あたらしい眼科

《第35回日本眼薬理学会原著》あたらしい眼科33（6）：867.873，2016c培養ヒト結膜上皮細胞における高浸透圧ストレス負荷に対するカテキンの抑制効果木崎順一郎＊1,2宇高結子＊1佐々木晶子＊1辻まゆみ＊1友寄英士＊1,2當重明子＊1,2岩井信市＊1,3小口勝司＊1＊1昭和大学医学部薬理学講座医科薬理学部門＊2昭和大学医学部眼科学講座＊3昭和大学薬学部社会健康薬学講座医薬品評価薬学部門Anti-inflammatoryEffectsofEGCGorEGCG3MeagainstHyperosmotic-inducedInflammationinHumanConjunctivalEpitheliumCellsJunichiroKizaki1,2）,YukoUdaka1）,AkikoSasaki1）,MayumiTsuji1）,EijiTomoyori1,2）,AkikoToju1,2）,ShinichiIwai1,3）andKatsujiOguchi1）1）DepartmentofPharmacology,ShowaUniversitySchoolofMedicine,2）DepartmentofOphthalmology,ShowaUniversitySchoolofMedicine,3）DepartmentofResearchandDevelopmentforInnovativeMedicalNeeds,Health,ShowaUniversitySchoolofPharmacyドライアイは，涙液層の浸透圧上昇と，これに伴う眼表面の炎症がおもな病態と考えられている．近年，茶カテキン，とくに（-）-EpigallocatechinGallate（EGCG）および，（-）-Epigallocatechin3-（3”-O-Methyl）Gallate（EGCG3”Me）の高い生理活性が報告されている．本研究では，培養ヒト結膜上皮細胞株を用い，培養液にスクロースを添加することで高浸透圧ストレス負荷を施し，アポトーシス解析，MAPK（ERK，JNK，p38MAPK）リン酸化能およびIL-6生成量を測定し，さらにEGCG，EGCG3”Meを前処置による抑制効果を検討した．その結果，高浸透圧ストレス負荷により，アポトーシス細胞の割合，JNK，p38MAPKリン酸化能およびIL-6生成量が有意に増加した．これに対し，EGCG3”MeはIL-6生成量とp38MAPK活性の上昇を有意に抑制したが，EGCGではIL-6生成の抑制は認めなかった．以上より高浸透圧ストレス誘発性炎症に対し，EGCG3”Meはp38MAPKリン酸化を抑制することで，IL-6生成を抑え，抗炎症作用を示すものと考えた．Osmoticpressureoftearsindryeyepatientsisusuallyhigherthaninnormalpersons.Itisassociatedwithincreasedosmolarityofthetearfilmandinflammationoftheocularsurface.Inaddition,teacatechinssuchas（-）-EpigallocatechinGallate（EGCG）and（-）-Epigallocatechin3-（3”-O-Methyl）Gallate（EGCG3Me）havemultiplebiologicalactions,includinganti-allergy,anti-inflammatoryandanti-canceractivity.Inthisstudy,weexaminedwhetherEGCGandEGCG3Meattenuatethehyperosmosis-inducedinflammationinhumanconjunctivalepitheliumcells（HCEcells）.HCEcellswereexposedtohyperosmoticmedium（423mOsm,i.e.,123mMsucroseinmedium）,andthenexaminedastotherateofapoptosis,IL-6levelsandactivityofMAPKs（ERK,JNKandp38MAPK）.EGCG3MesignificantlysuppressedtheincreaseinIL-6levelandelevationofphosphorylatedp38MAPK.EGCG3MeinductionofinflammationmorepotentthanEGCGwasalsoindicated.TheseresultssuggestthatEGCG3Memightbeuseableasatherapeuticapproachindryeye.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）33（6）：867.873,2016〕Keywords：結膜，ドライアイ，炎症，高浸透圧，カテキン．conjunctiva,dryeye,inflammatory,hyperosmolarity,catechin.〔別刷請求先〕木崎順一郎：〒142-8555東京都品川区旗の台1丁目5-8昭和大学医学部薬理学講座医科薬理学部門Reprintrequests：JunichiroKizaki,M.D.,DepartmentofPharmacology,ShowaUniversitySchoolofMedicine,1-5-8Hatanodai,Shinagawa,Tokyo142-8555,JAPAN0910-1810/16/\100/頁/JCOPY（107）867はじめに近年，生活環境の変化（高齢化，コンタクトレンズ装用者の増加，エアコン普及，パソコン，スマートフォン，ゲームなどのデジタル機器（visualdisplayterminals：VDT）の長時間使用などにより，ドライアイの有病率が増えている．とくにオフィスワーカーの約6割がドライアイもしくはその疑いがあり，QOLの低下や作業効率の低下などにつながるという報告もあり1），いわば現代病の一つといっても過言ではない．ドライアイの発症のメカニズムとして，眼表面の浸透圧の上昇が指摘されている．涙液の産生低下，あるいは蒸発亢進による涙液量の減少により眼表面の浸透圧が上昇すると炎症反応が起こり，結膜傷害，ゴブレット細胞の減少を引き起こし，涙液層の不安定化などにつながる．その結果，さらに涙液が減少するなどの悪循環を起こすこと2）が示されている．米国では，とくにこの考え方が強く，ドライアイの診断において眼表面の浸透圧上昇を重視しており，治療の中心は抗炎症薬投与になっている3）．近年，日本緑茶に豊富に含まれるポリフェノール（greenteapolyphenol）のうち，カテキン類には，抗酸化作用，抗腫瘍作用，抗転移作用，血圧抑制作用，動脈硬化抑制作用，脂質代謝改善作用，抗菌作用，抗ウイルス作用，抗う蝕作用，抗アレルギー作用といった多様な生理作用を有することが報告されている．とくに，（-）-Epigallocatechingallate（EGCG）は，茶特有のポリフェノール成分で4），上記作用が強力に出ることが多数報告されている．いわゆる緑茶の代表的な品種「やぶきた」には，カテキン類が10.20％の割合で含まれており，その約半分をこのEGCGが占めるとされている．一方，EGCGの3つの水酸基のうちortho位をメチル化した（-）-Epigallocatechin3-（3”-O-Methyl）gallate（EGCG3”Me）の強い生理活性が最近注目されている．これは「べにふうき」「べにふじ」「べにほまれ」などの品種の茶葉に多く含まれ，「やぶきた」には含まれていない．EGCG3”Meは高い抗酸化活性を持ち，とくに抗アレルギー作用はEGCGの約2.5倍との報告がある．