmerTRetal：Antiinflammatoryandanti-oxidativeeffectsofthegreenteapolyphenolepigallocatechingallateinhumancornealepithelialcells.MolVis17：533-542,20116）TachibanaH,KogaK,FujimuraYetal：AreceptorforgreenteapolyphenolEGCG.NatStructMolBiol11：380381,20047）TomlinsonA,KhanalS,DiaperCetal：Tearfilmosmolarity-determinationofareferentfordryeyediagnosis.InvestOphthalmolVisSci47：4309-4315,20068）NaKS,MokJW,KimJYetal：Correlationsbetweentearcytokines,chemokines,andsolublereceptorsandclinicalseverityofdryeyedisease.InvestOphthalmolVisSci53：5443-5450,20129）BoehmN,RiechardtAI,WiegandMetal：Proinflammatorycytokineprofilingoftearsfromdryeyepatientsbymeansofantibodymicroarrays.InvestOphthalmolVisSci52：7725-7730,201110）LuoL,LiDQ,CorralesRMetal：Hyperosmolarsalineisaproinflammatorystressonthemouseocularsurface.EyeContactLens31：186-193,200511）LiDQ,ChenZ,SongXJetal：StimulationofmatrixmetalloproteinasesbyhyperosmolarityviaaJNKpathwayinhumancornealepithelialcells.InvestOphthalmolVisSci45：4302-4311,200412）立花宏文：緑茶カテキンの受容体とシグナリング．生化学81：290-294,200913）SuzukiY,MiyoshiN,IsemuraM：Health-promotingeffectsofgreentea.ProcJpnAcadSerBPhysBiolSci88：88-101,201214）LeeHS,ChauhanSK,OkanoboAetal：Therapeuticefficacyoftopicalepigallocatechingallate（EGCG）inmurinedryeye.Cornea30：1465-1472,201115）Maeda-YamamotoM,EmaK,ShibuichiI：Invitroandinvivoanti-allergiceffectsof‘benifuuki’greenteacontainingO-methylatedcatechinandgingerextractenhancement.Cytotechnology55：135-142,200716）安江正明，大竹康之，永井寛ほか：「べにふうき」緑茶の抗アレルギー作用並びに安全性評価：軽症から中等症の通年性アレルギー性鼻炎患者，並びに健常者を対象として．日本食品新素材研究会誌8：65-80,200517）WalshNP,FortesMB,Raymond-BarkerPetal：Iswhole-bodyhydrationanimportantconsiderationindryeye?InvestOphthalmolVisSci53：6622-6627,201218）FortesMB,DimentBC,DiFeliceUetal：Tearfluidosmolarityasapotentialmarkerofhydrationstatus.MedSciSportsExerc43：1590-1597,2011＊＊＊（113）あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016873

《第35回日本眼薬理学会原著》あたらしい眼科33（6）：863.866，2016c表面麻酔薬オキシブプロカイン塩酸塩点眼液の角膜傷害性評価長井紀章＊1真野裕＊1辰巳賀陽子＊1川﨑真緒＊1伊藤吉將＊1岡本紀夫＊2下村嘉一＊2＊1近畿大学薬学部製剤学研究室＊2近畿大学医学部眼科学教室InVitroandVivoEvaluationofCornealDamageCausedbyCommerciallyAvailableOxybuprocaineEyedrops,usingHumanandRatCornealEpithelialCellsNoriakiNagai1）,YuMano1）,KayokoTatsumi1）,MaoKawasaki1）,YoshimasaIto1）,NorioOkamoto2）YoshikazuShimomura2）and1）FacultyofPharmacy,KinkiUniversity,2）DepartmentofOphthalmology,KinkiUniversitySchoolofMedicine本研究では，表面麻酔薬オキシブプロカイン塩酸塩点眼液の角膜傷害性について評価を行った．実験にはベノキシールR点眼液0.4％（先発品）とオキシブプロカイン塩酸塩点眼液0.4％「ニットー」（ジェネリック医薬品，以下GE）を用いた．角膜傷害性は，ヒト角膜上皮細胞と1次速度式から算出した急性，慢性毒性にて評価した．