そこで今回，筆者らは，培養ヒト結膜上皮（humanconjunctivalepithelium：HCE）細胞を用いて，眼表面のドライアイ病態を想定した高浸透圧ストレス負荷状態における炎症誘発経路を明らかにするとともに，これに対するEGCGとEGCG3”Meの抗炎症作用およびその有用性を比較検討した．なお，今回使用した細胞株は，ヒト子宮頸癌由来上皮細胞（HeLa細胞）の混入が疑われているが，株化したヒト結膜上皮細胞の代用がないため，HCE細胞とHeLa細胞の比較検討を行った．I材料および方法1.細胞培養ヒト眼球由来結膜上皮細胞株（Clone-1-5c-4：HCE細胞）をDSファーマメディカル（大阪）より購入，細胞は2mMGlutamine＋10％FetalBovineSerum（FBS）含有Medium199（Sigma-AldrichCo.,MO,USA）培地中，5％CO2，37℃にて培養した．ヒト子宮頸癌由来上皮細胞（ATCCCCL2.2：HeLa細胞）は，FBS含有E-MEMmedium培地中，5％CO2，37℃にて培養した．2.高浸透圧ストレスFBS非含有medium（289mOsm/L）に123mMのスクロース（和光純薬工業，大阪）を添加し，Hyperosmoticmedium（423mOsm/L）を調整し5），培養液をこれに置換することで，高浸透圧ストレス負荷（Hyper）群とした．対照として，スクロース非添加群をコントロール（Cont）群とした．3.使用薬物カテキン類はそれぞれEGCGを和光純薬工業から，EGCG3”Meを長良サイエンス（岐阜）から購入した．Mitogen-activatedproteinkinaseinhibitor（MAPKi）は，p38MAPKinhibitor（p38i）としてSB203585，extracellularsignal-regulatedkinase（ERK）inhibitor（ERKi）としてPD98059をSigma-AldrichCo.（MO,USA）から購入，c-JunN-terminalkinase（JNK）inhibitor（JNKi）としてSP600125を和光純薬工業（東京）から購入した．4.実験プロトコール細胞を測定項目に応じて適切な濃度に調整して播種し，24時間培養後，Cont群には高浸透圧ストレス負荷の1時間前に，p38i1μM，JNKi10μM，ERKi10μM，EGCG5,10,20μM，およびEGCG3”Me5,10,20μMを添加した．その1時間後，Hyper群は培養液を高浸透圧ストレスmediumに置換し，ただちに，各MAPKiおよびカテキン類をCont群と同じ濃度で添加した．両群ともその状態で培養を続け，各時点のサンプルを実験に供した．5.高浸透圧負荷後のアポトーシス細胞の経時的解析HCE細胞を3×105cells/mLに調整し6穴プレートに播種し，先に示した条件で24時間培養後，高浸透圧負荷を行った．その後1,3,6,15,24時間時点で抽出し，MuseRCellAnalyzer（MerckMillipore,Germany）にて，MuseTMAnnexinVandDeadCellKit（EMDMilliporeCorporation,USA）を用いて，アポトーシス細胞の表面に提示されたホスファチジルセリン（PS）とアネキシンV-PEが結合する割合から，アポトーシス細胞の割合を検出した．6.高浸透圧負荷後のIL.6生成量の経時的変化測定HCE細胞を3×105cells/mLに調整し6穴プレートに播種868あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016（108）し，24時間培養後，高浸透圧負荷を行った．その後1,3,6,15,24時間時点の上清をサンプルとし，Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay（ELISA法）にてHRP標識抗リン酸化IL-6抗体と発色試薬を用いてIL-6を検出し，HumansIL-6InstantELISA（eBioscience,AffymetrixInc,CA,USA）を用いて，マイクロプレートリーダーにて波長450nmでの吸光度を測定した．7.高浸透圧負荷1時間後のMAPK（ERK，JNK，p38MAPK）リン酸化能測定HCE細胞，HeLa細胞を1×105cells/mLに調整し，96穴プレートに播種し，24時間培養した．その後，各MAPKiおよび，HCE細胞については5,10,20μMEGCG，EGCG3”Meを，HeLa細胞については10μMEGCG,EGCG3”Meを添加し，その1時間後，高浸透圧ストレス負荷を行い，1時間後のMAPKリン酸化能を測定した．細胞は，HRP標識抗リン酸化各MAPK抗体と発色基質を用いてリン酸化各MAPKをそれぞれ検出し〔RayBioRCell-Basedp38（Thr180/Tyr182）ELISAkit，RayBioRCell-basedJNK（Thr183/Tyr185）ELISAkit，RayBioRCell-BasedERK（Thr180/Tyr182）ELISAkit（以上，RayBiotech,Inc.,GA,USA）〕を用いてマイクロプレートリーダーにて波長450nmでの吸光度を測定した．8.EGCG,EGCG3”Me添加による高浸透圧負荷24時間後のIL.6生成量の測定HCE細胞，HeLa細胞を3×105cells/mLに調整し6穴プレートに播種し，24時間培養後，EGCG（5,10,20μM），EGCG3”Me（5,10,20μM）およびp38i（1μM），JNKi（10μM），ERKi（10μM）を添加し，その1時間後，高浸透圧ストレス負荷を行い，24時間後のIL-6生成量をHumansIL-6InstantELISA（eBioscience,Inc.,CA,USA）を用いて，マイクロプレートリーダーにて波長450nmでの吸光度を測定した．9.67kDaLaminineReceptor（67LR）の免疫細胞染色HCE細胞を3×105cells/mLに調整し，ChamberSlideTMで24時間培養後，EGCG（10μM）,EGCG3”Me（10μM）を添加し，その1時間後に浸透圧負荷を行った．負荷後1時間で細胞をホルマリン固定し，ENVISION染色システムを用い，一次抗体〔Anti-67kDaLamininReceptor抗体MLuC5（ab3099）；Abcam,UK〕，を2時間反応させ，その後，二次抗体とパーオキシダーゼが結合しているデキストランポリマー試薬を反応させて，核や細胞質の染色を行った．10.統計処理実験結果は平均±標準偏差（n＝3.12）で示した．HCE細胞，HeLa細胞におけるHyper群でのパラメーターはt検定を用いてCont群と比較検討した．また，HCE細胞における高浸透圧ストレス負荷後のMAPKリン酸化能，IL-6生成量（109）に対するカテキン類の抑制効果についてはANOVA-Bonferroni多重比較検定を用いてHyper群と比較検討し，p＜0.05以下を有意とした．II結果1.高浸透圧ストレス負荷によるアポトーシス細胞の経時的変化図1AにHCE細胞に高浸透圧ストレス負荷を施した後の1,3,5,15,24時間後のアポトーシス細胞の経時的変化を，AnnexinVを用いてアポトーシス細胞の割合（％）で示した．Hyper群は高浸透圧ストレス負荷後，アポトーシス細胞の割合が経時的に上昇し，6時間以降，Cont群と比べ有意な増加を認めた（n＝6,p＜0.01）．図1BにHCE細胞とHeLa細胞の高浸透圧ストレス負荷24時間後のアポトーシス細胞の割合（％）を示した．HeLa細胞においても，高浸透圧ストレス負荷によりアポトーシス細胞の割合は有意に上昇した（n＝3,p＜0.01）．2.高浸透圧ストレス負荷によるIL.6生成量の経時的変化図2AにHCE細胞に高浸透圧ストレス負荷1,3,6,15,24時間後のIL-6生成量の経時的変化を示した．Hyper群は高浸透圧ストレス負荷により，IL-6生成量が経時的に上昇し，15時間以降，Cont群と比べ有意に上昇した（n＝6,p＜0.01）．図2BにHCE細胞とHeLa細胞の高浸透圧ストレス負荷24時間後のIL-6生成量を示した．HeLa細胞もHyper群はCont群に比べ有意な増加を認めたが，その生成量はHCE細胞に比べ明らかに低値を示した．3.HCE細胞における高浸透圧ストレス負荷によるERK，JNKおよびp38MAPKリン酸化能とカテキン類の抑制効果図3にHCE細胞における高浸透圧ストレス負荷1時間後のERK（A），JNK（B），p38MAPK（C）のリン酸化能を示した．高浸透圧ストレス負荷によるERKリン酸化能の変化は認められなかった（n＝6）．高浸透圧ストレス負荷後1時間での，JNKおよびp38MAPKのリン酸化能はCont群と比較し有意に上昇した．JNKリン酸化能の上昇に対し，EGCGはいずれの濃度においても有意な抑制を示した（n＝12,p＜0.01）．一方，p38MAPKリン酸化能の上昇に対しては，EGCG3”Meで濃度依存的に有意な抑制を示した（n＝6,p＜0.01,0.05）が，EGCGは5μMで有意な抑制効果を示した（n＝6,p＜0.05）が，10,20μMでは変化は認められなかった．一方，HeLa細胞においては，高浸透圧ストレス負荷による，ERK，JNK，p38MAPKのリン酸化能に有意差は認めなかった．（ERK：Cont群1.525±0.058,Hyper群1.590±0.055；n＝6.JNK：Cont群1.472±0.075,Hyper群1.556±あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016869ABA2（％）1.8（％）#$1001001.690＊＊＊＊901.4Phosphop38/totalp38ratioPhosphoJNK/totalJNKratioPhosphoERK/totalERKratio＊＊80RateofApoptoticcells1.210.80.60.40.270605040303020200（μM）1010001361524Incubationtime（hours）HCEcellsHeLacellsBContHyper21.81.61.4図1高浸透圧ストレス負荷後のアポトーシス細胞の割合HCE細胞またはHeLa細胞における高浸透圧ストレス負荷後のアポトーシス細胞の割合を，MuseTMCellAnalyzerにてAnnexinVを用いて測定した．A：HCE細胞に対する高浸透圧ストレス負荷後1,3,6,15,24時間後のアポトーシス細胞の経時的変化．平均±標準偏差，n＝6，＊p＜0.05，＊＊p＜0.01vsCont（t検定）．B：高浸透圧ストレス負荷24時間後のHCE細胞とHeLa細胞におけるアポトーシス細胞の比較．平均±標準偏差，n＝3，#p＜0.01，＄p＜0.01vsCont（t検定）．AB＊＊1.2＊＊＊＊＊＊1＊＊0.80.60.40.20（μM）（pg/mL）（pg/mL）C24504501.81.61.41.2＊＊1＊＊0.8＊＊＊＊0.60.40.2400（24h）（24h）（24h）（24h）400$#350＊＊＊＊350300300IL-6levels2502502002001501501001005050000（1361524μM）Incubationtime（hours）HyperContHCEcellsHeLacells図2高浸透圧ストレス負荷後のIL.6生成量HCE細胞またはHeLa細胞における高浸透圧ストレス負荷後のIL-6生成量を，ELISA法を用いて測定した．A：HCE細胞に対する高浸透圧ストレス負荷後のIL-6生成量の1,3,6,15,24時間後の経時的変化．平均±標準偏差，n＝6．＊p＜0.05，＊＊p＜0.01vsCont（t検定）．B：高浸透圧ストレス負荷後24時間のHCE細胞とHeLa細胞におけるIL-6生成量の比較．平均±標準偏差，n＝3，#p＜0.01，＄p＜0.01vsCont（t検定）870あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016図3高浸透圧負荷1時間後のMAPK（ERK，JNK，p38MAPK）リン酸化能とカテキン類による抑制効果HCE細胞にMAPKi，EGCG（5,10,20μM），EGCG3Me（5,10,20μM）を添加し，1時間後に高浸透圧ストレスを負荷した．その後1時間インキュベートし，各MAPKのリン酸化能をELISA法にて測定した．結果は，全MAPKに対するリン酸化されたMAPKの割合で示した．A：ERKリン酸化能，B：JNKリン酸化能，C：p38MAPKリン酸化能．平均±標準偏差，n＝6.12，＊p＜0.05，＊＊p＜0.01vsHyper（ANOVA-Bonferroni多重比較検定）．（110）0350400450（pg/mL）＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊（ContHyperp38i（1）（10）EGCG（5）（10）（20）（5）（10）（20）0350400450（pg/mL）＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊（ContHyperp38i（1）（10）EGCG（5）（10）（20）（5）（10）（20）IL-6levels300250200150図4高浸透圧負荷後24時間後のIL.6生成量に対するカテキン類の抑制効果100HCE細胞にJNKi，p38MAPKi，EGCG（5,10,20μM），50EGCG3Me（5,10,20μM）を添加し，1時間後に高浸透圧ストレスを負荷した．その後24時間インキュベートし，培養液の上清を用い，ELISA法にてIL-6生成量を測定した．平均±標準偏差，n＝6．＊p＜0.05，＊＊p＜0.01vsHyper（ANOVA-Bonferroni多重比較検定）．μM）ContHyperEGCGEGCG3”Me図5高浸透圧ストレス負荷後1時間の67LRに対する免疫細胞染色HCE細胞に，EGCG（10μM）またはEGCG3Me（10μM）を添加し，1時間後に高浸透圧ストレスを負荷した．その後1時間インキュベートし，細胞をホルマリン固定後，ENVISION染色システムを用い，一次抗体として抗67LR抗体を2時間反応させた後，二次抗体とペルオキシダーゼが結合しているデキストランポリマー試薬を1時間反応させて，核や細胞質の染色を行った（×200）．（111）あたらしい眼科Vol.33，No.6，20168710.080；n＝6.p38MAPK：Cont群0.529±0.060,Hyper群0.529±0.014；n＝6）．4.HCE細胞における高浸透圧ストレス負荷24時間後のIL.6生成に対するカテキン類の抑制効果図4にHCE細胞における高浸透圧ストレス負荷24時間後のIL-6生成量に対するEGCG,EGCG3”Meの抑制効果を示した．高浸透圧ストレス負荷後24時間で，Cont群と比べIL-6生成量は有意に上昇した（n＝12,p＜0.01）．これに対しEGCG3”MeでIL-6生成量は濃度依存的に抑制され，20μMで有意な抑制効果を認めた（n＝6,p＜0.01）．一方，EGCGでは抑制効果は認められなかった．5.高浸透圧ストレス負荷による67LR発現誘導の免疫細胞染色図5にEGCGまたはEGCG3”Meを添加したHCE細胞における高浸透圧ストレス負荷1時間後の67LRの免疫細胞染色を示す．67LRは，カテキンの受容体として見出されている膜蛋白で6），EGCGで67LRの明らかな発現誘導が確認された．