また，ラット角膜上皮.離モデルを用い，オキシブプロカイン塩酸塩点眼液点眼が角膜治癒へ与える影響についても検討した．GEの急性毒性は，先発品と比較し低値であった．一方，慢性毒性は，先発品とGE間で差は認められず，ラット角膜上皮.離モデルを用いた系においても，GE点眼群の角膜傷害治癒速度は先発品のそれと同程度であった．以上，市販オキシブプロカイン塩酸塩点眼液の角膜傷害性を明らかにした．本研究結果は，眼に優しい表面麻酔薬開発への一つの指標になるものと考える．Inthisstudy,weinvestigatedcornealcelldamagecausedbycommerciallyavailableoxybuprocaineeyedrops,suchasBenoxilRophthalmicsolution0.4％（originaldrug）andoxybuprocainehydrochlorideophthalmicsolution0.4％「NITTO」（genericdrug,GE）.Acuteandchronictoxicitywerecalculatedusingculturedcornealepitheliumcells（HCE-T）andfirst-orderrateequation；theeffectoftheeyedropsoncornealwoundhealingwasdemonstratedusingratdebridedcornealepithelium.AlthoughtheacutetoxicityofHCE-TcellstreatedwithGEwassignificantlylowerthanwiththeoriginaldrug,thechronictoxicitydidnotdifferbetweentheoriginaldrugandGE.Inaddition,cornealwoundhealinginratsinstilledwithGEwasalsosimilartothatoftheoriginaldrug.Thesefindingsprovidesignificantinformationforuseindesigninglocalanaestheticeyedropsfreeofcelldamage.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）33（6）：863.866,2016〕Keywords：オキシブプロカイン塩酸塩，ジェネリック医薬品，角膜傷害，点眼薬，表面麻酔薬．oxybuprocainehydrochloride,genericdrugs,cornealdamage,eyedrops,localanaestheticeyedrops.はじめにオキシブプロカイン塩酸塩点眼液は，眼科領域における検査や手術時に用いられる優れた表面麻酔薬である．しかし，表面麻酔薬の濫用により重篤な角膜傷害を起こした症例が報告されており，鎮痛などを目的とした頻回投与は副作用発現防止のため，注意喚起されている．これらオキシブプロカイン塩酸塩点眼液による角膜傷害には，使用時の涙液分泌の低下と，主薬であるオキシブプロカイン塩酸塩や保存剤（ベンザルコニウム塩化物，BAC）による細胞毒性が知られており，臨床での使用は制限されている．一方，2013年6月にオキシブプロカイン塩酸塩のジェネリック医薬品としてオキシブプロカイン塩酸塩点眼液0.4％「ニットー」（日東メ〔別刷請求先〕伊藤吉將：〒577-8502東大阪市小若江3-4-1近畿大学薬学部製剤学研究室Reprintrequests：YoshimasaIto,Ph.D.,FacultyofPharmacy,KinkiUniversity,3-4-1Kowakae,Higashi-Osaka,Osaka577-8502,JAPAN0910-1810/16/\100/頁/JCOPY（103）863ディック）が販売された．本製剤は先発品と比較し，保存剤であるBAC濃度の減少および増粘剤の追加がなされているが，薬効は同程度と報告されており1），製剤工夫による副作用発現の低下や用途拡大が期待できる．点眼薬の角膜傷害性を検討するうえで，評価系の選択はきわめて重要である．角膜傷害は，点眼薬中に含まれる主薬，添加剤，保存剤だけでなく，角膜知覚，涙液動態および結膜といったオキュラーサーフェス（眼表面）の状態が関与することが知られており，臨床および基礎両面からの観察が重要であると考えられている．筆者らはこれまで，不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T）および1次速度式を用いた細胞傷害性解析にて，急性および慢性毒性を算出する方法（invitro角膜上皮細胞傷害性評価）が点眼薬の角膜傷害性強度を明らかとするうえで有用であることを報告してきた2,3）．また，角膜上皮.離ラットを用いることで，invivo系における薬物角膜傷害強度が評価可能であることを明らかとしてきた4）．そこで今回，これらinvitro，invivo角膜傷害性評価法を用いることで，現在臨床現場で使用されているオキシブプロカイン塩酸塩点眼液先発品およびジェネリック医薬品の角膜傷害性評価を行った．I対象および方法1.使用細胞培養細胞は不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T，RCBNo.1384）を用い，1,000IU/mLペニシリン（GIBCO社製），100mg/mLストレプトマイシン（GIBCO社製）および5％ウシ胎児血清（FBS，GIBCO社製）を含むDMEM/F12培地（GIBCO社製）にて培養した．2.使用薬物眼科用表面麻酔薬は臨床現場にて多用されるオキブプロカイン塩酸塩点眼液先発品（ベノキシールR点眼液0.4％，参天製薬）およびジェネリック医薬品（オキシブプロカイン塩酸塩点眼液0.4％「ニットー」，日東メディック）を用いた．表1に両製剤の組成を示す．3.角膜上皮細胞傷害性の評価筆者らが確立し報告してきたinvitro角膜上皮細胞傷害性評価法に従い行った2,3）．HCE-T細胞を96wellプレートに100mL（1×104個）ずつ播種し，24時間培養（37℃，5％CO2条件下）したものを実験に用いた．実験操作は以下のようにして行った．HCE-T細胞を10.120秒薬剤にて処理後，PBSにて2回洗浄し，各wellにナカライ社製CellCountReagentSFを含有する培地120mLを加え，1時間処理（37℃，5％CO2）後，マイクロプレートリーダー（BIO-RAD社製）にて450nmの吸光度（Abs）を測定した．本研究では，薬剤処理後の細胞死亡率（％）を次式（1）により算出した．細胞死亡率（％）＝（Abs未処理.Abs薬剤処理）/Abs未処理×100（1）また，薬剤処理が細胞傷害へ与える影響をより詳細に検討するために，次式（2）を用いて解析を行った．Dt＝D∞（1.e.kDt）（2）kDは細胞傷害速度定数（min.1），tは点眼薬処理後の時間（0.2分），D∞およびDtは薬剤処理∞およびt分後の細胞死亡率を示す．本研究ではkD，D∞をそれぞれ急性毒性および慢性毒性として表すパラメーターとした．また，先発品およびジェネリック医薬品に含まれる添加物中の急性，慢性毒性の評価には，眼科用剤の最大許容濃度を使用した．4.ラット角膜上皮.離モデルを用いた角膜傷害治癒解析イソフルラン麻酔下，生検トレパンで円形にラット角膜を形取り，ブレードで角膜上皮を.離した（.離面積10.1±0.6,mm2；平均値±標準誤差）．実験時には点眼液を1日3回（9：00，15：00，21：00）1回30μL，実験終了まで点眼した．角膜上皮欠損部分の推移は，角膜.離0，6，24時間後に1％フルオレセイン含有0.4％ベノキシール点眼液にて染色し，トプコン社製眼底カメラ装置TRC-50Xで撮影した画像をImageJにて解析することで評価した．角膜傷害治癒率（％）は，次式（3）にて算出した4）．角膜傷害治癒率（％）＝（面積.離直後.面積.離6,24時間後）/面積.離直後×100（3）5.統計解析得られたデータは平均値±標準誤差として表した．各々の実験値はStudentのt-testにより解析した．また，本研究ではp値が0.05以下を有意差有りとした．表1オキシブプロカイン塩酸塩点眼液先発品およびジェネリック医薬品の組成先発品塩化ナトリウムエデト酸ナトリウム水和物ベンザルコニウム塩化物（0.004％）ポリビニルアルコールpH調整剤（）内の数値は濃度を示す．ジェネリック医薬品塩化ナトリウムエデト酸ナトリウム水和物ベンザルコニウム塩化物（0.002％）ヒプロメロースpH調整剤864あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016（104）A0時間6時間24時間先発品020304050600.0細胞死亡率（％）10先発品●ジェネリック医薬品＊＊＊0.51.01.52.0ジェネリック処理時間（分）医薬品図1HCE.Tを用いたオキシブプロカイン塩酸塩点眼液の細胞傷害性評価平均値±標準誤差，n＝6．＊p＜0.05,vs.先発品．B100先発品■ジェネリック医薬品角膜傷害治癒度（％）80604020表2オキシブプロカイン塩酸塩点眼液先発品およびジェネリック医薬品処理による角膜傷害性の比較先発品ジェネリック医薬品kD（min.1）3.10±0.391.29±0.22＊D∞（％）56.4±2.763.3±7.0平均値±標準誤差，n＝6．＊p＜0.05,vs.先発品．II結果1.オキシブプロカイン塩酸塩点眼液先発品およびジェネリック医薬品の角膜傷害性比較図1はオキシブプロカイン塩酸塩点眼液処理時におけるHCE-T細胞の死亡率を示す．また，表2にはオキシブプロカイン塩酸塩点眼液処理時における急性毒性（kD）と慢性毒性（D∞）を示す．結果から，両製剤処理群の傷害性強度に差がみられ，市販オキシブプロカイン塩酸塩点眼液のジェネリック医薬品を30秒処理した際の細胞死亡率は31.7±1.0％と，先発品（45.8±4.1％）と比較し細胞傷害性は有意に低値であった（平均値±標準誤差，n＝6）．また，ジェネリック医薬品の急性毒性は，先発品と比べ低値を示したが，慢性毒性においては，先発品とジェネリック医薬品間で差は認められなかった．一方，BAC単独処理実験にて0.002％と0.004％BACの30秒処理後の細胞傷害性を調べたところ，それぞれ7.1±1.9％，19.7±3.6％であり，単独2分処理後の細胞傷害性は21.3±5.1％，29.3±5.5％であった（平均値±標準誤差，n＝6）．加えて，先発品中に含まれる増粘剤ポリビニルアルコールおよびジェネリック医薬品中の増粘剤ヒプロメロースの慢性毒性を算出したところ，1％ポリビニルアルコールは4.7±2.1％，0.35％ヒプロメロースでは6.6±2.5％であった（薬剤処理時間2分，平均値±標準誤差，n＝6）．また，先発品およびジェネリック医薬品両製剤に含まれる添加物0.9％塩化ナトリウムおよび0.12％エデト酸ナトリウムの慢性毒性は，0.6±0.1％，9.8±2.4％であった（薬剤処理時間2分，平均値±標準誤差，n＝6）．図2はオキシブプロカ（105）06時間24時間.離後の時間図2オキシブプロカイン塩酸塩点眼液点眼が角膜傷害治癒へ与える影響A：代表的角膜画像（破線内は傷害部分を表す）．B：オキシブプロカイン塩酸塩点眼液点眼後の角膜傷害治癒度度．平均値±標準誤差，n＝5．