一方，EGCG3”Meではcontrolと比べ変化は認められなかった．III考按ドライアイ患者においては，涙液浸透圧とドライアイの重症度が相関するといわれている．米国でのドライアイ診断基準にあたるDryEyeWorkShop（DEWS）Reportによると，涙液浸透圧の正常カットオフ値は316mOsm/Lとされている2,7）．ドライアイ患者における涙液浸透圧は平均326.9±22.1mOsm/Lであり，健常人の平均302±9.7mOsm/Lに比べかなり高く7），涙液中に炎症性サイトカインが増加するという報告がある8,9）．角膜細胞を用いて塩化ナトリウムまたはスクロースを添加した培養液（350.600mOsm/L）を用いて高浸透圧ストレス負荷を施した報告が散見され，とくに450mOsm/L以上の高浸透圧負荷により，炎症性サイトカインの著明な上昇を認めたなどの報告10,11）がある．そこで今回，HCE細胞に高浸透ストレス負荷（423mOsm/L）を行った結果，アポトーシスの割合と，炎症性サイトカイン（IL-6）の生成量の経時的増加が確認され，炎症が惹起されていることが確認された．今回，データは示していないが，TNF-a，IL-1bも同様に測定した結果，TNF-a生成量は有意差はなく，IL-1bは検出限界以下であった．細胞外からの種々刺激により活性化され，核へのシグナル伝達を媒介するMAPKリン酸化能を測定した結果，高浸透圧ストレス負荷1時間でJNKとp38MAPKリン酸化能の有意な上昇が確認されたが，ERKでは変化が認められなかった．MAPKのなかでもとくに，JNK,p38MAPKは，UV，ROS（reactiveoxygenspecies），高浸透圧，熱ショックなどの物理化学的ストレスなどによって活性化されるストレス応答キナーゼで，アポト872あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016ーシス誘導などに深く関与している．今回の高浸透圧ストレス負荷により，HCE細胞ではJNK，p38MAPKの活性化およびIL-6生成量の明らかな増加が確認されたが，HeLa細胞においてはいずれも認めなかった．このことから，このストレスはHCE細胞に由来するものと判断し，カテキン類による抑制効果を検討した．近年，カテキン類を代表とする茶葉成分に関する研究報告が散見される．緑茶に含まれるEGCGは茶特有のポリフェノール成分で，他の植物には見出されていない4）．最近，新規カテキンのEGCG3”Meが見出された．日本緑茶の「べにふうき」「べにふじ」といった品種に多く含まれており，いわゆる代表的な品種である「やぶきた」にはまったく含まれていない．先にも述べたが，緑茶カテキンには多彩な生理機能が解明されており，なかでも，抗腫瘍作用や抗アレルギー作用は，EGCGが多種の細胞の細胞膜表面に局在している67kDalamininereceptor（67LR）に結合することで活性を示すことが報告されている6）．EGCGは67LRを介した癌細胞における細胞増殖抑制作用のほか，ヒト好塩基球細胞株におけるヒスタミン放出抑制作用やIgE受容体発現低下作用などが報告されている12）．今回のHCE細胞に対する高浸透圧ストレス負荷では，JNK，p38MAPKを介してIL-6を生成することで，炎症が惹起されていることが示唆された．この炎症に対する，EGCGまたはEGCG3”Meの抑制効果について検討した結果，JNKリン酸化能はEGCGで，p38MAPKリン酸化能はEGCG3”Meで抑制されることが示唆された．また，IL-6生成量はEGCG3”Meで濃度依存的に抑制されたのに対し，EGCGでは変化がないか高濃度では逆に増加する結果となった．これまでに，腫瘍細胞に対するEGCGの抗腫瘍効果なども報告されており12,13），高濃度のEGCGによる細胞障害作用が現れたものと考えられる．EGCGおよびEGCG3”Meを添加し，高浸透圧ストレス負荷1時間後，67LRの免疫細胞化学染色を行った結果，EGCG3”MeよりもEGCGで強い発現誘導が確認された．このことから，EGCGはおもに67LRへの結合を介してシグナル伝達されているのに対し，EGCG3”Meには67LRとは別の経路が関与していることが示唆された．すなわち，EGCG3”MeはEGCGに比べ脂溶性が高いことから，膜を直接透過する可能性が考えられる．以上のことから，それぞれ異なった細胞内シグナル伝達経路を介して抗炎症作用を示し，その作用はEGCGよりもEGCG3”Meのほうがより効果的である可能性が示唆された．Leeら14）は，0.1％EGCG溶液の点眼により角膜上皮障害が改善したと報告している．さらに，EGCGやEGCG3”Meは飲用後，血中への移行も確認されている．すなわち，毛細血管が豊富である結膜に移行し，眼表面の抗炎症作用を示す（112）可能性は高い．市販のペットボトル入りべにふうき緑茶を，約200ml飲用したときの摂取量とAUC（areaunderthebloodconcentration-timecurve）の割合で比較すると，移行の割合はEGCG3”MeのほうがEGCGに比べて6.5倍高いことが示されている15）．また，アレルギー性鼻炎患者を対象としたヒト介入試験において，EGCG3”Me摂取により眼の痒みや流涙を含む花粉症症状の明らかな軽減作用がみられたと報告されており，その際のEGCG3”Me摂取量は34mg/dayとされている16）．これは市販のペットボトル1.5本分（約750ml）の飲用に相当する．涙液浸透圧と血漿浸透圧に強い相関があり，飲水自体に涙液浸透圧を下げるとの報告17,18）があることから，日常的に茶を飲用する習慣がある日本人にはドライアイによる高浸透圧ストレス誘発炎症に対しても，抗炎症効果が期待できるかもしれない．以上のことから，べにふうき緑茶飲用がドライアイ治療に有用である可能性が示唆された．利益相反：利益相反公表基準に該当なし文献1）UchinoM,YokoiN,UchinoYetal：Prevalenceofdryeyediseaseanditsriskfactorsinvisualdisplayterminalusers：theOsakastudy.AmJOphthalmol156：759-766,20132）MichaelAL,GaryNF：Thedefinitionandclassificationofdryeyedisease.OculSurf5：75-92,20073）SternME,PflugfelderSC：Inflammationindryeye.OculSurf2：124-130,20044）山本（前田）万里：抗アレルギー効果のある茶葉成分．