イン塩酸塩点眼液点眼に伴うラット角膜傷害治癒速度の変化を示す．Invitro系の慢性毒性の結果と同様，ラット角膜上皮.離モデルを用いた系では，先発品およびジェネリック医薬品間で差はみられなかった．III考按オキシブプロカイン塩酸塩点眼液は，眼科領域における検査や手術時に用いられるが，濫用により重篤な角膜傷害を起こすことが知られている．本研究では2013年6月に販売開始されたオキシブプロカイン塩酸塩点眼液のジェネリック医薬品における角膜上皮細胞毒性（副作用）について先発品と比較評価した．まず，オキシブプロカイン塩酸塩点眼液の先発品とジェネリック医薬品のinvitro角膜上皮傷害評価を行ったところ，両処理群において処理時間の増加とともに細胞死亡率が増加し，その急性毒性は先発品＞ジェネリック医薬品であった（表2）．これら点眼製剤の角膜傷害性には保存剤の関与が知られている．点眼剤中に含まれる保存剤は，二次汚染を防止し安全に使用するために必要不可欠である．しかし，一般に保存剤は細菌を殺すという性質上，使用後の“しみる”，“かあたらしい眼科Vol.33，No.6，2016865すむ”，眼の充血をはじめ，点眼表層角膜症や眼瞼炎といった眼局所の副作用発現に繋がり，臨床において問題視されている5）．今回検討したオキシブプロカイン塩酸塩点眼液にはBACが保存剤として用いられており，BACは陽電荷をもつ原子団が菌体表面に吸着することで細胞膜破壊，細胞内の酵素蛋白の変性，呼吸系の阻害を引き起こすことが報告されている6.8）．一方，先発品中に含まれるBAC濃度は0.004％であったが，ジェネリック医薬品ではBAC濃度が0.002％と半分に軽減されている．さらに，0.002％と0.004％BAC単独30秒処理時の細胞傷害性は，それぞれ7.1％，19.7％であったことから，両製剤間の急性毒性の違い（先発品＞ジェネリック医薬品）にはBAC濃度の差が関与しているものと示唆された．これら急性毒性とは異なり，慢性毒性は両製剤ともに約60％であり，先発品とジェネリック医薬品間で差は認められなかった．そこで次に，これら慢性毒性の差を明らかとすべく，BAC濃度0.002％と0.004％の単独2分処理後の細胞傷害性を調べた．その結果，BAC濃度0.002％と0.004％の細胞傷害性はそれぞれ21.3％，29.3％であり，両製剤の慢性毒性に比べ低値であることから，BAC以外の要因が慢性毒性には強く関与しているものと示唆された．オキシブプロカイン塩酸塩点眼液の先発品とジェネリック医薬品の組成の違いとして，BAC濃度の差に加え，異なる増粘剤が用いられていることが挙げられる（表1）．しかし，先発品中に含まれる増粘剤ポリビニルアルコールおよびジェネリック医薬品中の増粘剤ヒプロメロースの慢性毒性を算出してみたところ，1％ポリビニルアルコールと0.35％ヒプロメロースの慢性毒性はともに低値であった．また，両製剤に含まれる添加物0.9％塩化ナトリウムと0.12％エデト酸ナトリウムの慢性毒性はほとんどみられなかった．このように，含有される添加物の細胞傷害性と比較し，オキシブプロカイン塩酸塩点眼液の細胞傷害性（慢性毒性）が高いことから，これら製剤の慢性毒性には，主薬であるオキシブプロカイン自身がもっとも強く関与していることが示唆された．さらに，invivo系にて両製剤が角膜傷害治癒に与える影響を検討したところ，invitro慢性毒性と同様，先発品およびジェネリック医薬品間で差はみられなかった．オキシブプロカイン塩酸塩などの表面麻酔薬は，その麻酔作用により涙液分泌の低下がみられ，薬物による傷害性が高まる危険性が考えられる．また，本invitro系実験にて，オキシブプロカイン塩酸塩の慢性毒性には，主薬がもっとも強く関与していることを示した．以上，オキシブプロカイン塩酸塩点眼液では，BAC濃度を減らすことで，細胞傷害の誘発率を反映する急性毒性の減弱がみられるが，傷害度強度や傷害治癒への影響にかかわる慢性毒性の軽減のためには，もともと0.004％と低濃度であるBACの含量の減弱よりも，主薬自身の傷害性を抑制するような工夫が必要であることを示した．本研究結果は，表面麻酔薬選択や眼に優しい局所麻酔薬の開発における一つの指標になるものと考える．利益相反：利益相反公表基準に該当なし文献1）日東メディック株式会社：オキシブプロカイン塩酸塩点眼液0.4％「ニットー」．添付文書20132）NagaiN,MuraoT,OkamotoNetal：Comparisonofcornealwoundhealingratesafterinstillationofcommerciallyavailablelatanoprostandtravoprostinratdebridedcornealepithelium.JOleoSci59：135-141,20103）長井紀章，大江恭平，森愛里ほか：各種保存剤を用いた市販緑内障治療（配合）点眼液における角膜傷害性のキネティクス解析．あたらしい眼科30：1023-1028,20134）NagaiN,YoshiokaC,ManoYetal：Ananoparticleformulationofdisulfiramprolongscornealresidencetimeofthedrugandreducesintraocularpressure.ExpEyeRes132：115-123,20155）瀧沢岳，片岡伸介，小高明人ほか：ホウ酸含有点眼剤組成の抗菌メカニズム．