日本補完代替医療学雑誌3：53-60,20065）CavetME,HarringtonKL,VollmerTRetal：Antiinflammatoryandanti-oxidativeeffectsofthegreenteapolyphenolepigallocatechingallateinhumancornealepithelialcells.MolVis17：533-542,20116）TachibanaH,KogaK,FujimuraYetal：AreceptorforgreenteapolyphenolEGCG.NatStructMolBiol11：380381,20047）TomlinsonA,KhanalS,DiaperCetal：Tearfilmosmolarity-determinationofareferentfordryeyediagnosis.InvestOphthalmolVisSci47：4309-4315,20068）NaKS,MokJW,KimJYetal：Correlationsbetweentearcytokines,chemokines,andsolublereceptorsandclinicalseverityofdryeyedisease.InvestOphthalmolVisSci53：5443-5450,20129）BoehmN,RiechardtAI,WiegandMetal：Proinflammatorycytokineprofilingoftearsfromdryeyepatientsbymeansofantibodymicroarrays.InvestOphthalmolVisSci52：7725-7730,201110）LuoL,LiDQ,CorralesRMetal：Hyperosmolarsalineisaproinflammatorystressonthemouseocularsurface.EyeContactLens31：186-193,200511）LiDQ,ChenZ,SongXJetal：StimulationofmatrixmetalloproteinasesbyhyperosmolarityviaaJNKpathwayinhumancornealepithelialcells.InvestOphthalmolVisSci45：4302-4311,200412）立花宏文：緑茶カテキンの受容体とシグナリング．生化学81：290-294,200913）SuzukiY,MiyoshiN,IsemuraM：Health-promotingeffectsofgreentea.ProcJpnAcadSerBPhysBiolSci88：88-101,201214）LeeHS,ChauhanSK,OkanoboAetal：Therapeuticefficacyoftopicalepigallocatechingallate（EGCG）inmurinedryeye.Cornea30：1465-1472,201115）Maeda-YamamotoM,EmaK,ShibuichiI：Invitroandinvivoanti-allergiceffectsof‘benifuuki’greenteacontainingO-methylatedcatechinandgingerextractenhancement.Cytotechnology55：135-142,200716）安江正明，大竹康之，永井寛ほか：「べにふうき」緑茶の抗アレルギー作用並びに安全性評価：軽症から中等症の通年性アレルギー性鼻炎患者，並びに健常者を対象として．日本食品新素材研究会誌8：65-80,200517）WalshNP,FortesMB,Raymond-BarkerPetal：Iswhole-bodyhydrationanimportantconsiderationindryeye?InvestOphthalmolVisSci53：6622-6627,201218）FortesMB,DimentBC,DiFeliceUetal：Tearfluidosmolarityasapotentialmarkerofhydrationstatus.MedSciSportsExerc43：1590-1597,2011＊＊＊（113）あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016873

《第35回日本眼薬理学会原著》あたらしい眼科33（6）：863.866，2016c表面麻酔薬オキシブプロカイン塩酸塩点眼液の角膜傷害性評価長井紀章＊1真野裕＊1辰巳賀陽子＊1川﨑真緒＊1伊藤吉將＊1岡本紀夫＊2下村嘉一＊2＊1近畿大学薬学部製剤学研究室＊2近畿大学医学部眼科学教室InVitroandVivoEvaluationofCornealDamageCausedbyCommerciallyAvailableOxybuprocaineEyedrops,usingHumanandRatCornealEpithelialCellsNoriakiNagai1）,YuMano1）,KayokoTatsumi1）,MaoKawasaki1）,YoshimasaIto1）,NorioOkamoto2）YoshikazuShimomura2）and1）FacultyofPharmacy,KinkiUniversity,2）DepartmentofOphthalmology,KinkiUniversitySchoolofMedicine本研究では，表面麻酔薬オキシブプロカイン塩酸塩点眼液の角膜傷害性について評価を行った．実験にはベノキシールR点眼液0.4％（先発品）とオキシブプロカイン塩酸塩点眼液0.4％「ニットー」（ジェネリック医薬品，以下GE）を用いた．角膜傷害性は，ヒト角膜上皮細胞と1次速度式から算出した急性，慢性毒性にて評価した．また，ラット角膜上皮.離モデルを用い，オキシブプロカイン塩酸塩点眼液点眼が角膜治癒へ与える影響についても検討した．GEの急性毒性は，先発品と比較し低値であった．一方，慢性毒性は，先発品とGE間で差は認められず，ラット角膜上皮.離モデルを用いた系においても，GE点眼群の角膜傷害治癒速度は先発品のそれと同程度であった．以上，市販オキシブプロカイン塩酸塩点眼液の角膜傷害性を明らかにした．本研究結果は，眼に優しい表面麻酔薬開発への一つの指標になるものと考える．Inthisstudy,weinvestigatedcornealcelldamagecausedbycommerciallyavailableoxybuprocaineeyedrops,suchasBenoxilRophthalmicsolution0.4％（originaldrug）andoxybuprocainehydrochlorideophthalmicsolution0.4％「NITTO」（genericdrug,GE）.Acuteandchronictoxicitywerecalculatedusingculturedcornealepitheliumcells（HCE-T）andfirst-orderrateequation；theeffectoftheeyedropsoncornealwoundhealingwasdemonstratedusingratdebridedcornealepithelium.AlthoughtheacutetoxicityofHCE-TcellstreatedwithGEwassignificantlylowerthanwiththeoriginaldrug,thechronictoxicitydidnotdifferbetweentheoriginaldrugandGE.Inaddition,cornealwoundhealinginratsinstilledwithGEwasalsosimilartothatoftheoriginaldrug.Thesefindingsprovidesignificantinformationforuseindesigninglocalanaestheticeyedropsfreeofcelldamage.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）33（6）：863.866,2016〕Keywords：オキシブプロカイン塩酸塩，ジェネリック医薬品，角膜傷害，点眼薬，表面麻酔薬．oxybuprocainehydrochloride,genericdrugs,cornealdamage,eyedrops,localanaestheticeyedrops.はじめにオキシブプロカイン塩酸塩点眼液は，眼科領域における検査や手術時に用いられる優れた表面麻酔薬である．しかし，表面麻酔薬の濫用により重篤な角膜傷害を起こした症例が報告されており，鎮痛などを目的とした頻回投与は副作用発現防止のため，注意喚起されている．