あたらしい眼科27：518-522,20106）DebbaschC,PisellaPJ,DeSaintJeanMetal：Mitochondrialactivityandglutathioneinjuryinapoptosisinducedbyunpreservedandpreservedbeta-blockersonChangconjunctivalcells.InvestOphthalmolVisSci42：25252533,20017）DeSaintJeanM,BrignoleF,BringuierAF：EffectsofbenzalkoniumchlorideongrowthandsurvivalofChangconjunctivalcells.InvestOphthalmolVisSci40：619-630,19998）DebbaschC,BrignoleF,PisellaPJetal：Quaternaryammoniumsandotherpreservatives’contributioninoxidativestressandapoptosisonChangconjunctivalcells.InvestOphthalmolVisSci42：642-652,2001＊＊＊866あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016（106）

《第35回日本眼薬理学会原著》あたらしい眼科33（6）：857.861，2016c点眼用添加物EDTAが種々保存剤の抗菌力および角膜傷害性へ与える影響長井紀章＊1田辺航＊1辻朗子＊1勝井結美＊1伊藤吉將＊1岡本紀夫＊2下村嘉一＊2＊1近畿大学薬学部製剤学研究室＊2近畿大学医学部眼科学教室EffectofEDTAonAntimicrobialActivityandCornealToxicityofVariousEyedropPreservativesNoriakiNagai1）,WataruTanabe1）,AkikoTsuji1）,YumiKatsui1）,YoshimasaIto1）,NorioOkamoto2）YoshikazuShimomura2）and1）FacultyofPharmacy,KinkiUniversity,2）DepartmentofOphthalmology,KinkiUniversitySchoolofMedicine今回筆者らは，一般的な点眼用添加剤である安定化剤エチレンジアミン四酢酸（EDTA）が，各種保存剤の抗菌力および角膜傷害性に与える影響について検討を行った．保存剤はベンザルコニウム塩化物（BAC），パラオキシ安息香酸メチル（MP），パラオキシ安息香酸プロピル（PP），亜塩素酸ナトリウム（SC）およびクロルヘキシジングルコン酸塩（CHG）の計5種を用いた．また，抗菌力および角膜傷害性の確認には大腸菌（E.coli，ATCC8739），ヒト角膜上皮細胞（HCE-T）を用いた．その結果，EDTA併用下において，BACの抗菌力上昇が認められたが，細胞傷害性に変化はみられなかった．一方，他の4剤の保存剤では，EDTAとの併用により抗菌力および細胞傷害性の低下がみられた．以上，点眼薬処方におけるEDTA使用は，保存剤の抗菌力や細胞傷害性に影響を与えることを明らかとした．本研究成果は，点眼薬処方設計の一つの指標になるものと考える．Inthisstudy,weinvestigatedtheeffectofethylenediaminetetraaceticacid（EDTA）ontheantimicrobialactivityandcornealtoxicityofvariouspreservatives,usingEscherichiacoli（E.coli,ATCC8739）andculturedcornealepitheliumcells（HCE-T）.Benzalkoniumchloride（BAC）,methylparahydroxybenzoate（MP）,propylparahydroxybenzoate（PP）,sodiumchlorite（SC）andchlorhexidinegluconate（CHG）wereusedaspreservativesinthisstudy.AlthoughtheantimicrobialactivityofBACwasincreasedbytheadditionofEDTA,thecornealtoxicityofBACwassimilartothatofthecombinationofEDTAandBAC.Ontheotherhand,boththeantimicrobialactivityandcornealtoxicityofMP,PP,SCandCHGweredecreasedbytheadditionofEDTA.TheseresultsshowthattheuseofEDTAasanophthalmicpharmaceuticaladditiveaffectstheantimicrobialactivityandcornealtoxicityofpreservatives.Thesefindingsprovidesignificantinformationforuseinthedesigningofeyedrops.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）33（6）：857.861,2016〕Keywords：保存剤，エチレンジアミン四酢酸，抗菌力，角膜毒性，点眼薬．preservatives,ethylenediaminetetraaceticacid,antimicrobialactivity,cornealtoxicity,eyedrops.はじめに医薬品は主成分となる薬剤（主剤）のみでは製剤とはいえず，これに製剤設計上必要な薬剤（添加剤）が加えられ初めて製剤となる．点眼薬においても同様であり，一般的に点眼薬には可溶化剤（ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油，ポリソルベート80，ポビドンなど），安定化剤（ポリソルベート80，ポビドン，エチレンジアミン四酢酸（EDTA）など），等張化剤（塩化ナトリウム，ブドウ糖，マンニトールなど），緩衝剤（酢酸ナトリウム水和物，炭酸水素ナトリウム，ホウ酸など），pH調節剤（希塩酸，水酸化ナトリウムなど），保存剤（ベンザルコニウム塩化物（BAC），パラオキシ安息香酸メチル（MP），パラオキシ安息香酸プロピル（PP），亜塩〔別刷請求先〕伊藤吉將：〒577-8502東大阪市小若江3-4-1近畿大学薬学部製剤学研究室Reprintrequests：YoshimasaIto,Ph.D.,FacultyofPharmacy,KinkiUniversity,3-4-1Kowakae,Higashi-Osaka,Osaka577-8502,JAPAN0910-1810/16/\100/頁/JCOPY（97）857素酸ナトリウム（SC），クロルヘキシジングルコン酸塩（CHG）など）が含まれる．なかでもこれら点眼薬中に含まれる保存剤は，二次汚染を防止し安全に使用するために必要不可欠である．現在市販されている点眼薬では，保存剤の約7割にBACが用いられ，約2割にパラベン類（MPやPP），そしてその他の約1割にSCやCHGなどが使用されている．しかし，これら保存剤の長期連続投与は，使用後の“しみる”“かすむ”，眼の充血をはじめ，点眼表層角膜症や眼瞼炎とい(，)った眼局所の副作用発現に繋がるため，臨床において問題視されている1）．したがって，抗菌力が高く，角膜傷害性の少ない眼にやさしい新たな製剤処方の開発が望まれている．このような背景から，眼科領域では1回使い切りタイプの容器やPFデラミ容器R（容器を二層構造とし点眼薬に添加される保存剤を不要にしたもの）などが市販されている．また，配合剤や細胞毒性の低い新規保存剤の開発のための研究も進められている1）．一方，製剤処方において，主薬と添加物の相互作用についてはいまだ十分に検討はなされておらず，添加物が各種保存剤の抗菌力や角膜毒性に与える影響を明確にすることは，眼にやさしく，高い抗菌力を維持する製剤処方の確立において非常に重要である．そこで今回，基礎研究として代表的点眼製剤用添加物であるEDTAが保存剤各種の抗菌力および角膜傷害性に与える影響について検討を行った．I対象および方法1.使用薬物点眼用添加物である安定化剤EDTAと保存剤として多用されているBAC，MP，PP，SCおよびCHGの計6種を用いた．各種試験溶液は，EDTAと各種保存剤（BAC，MP，PP，SC，CHG）を精製水で溶解し，細孔径0.2μmのメンブランフィルターで濾過滅菌することで調製した．角膜細胞傷害性の評価に用いたEDTAの濃度は，過去の報告に従い2），眼科用最大許容投与量（0.127％）以下である0.1％（1mg/mL）とした2）．また，各種保存剤濃度は，臨床で用いられる濃度を参考に，いずれも0.005％（50mg/mL）とした．2.最小発育阻止濃度（MIC）の測定試験菌株には，独立行政法人製品評価技術機構から購入した大腸菌（E.coli，ATCC8739）を用い，MICの測定は微量液体希釈法に従い行った1）．また，感受性測定用培地はMuellerHintonBroth（日本ベクトン・ディッキンソン）を用いた．実験操作は以下のようにして行った．まず，E.coliを寒天培地上で18.24時間培養（35±1℃）後，滅菌生理食塩液にて試験菌が1×108個含まれる菌液を調製し，薬液と1×106個/mLの生菌数になるように混合した（試験液）．これらの試験液を含む容器を22.5±2.5℃の条件下で遮光保存し，28日後の試験溶液中生菌数の確認を行った．生菌数の858あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016確認にはカンテン平板混釈法を用い，対照に用いた薬剤不含有培地での菌の発育を確認後，菌の発育が肉眼的に認められないwellのうち最小の薬剤濃度をMICとした1）．3.角膜上皮細胞傷害性の評価培養細胞は理化学研究所より購入した不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T，RCBNo.1384）を用い，角膜細胞傷害性の評価は，筆者らが確立し報告してきたinvitro角膜上皮細胞傷害性評価法に従った2.4）．HCE-T細胞を96wellプレートに100mL（1×104個）ずつ播種し，37℃，5％CO2インキュベーター内で24時間培養したものを実験に用いた．実験操作は以下のようにして行った．HCE-T細胞を10.120秒薬剤にて処理後，PBSにて2回洗浄し，各wellに100mLの培地およびCellCountReagentSF（ナカライラスク社製）20mLを加え，37℃，5％CO2インキュベーター内で1時間処理後，450nmの吸光度（Abs）を測定した．薬剤処理後の細胞死亡率（％）は次式（1）により算出した．細胞死亡率（％）＝（Abs未処理.Abs薬剤処理）/Abs未処理×100（1）4.統計解析実験は1群に対し8回（検体）行い，得られたデータは平均値±標準誤差（SE）として表した．各々の実験値はStudentのt-testにより解析した．また，本研究ではp値が0.05以下を有意差ありとした．II結果1.EDTA添加に伴う種々保存剤の抗菌力の変化表1はEDTAおよび種々保存剤のMICを示す．また，図1にはEDTAと種々保存剤併用処理時における抗菌力の変化を示す．EDTAのMICは700mg/mLであり，今回使用した保存剤のMICはBAC＞CHG＞Mp＞SC＞PPの順であった．これら保存剤にEDTAを添加したところ，MP，PP，SCおよびCHGにおいて抗菌力の低下がみられた．