これらオキシブプロカイン塩酸塩点眼液による角膜傷害には，使用時の涙液分泌の低下と，主薬であるオキシブプロカイン塩酸塩や保存剤（ベンザルコニウム塩化物，BAC）による細胞毒性が知られており，臨床での使用は制限されている．一方，2013年6月にオキシブプロカイン塩酸塩のジェネリック医薬品としてオキシブプロカイン塩酸塩点眼液0.4％「ニットー」（日東メ〔別刷請求先〕伊藤吉將：〒577-8502東大阪市小若江3-4-1近畿大学薬学部製剤学研究室Reprintrequests：YoshimasaIto,Ph.D.,FacultyofPharmacy,KinkiUniversity,3-4-1Kowakae,Higashi-Osaka,Osaka577-8502,JAPAN0910-1810/16/\100/頁/JCOPY（103）863ディック）が販売された．本製剤は先発品と比較し，保存剤であるBAC濃度の減少および増粘剤の追加がなされているが，薬効は同程度と報告されており1），製剤工夫による副作用発現の低下や用途拡大が期待できる．点眼薬の角膜傷害性を検討するうえで，評価系の選択はきわめて重要である．角膜傷害は，点眼薬中に含まれる主薬，添加剤，保存剤だけでなく，角膜知覚，涙液動態および結膜といったオキュラーサーフェス（眼表面）の状態が関与することが知られており，臨床および基礎両面からの観察が重要であると考えられている．筆者らはこれまで，不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T）および1次速度式を用いた細胞傷害性解析にて，急性および慢性毒性を算出する方法（invitro角膜上皮細胞傷害性評価）が点眼薬の角膜傷害性強度を明らかとするうえで有用であることを報告してきた2,3）．また，角膜上皮.離ラットを用いることで，invivo系における薬物角膜傷害強度が評価可能であることを明らかとしてきた4）．そこで今回，これらinvitro，invivo角膜傷害性評価法を用いることで，現在臨床現場で使用されているオキシブプロカイン塩酸塩点眼液先発品およびジェネリック医薬品の角膜傷害性評価を行った．I対象および方法1.使用細胞培養細胞は不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T，RCBNo.1384）を用い，1,000IU/mLペニシリン（GIBCO社製），100mg/mLストレプトマイシン（GIBCO社製）および5％ウシ胎児血清（FBS，GIBCO社製）を含むDMEM/F12培地（GIBCO社製）にて培養した．2.使用薬物眼科用表面麻酔薬は臨床現場にて多用されるオキブプロカイン塩酸塩点眼液先発品（ベノキシールR点眼液0.4％，参天製薬）およびジェネリック医薬品（オキシブプロカイン塩酸塩点眼液0.4％「ニットー」，日東メディック）を用いた．表1に両製剤の組成を示す．3.角膜上皮細胞傷害性の評価筆者らが確立し報告してきたinvitro角膜上皮細胞傷害性評価法に従い行った2,3）．HCE-T細胞を96wellプレートに100mL（1×104個）ずつ播種し，24時間培養（37℃，5％CO2条件下）したものを実験に用いた．実験操作は以下のようにして行った．HCE-T細胞を10.120秒薬剤にて処理後，PBSにて2回洗浄し，各wellにナカライ社製CellCountReagentSFを含有する培地120mLを加え，1時間処理（37℃，5％CO2）後，マイクロプレートリーダー（BIO-RAD社製）にて450nmの吸光度（Abs）を測定した．本研究では，薬剤処理後の細胞死亡率（％）を次式（1）により算出した．細胞死亡率（％）＝（Abs未処理.Abs薬剤処理）/Abs未処理×100（1）また，薬剤処理が細胞傷害へ与える影響をより詳細に検討するために，次式（2）を用いて解析を行った．Dt＝D∞（1.e.kDt）（2）kDは細胞傷害速度定数（min.1），tは点眼薬処理後の時間（0.2分），D∞およびDtは薬剤処理∞およびt分後の細胞死亡率を示す．本研究ではkD，D∞をそれぞれ急性毒性および慢性毒性として表すパラメーターとした．また，先発品およびジェネリック医薬品に含まれる添加物中の急性，慢性毒性の評価には，眼科用剤の最大許容濃度を使用した．4.ラット角膜上皮.離モデルを用いた角膜傷害治癒解析イソフルラン麻酔下，生検トレパンで円形にラット角膜を形取り，ブレードで角膜上皮を.離した（.離面積10.1±0.6,mm2；平均値±標準誤差）．実験時には点眼液を1日3回（9：00，15：00，21：00）1回30μL，実験終了まで点眼した．角膜上皮欠損部分の推移は，角膜.離0，6，24時間後に1％フルオレセイン含有0.4％ベノキシール点眼液にて染色し，トプコン社製眼底カメラ装置TRC-50Xで撮影した画像をImageJにて解析することで評価した．角膜傷害治癒率（％）は，次式（3）にて算出した4）．角膜傷害治癒率（％）＝（面積.離直後.面積.離6,24時間後）/面積.離直後×100（3）5.統計解析得られたデータは平均値±標準誤差として表した．各々の実験値はStudentのt-testにより解析した．また，本研究ではp値が0.05以下を有意差有りとした．表1オキシブプロカイン塩酸塩点眼液先発品およびジェネリック医薬品の組成先発品塩化ナトリウムエデト酸ナトリウム水和物ベンザルコニウム塩化物（0.004％）ポリビニルアルコールpH調整剤（）内の数値は濃度を示す．ジェネリック医薬品塩化ナトリウムエデト酸ナトリウム水和物ベンザルコニウム塩化物（0.002％）ヒプロメロースpH調整剤864あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016（104）A0時間6時間24時間先発品020304050600.0細胞死亡率（％）10先発品●ジェネリック医薬品＊＊＊0.51.01.52.0ジェネリック処理時間（分）医薬品図1HCE.Tを用いたオキシブプロカイン塩酸塩点眼液の細胞傷害性評価平均値±標準誤差，n＝6．＊p＜0.05,vs.先発品．B100先発品■ジェネリック医薬品角膜傷害治癒度（％）80604020表2オキシブプロカイン塩酸塩点眼液先発品およびジェネリック医薬品処理による角膜傷害性の比較先発品ジェネリック医薬品kD（min.1）3.10±0.391.29±0.22＊D∞（％）56.4±2.763.3±7.0平均値±標準誤差，n＝6．＊p＜0.05,vs.先発品．II結果1.オキシブプロカイン塩酸塩点眼液先発品およびジェネリック医薬品の角膜傷害性比較図1はオキシブプロカイン塩酸塩点眼液処理時におけるHCE-T細胞の死亡率を示す．また，表2にはオキシブプロカイン塩酸塩点眼液処理時における急性毒性（kD）と慢性毒性（D∞）を示す．結果から，両製剤処理群の傷害性強度に差がみられ，市販オキシブプロカイン塩酸塩点眼液のジェネリック医薬品を30秒処理した際の細胞死亡率は31.7±1.0％と，先発品（45.8±4.1％）と比較し細胞傷害性は有意に低値であった（平均値±標準誤差，n＝6）．また，ジェネリック医薬品の急性毒性は，先発品と比べ低値を示したが，慢性毒性においては，先発品とジェネリック医薬品間で差は認められなかった．一方，BAC単独処理実験にて0.002％と0.004％BACの30秒処理後の細胞傷害性を調べたところ，それぞれ7.1±1.9％，19.7±3.6％であり，単独2分処理後の細胞傷害性は21.3±5.1％，29.3±5.5％であった（平均値±標準誤差，n＝6）．加えて，先発品中に含まれる増粘剤ポリビニルアルコールおよびジェネリック医薬品中の増粘剤ヒプロメロースの慢性毒性を算出したところ，1％ポリビニルアルコールは4.7±2.1％，0.35％ヒプロメロースでは6.6±2.5％であった（薬剤処理時間2分，平均値±標準誤差，n＝6）．