一方，BACではEDTAの添加により抗菌力の増大が認められ，MICより低い濃度においても十分な抗菌力を示した．表1眼科用添加物のE.coliに対する最小阻害濃度眼科用添加物MIC（μg/mL）BAC（ベンザルコニウム塩化物）16MP（パラオキシ安息香酸メチル）6PP（パラオキシ安息香酸プロピル）1.25SC（亜塩素酸ナトリウム）5CHG（クロルヘキシジングルコン酸塩）8EDTA（エチレンジアミン四酢酸）700（98）A：BACB：MB：MPC：PP1001008080保存効力なし●保存効力ありPP濃度（μg/mL）保存効力なし●保存効力あり保存効力なし●保存効力あり細胞死亡率（％）細胞死亡率（％）SC濃度（μg/mL）BAC濃度（μg/mL）細胞死亡率（％）細胞死亡率（％）CHG濃度（μg/mL）MP濃度（μg/mL）604020604020000010020030040050001002003004005000100200300400500EDTA濃度（μg/mL）EDTA濃度（μg/mL）EDTA濃度（μg/mL）D：SCE：CHG100保存効力なし●保存効力あり保存効力なし●保存効力あり図1EDTAが種々保存剤の抗菌力に与え001002003004005000100200300400500る影響EDTA濃度（μg/mL）EDTA濃度（μg/mL）破線は各保存剤自身（単独）のMICを示す．0A：BACB：MPC：PP8080606040402020MP●MPwithEDTA＊＊00306090120時間（sec）00306090120時間（sec）PP●PPwithEDTAE：CHGD：SC00306090120時間（sec）BAC●BACwithEDTA808080707070細胞死亡率（％）606060505050404040303030202020＊101010SC●SCwithEDTA＊＊CHG●CHGwithEDTA図2EDTA（0.1％）が各種保存剤（0.005208080706050403020＊70＊60504030％）の角膜細胞傷害性に与える影響10細胞死亡率は式（1）を用いて算出した．平0030609012000306090120均値±標準誤差，n＝8．＊p＜0.05vs.コン時間（sec）時間（sec）トロール群（EDTA非添加群）．2.EDTA添加に伴う種々保存剤の角膜細胞傷害性のBAC≒CHG＞SC≫MPの順であった．一方，パラベン類で変化あるPPにおいては処理120秒まで細胞傷害は認められなか図2はEDTAと種々保存剤処理時におけるHCE-T細胞ったが，処理180秒後では細胞傷害がみられ，その細胞死の死亡率を示す．BAC，MP，SCおよびCHGでは処理時間亡率は13.9±2.1（平均値±SE）であった．これら種々保存の増加とともに細胞死亡率の増加が認められ，その傷害性は剤にEDTAを添加したところ，BAC処理群ではその細胞傷（99）あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016859害性に大きな影響はみられなかった．このBAC処理群の結果とは異なり，MP，SCおよびCHG処理群ではEDTAの併用処理により，細胞毒性が有意に低下した．また，PPおよびEDTA併用処理群では，処理0.180秒間において細胞傷害性はみられなかった．III考按EDTAは点眼薬中に多く含まれる安定化剤であり，BAC，MP，PP，SC，CHGは点眼製剤の製造において多用される保存剤である．本研究ではEDTAと各種保存剤（BAC，MP，PP，SC，CHG）の組み合わせが，保存剤の有する抗菌力および角膜上皮細胞毒性（副作用）へ与える影響について明らかにするために検討した．まず，今回用いたEDTAと各種保存剤（BAC，MP，PP，SC，CHG）の抗菌力および角膜上皮細胞傷害性について検討したところ，EDTAの抗菌力はMIC700mg/mLと低かったが，各種保存剤単独では強い抗菌力が確認できた．一方，0.005％における各種保存剤の角膜上皮細胞傷害性は，BAC≒CHG＞SC≫MPの順であり，PPにおいては処理120秒間で細胞傷害性はみられず，毒性は非常に低いものであった．一般に，保存剤の抗菌メカニズムと角膜細胞毒性とは密接にかかわっていることが知られている．今回選択したBACは陽電荷をもつ原子団が菌体表面に吸着することで細胞膜破壊，細胞内の酵素蛋白質の変性，呼吸系の阻害を引き起こす5.7）．また，パラベン類（MPやPP）の抗菌作用発現機構は，膜イオン透過性亢進による膜電位の消失もしくはミトコンドリアの呼吸機能障害によることが先行研究により示唆されており，アルキル側鎖の長さが長い程細胞毒性が低下することが知られている8,9）．これらパラベン類のアルキル側鎖の長さと細胞毒性の関係は，今回示したMP，PPの結果と同様であった（表1および図1）．さらに，SCはアミノ酸のスルフィド（S-H）結合と酵素のジスルフィド（S-S）結合を酸化して細胞の機能を破壊するとともに，細胞膜を直接的に破壊して抗菌活性を示すとされており10），CHGは細胞膜に吸着し，細胞膜傷害と細胞質の漏洩を起こすとともに，酵素蛋白質に吸着して活性阻害を起こすことが知られている11）．一方，本研究では抗菌力の評価に，環境中に存在する菌類の主要な種の一つであるグラム陰性の桿菌E.coliを用いた．グラム陰性菌は細胞膜と外膜の2つの脂質膜に包まれている．この外膜はリポ多糖，リン脂質および数種の蛋白質などからなり，2価陽イオンでそれらの一部が結びつけられているため，陽イオンのキレーターであるEDTAを作用させると，外膜を構成する成分の一部が遊離し，外膜に障害が認められる12,13）．