また，先発品およびジェネリック医薬品両製剤に含まれる添加物0.9％塩化ナトリウムおよび0.12％エデト酸ナトリウムの慢性毒性は，0.6±0.1％，9.8±2.4％であった（薬剤処理時間2分，平均値±標準誤差，n＝6）．図2はオキシブプロカ（105）06時間24時間.離後の時間図2オキシブプロカイン塩酸塩点眼液点眼が角膜傷害治癒へ与える影響A：代表的角膜画像（破線内は傷害部分を表す）．B：オキシブプロカイン塩酸塩点眼液点眼後の角膜傷害治癒度度．平均値±標準誤差，n＝5．イン塩酸塩点眼液点眼に伴うラット角膜傷害治癒速度の変化を示す．Invitro系の慢性毒性の結果と同様，ラット角膜上皮.離モデルを用いた系では，先発品およびジェネリック医薬品間で差はみられなかった．III考按オキシブプロカイン塩酸塩点眼液は，眼科領域における検査や手術時に用いられるが，濫用により重篤な角膜傷害を起こすことが知られている．本研究では2013年6月に販売開始されたオキシブプロカイン塩酸塩点眼液のジェネリック医薬品における角膜上皮細胞毒性（副作用）について先発品と比較評価した．まず，オキシブプロカイン塩酸塩点眼液の先発品とジェネリック医薬品のinvitro角膜上皮傷害評価を行ったところ，両処理群において処理時間の増加とともに細胞死亡率が増加し，その急性毒性は先発品＞ジェネリック医薬品であった（表2）．これら点眼製剤の角膜傷害性には保存剤の関与が知られている．点眼剤中に含まれる保存剤は，二次汚染を防止し安全に使用するために必要不可欠である．しかし，一般に保存剤は細菌を殺すという性質上，使用後の“しみる”，“かあたらしい眼科Vol.33，No.6，2016865すむ”，眼の充血をはじめ，点眼表層角膜症や眼瞼炎といった眼局所の副作用発現に繋がり，臨床において問題視されている5）．今回検討したオキシブプロカイン塩酸塩点眼液にはBACが保存剤として用いられており，BACは陽電荷をもつ原子団が菌体表面に吸着することで細胞膜破壊，細胞内の酵素蛋白の変性，呼吸系の阻害を引き起こすことが報告されている6.8）．一方，先発品中に含まれるBAC濃度は0.004％であったが，ジェネリック医薬品ではBAC濃度が0.002％と半分に軽減されている．さらに，0.002％と0.004％BAC単独30秒処理時の細胞傷害性は，それぞれ7.1％，19.7％であったことから，両製剤間の急性毒性の違い（先発品＞ジェネリック医薬品）にはBAC濃度の差が関与しているものと示唆された．これら急性毒性とは異なり，慢性毒性は両製剤ともに約60％であり，先発品とジェネリック医薬品間で差は認められなかった．そこで次に，これら慢性毒性の差を明らかとすべく，BAC濃度0.002％と0.004％の単独2分処理後の細胞傷害性を調べた．その結果，BAC濃度0.002％と0.004％の細胞傷害性はそれぞれ21.3％，29.3％であり，両製剤の慢性毒性に比べ低値であることから，BAC以外の要因が慢性毒性には強く関与しているものと示唆された．オキシブプロカイン塩酸塩点眼液の先発品とジェネリック医薬品の組成の違いとして，BAC濃度の差に加え，異なる増粘剤が用いられていることが挙げられる（表1）．しかし，先発品中に含まれる増粘剤ポリビニルアルコールおよびジェネリック医薬品中の増粘剤ヒプロメロースの慢性毒性を算出してみたところ，1％ポリビニルアルコールと0.35％ヒプロメロースの慢性毒性はともに低値であった．また，両製剤に含まれる添加物0.9％塩化ナトリウムと0.12％エデト酸ナトリウムの慢性毒性はほとんどみられなかった．このように，含有される添加物の細胞傷害性と比較し，オキシブプロカイン塩酸塩点眼液の細胞傷害性（慢性毒性）が高いことから，これら製剤の慢性毒性には，主薬であるオキシブプロカイン自身がもっとも強く関与していることが示唆された．さらに，invivo系にて両製剤が角膜傷害治癒に与える影響を検討したところ，invitro慢性毒性と同様，先発品およびジェネリック医薬品間で差はみられなかった．オキシブプロカイン塩酸塩などの表面麻酔薬は，その麻酔作用により涙液分泌の低下がみられ，薬物による傷害性が高まる危険性が考えられる．また，本invitro系実験にて，オキシブプロカイン塩酸塩の慢性毒性には，主薬がもっとも強く関与していることを示した．以上，オキシブプロカイン塩酸塩点眼液では，BAC濃度を減らすことで，細胞傷害の誘発率を反映する急性毒性の減弱がみられるが，傷害度強度や傷害治癒への影響にかかわる慢性毒性の軽減のためには，もともと0.004％と低濃度であるBACの含量の減弱よりも，主薬自身の傷害性を抑制するような工夫が必要であることを示した．本研究結果は，表面麻酔薬選択や眼に優しい局所麻酔薬の開発における一つの指標になるものと考える．利益相反：利益相反公表基準に該当なし文献1）日東メディック株式会社：オキシブプロカイン塩酸塩点眼液0.4％「ニットー」．添付文書20132）NagaiN,MuraoT,OkamotoNetal：Comparisonofcornealwoundhealingratesafterinstillationofcommerciallyavailablelatanoprostandtravoprostinratdebridedcornealepithelium.JOleoSci59：135-141,20103）長井紀章，大江恭平，森愛里ほか：各種保存剤を用いた市販緑内障治療（配合）点眼液における角膜傷害性のキネティクス解析．あたらしい眼科30：1023-1028,20134）NagaiN,YoshiokaC,ManoYetal：Ananoparticleformulationofdisulfiramprolongscornealresidencetimeofthedrugandreducesintraocularpressure.ExpEyeRes132：115-123,20155）瀧沢岳，片岡伸介，小高明人ほか：ホウ酸含有点眼剤組成の抗菌メカニズム．あたらしい眼科27：518-522,20106）DebbaschC,PisellaPJ,DeSaintJeanMetal：Mitochondrialactivityandglutathioneinjuryinapoptosisinducedbyunpreservedandpreservedbeta-blockersonChangconjunctivalcells.InvestOphthalmolVisSci42：25252533,20017）DeSaintJeanM,BrignoleF,BringuierAF：EffectsofbenzalkoniumchlorideongrowthandsurvivalofChangconjunctivalcells.InvestOphthalmolVisSci40：619-630,19998）DebbaschC,BrignoleF,PisellaPJetal：Quaternaryammoniumsandotherpreservatives’contributioninoxidativestressandapoptosisonChangconjunctivalcells.InvestOphthalmolVisSci42：642-652,2001＊＊＊866あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016（106）