このような膜の傷害によって，外膜により膜内への透過が抑制されていた薬剤が容易に外膜を通過できるよ860あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016うになり，薬効および毒性が高まることが報告されている．したがって，E.coliにEDTAと各種保存剤を併用した際には，薬剤のE.coliに対する膜透過性亢進により抗菌力が高まるが，外膜を持たない角膜上皮細胞に対する細胞傷害性は大きく変化しないものと考えられた．本研究においても，BACとEDTAの組み合わせでは，抗菌力は上昇したが，角膜傷害性においては有意な差はみられなかった．このBACとEDTAの組み合わせの結果とは異なり，パラベン類（MP，PP），SCおよびCHGでは，EDTA併用により抗菌力および角膜傷害性の低下が認められた．EDTA併用処理では薬剤の膜透過性亢進が考えられるが，E.coliに対する抗菌力の低下と角膜上皮細胞における細胞毒性の軽減がともにみられたことから，パラベン類（MP，PP），SCやCHGの薬効（抗菌力）や副作用発現（細胞傷害性）には2価陽イオンがかかわっており，陽イオンのキレーターであるEDTAとの併用はそれらの効力を低下させる可能性が示唆された．以上，点眼薬の処方設計において，添加物EDTAの組み合わせは保存剤の抗菌力，角膜傷害性に影響を及ぼすことを見出した．今後，E.coli以外の菌類に対してどのような影響を与えるかを検討するとともに，パラベン類（MP，PP），SCおよびCHGの保存効果機構と2価陽イオンの関係についても検討を進めていく予定である．本研究結果は，点眼薬処方設計の一つの指標になるものと考える．利益相反：利益相反公表基準に該当なし文献1）瀧沢岳，片岡伸介，小高明人ほか：ホウ酸含有点眼剤組成の抗菌メカニズム．あたらしい眼科27：518-522,20102）長井紀章，村尾卓俊，伊藤吉將ほか：点眼薬含有添加剤であるポリソルベート80及びEDTA点眼が角膜上皮傷害治癒へ与える影響．あたらしい眼科27：1299-1302,20103）NagaiN,YoshiokaC,ManoYetal：Ananoparticleformulationofdisulfiramprolongscornealresidencetimeofthedrugandreducesintraocularpressure.ExpEyeRes132：115-123,20154）NagaiN,ItoY,OkamotoNetal：Ananoparticleformulationreducesthecornealtoxicityofindomethacineyedropsandenhancesitscornealpermeability.Toxicology319：53-6220145）DebbaschC,PisellaPJ,DeSaintJeanMetal：Mitochondrialactivityandglutathioneinjuryinapoptosisinducedbyunpreservedandpreservedbeta-blockersonChangconjunctivalcells.InvestOphthalmolVisSci42：25252533,20016）DeSaintJeanM,BrignoleF,BringuierAF：EffectsofbenzalkoniumchlorideongrowthandsurvivalofChangconjunctivalcells.InvestOphthalmolVisSci40：619-630,（100）19997）DebbaschC,BrignoleF,PisellaPJetal：Quaternaryammoniumsandotherpreservatives’contributioninoxidativestressandapoptosisonChangconjunctivalcells.InvestOphthalmolVisSci42：642-652,20018）BredinJ,Davin-RegliA,PagesJM：PropylparabeninducespotassiumeffluxinEscherichiacoli.JAntimicrobChemother55：1013-1015,20059）NakagawaY,MoldeusP：Mechanismofp-hydroxybenzoateester-inducedmitochondrialdysfunctionandcytotoxicityinisolatedrathepatocytes.BiochemPharmacol55：1907-1914,199810）小林正枝，秋山茂，岩下正人ほか：亜塩素酸ナトリウム製剤の殺菌効力に関する検討．食品衛生学雑誌30：367374,198911）第十六改正日本薬局方解説書廣川書店，C-1563,201112）AsbellMA,EagonRG：Roleofmultivalentcationsintheorganization,structure,andassemblyofthecellwallofPseudomonasaeruginosa.JBacteriol92：380-387,196613）RogersSW,GillelandHEJr,EagonRG：Characterizationofaprotein-lipopolysaccharidecomplexreleasedfromcellwallsofPseudomonasaeruginosabyethylenediaminetetraaceticacid.CanJMicrobiol15：743-748,1969＊＊＊（101）あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016861