《第35回日本眼薬理学会原著》あたらしい眼科33（6）：857.861，2016c点眼用添加物EDTAが種々保存剤の抗菌力および角膜傷害性へ与える影響長井紀章＊1田辺航＊1辻朗子＊1勝井結美＊1伊藤吉將＊1岡本紀夫＊2下村嘉一＊2＊1近畿大学薬学部製剤学研究室＊2近畿大学医学部眼科学教室EffectofEDTAonAntimicrobialActivityandCornealToxicityofVariousEyedropPreservativesNoriakiNagai1）,WataruTanabe1）,AkikoTsuji1）,YumiKatsui1）,YoshimasaIto1）,NorioOkamoto2）YoshikazuShimomura2）and1）FacultyofPharmacy,KinkiUniversity,2）DepartmentofOphthalmology,KinkiUniversitySchoolofMedicine今回筆者らは，一般的な点眼用添加剤である安定化剤エチレンジアミン四酢酸（EDTA）が，各種保存剤の抗菌力および角膜傷害性に与える影響について検討を行った．保存剤はベンザルコニウム塩化物（BAC），パラオキシ安息香酸メチル（MP），パラオキシ安息香酸プロピル（PP），亜塩素酸ナトリウム（SC）およびクロルヘキシジングルコン酸塩（CHG）の計5種を用いた．また，抗菌力および角膜傷害性の確認には大腸菌（E.coli，ATCC8739），ヒト角膜上皮細胞（HCE-T）を用いた．その結果，EDTA併用下において，BACの抗菌力上昇が認められたが，細胞傷害性に変化はみられなかった．一方，他の4剤の保存剤では，EDTAとの併用により抗菌力および細胞傷害性の低下がみられた．以上，点眼薬処方におけるEDTA使用は，保存剤の抗菌力や細胞傷害性に影響を与えることを明らかとした．本研究成果は，点眼薬処方設計の一つの指標になるものと考える．Inthisstudy,weinvestigatedtheeffectofethylenediaminetetraaceticacid（EDTA）ontheantimicrobialactivityandcornealtoxicityofvariouspreservatives,usingEscherichiacoli（E.coli,ATCC8739）andculturedcornealepitheliumcells（HCE-T）.Benzalkoniumchloride（BAC）,methylparahydroxybenzoate（MP）,propylparahydroxybenzoate（PP）,sodiumchlorite（SC）andchlorhexidinegluconate（CHG）wereusedaspreservativesinthisstudy.AlthoughtheantimicrobialactivityofBACwasincreasedbytheadditionofEDTA,thecornealtoxicityofBACwassimilartothatofthecombinationofEDTAandBAC.Ontheotherhand,boththeantimicrobialactivityandcornealtoxicityofMP,PP,SCandCHGweredecreasedbytheadditionofEDTA.TheseresultsshowthattheuseofEDTAasanophthalmicpharmaceuticaladditiveaffectstheantimicrobialactivityandcornealtoxicityofpreservatives.Thesefindingsprovidesignificantinformationforuseinthedesigningofeyedrops.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）33（6）：857.861,2016〕Keywords：保存剤，エチレンジアミン四酢酸，抗菌力，角膜毒性，点眼薬．preservatives,ethylenediaminetetraaceticacid,antimicrobialactivity,cornealtoxicity,eyedrops.はじめに医薬品は主成分となる薬剤（主剤）のみでは製剤とはいえず，これに製剤設計上必要な薬剤（添加剤）が加えられ初めて製剤となる．点眼薬においても同様であり，一般的に点眼薬には可溶化剤（ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油，ポリソルベート80，ポビドンなど），安定化剤（ポリソルベート80，ポビドン，エチレンジアミン四酢酸（EDTA）など），等張化剤（塩化ナトリウム，ブドウ糖，マンニトールなど），緩衝剤（酢酸ナトリウム水和物，炭酸水素ナトリウム，ホウ酸など），pH調節剤（希塩酸，水酸化ナトリウムなど），保存剤（ベンザルコニウム塩化物（BAC），パラオキシ安息香酸メチル（MP），パラオキシ安息香酸プロピル（PP），亜塩〔別刷請求先〕伊藤吉將：〒577-8502東大阪市小若江3-4-1近畿大学薬学部製剤学研究室Reprintrequests：YoshimasaIto,Ph.D.,FacultyofPharmacy,KinkiUniversity,3-4-1Kowakae,Higashi-Osaka,Osaka577-8502,JAPAN0910-1810/16/\100/頁/JCOPY（97）857素酸ナトリウム（SC），クロルヘキシジングルコン酸塩（CHG）など）が含まれる．なかでもこれら点眼薬中に含まれる保存剤は，二次汚染を防止し安全に使用するために必要不可欠である．現在市販されている点眼薬では，保存剤の約7割にBACが用いられ，約2割にパラベン類（MPやPP），そしてその他の約1割にSCやCHGなどが使用されている．しかし，これら保存剤の長期連続投与は，使用後の“しみる”“かすむ”，眼の充血をはじめ，点眼表層角膜症や眼瞼炎とい(，)った眼局所の副作用発現に繋がるため，臨床において問題視されている1）．したがって，抗菌力が高く，角膜傷害性の少ない眼にやさしい新たな製剤処方の開発が望まれている．このような背景から，眼科領域では1回使い切りタイプの容器やPFデラミ容器R（容器を二層構造とし点眼薬に添加される保存剤を不要にしたもの）などが市販されている．また，配合剤や細胞毒性の低い新規保存剤の開発のための研究も進められている1）．一方，製剤処方において，主薬と添加物の相互作用についてはいまだ十分に検討はなされておらず，添加物が各種保存剤の抗菌力や角膜毒性に与える影響を明確にすることは，眼にやさしく，高い抗菌力を維持する製剤処方の確立において非常に重要である．そこで今回，基礎研究として代表的点眼製剤用添加物であるEDTAが保存剤各種の抗菌力および角膜傷害性に与える影響について検討を行った．I対象および方法1.使用薬物点眼用添加物である安定化剤EDTAと保存剤として多用されているBAC，MP，PP，SCおよびCHGの計6種を用いた．各種試験溶液は，EDTAと各種保存剤（BAC，MP，PP，SC，CHG）を精製水で溶解し，細孔径0.2μmのメンブランフィルターで濾過滅菌することで調製した．角膜細胞傷害性の評価に用いたEDTAの濃度は，過去の報告に従い2），眼科用最大許容投与量（0.127％）以下である0.1％（1mg/mL）とした2）．また，各種保存剤濃度は，臨床で用いられる濃度を参考に，いずれも0.005％（50mg/mL）とした．2.最小発育阻止濃度（MIC）の測定試験菌株には，独立行政法人製品評価技術機構から購入した大腸菌（E.coli，ATCC8739）を用い，MICの測定は微量液体希釈法に従い行った1）．また，感受性測定用培地はMuellerHintonBroth（日本ベクトン・ディッキンソン）を用いた．実験操作は以下のようにして行った．まず，E.coliを寒天培地上で18.24時間培養（35±1℃）後，滅菌生理食塩液にて試験菌が1×108個含まれる菌液を調製し，薬液と1×106個/mLの生菌数になるように混合した（試験液）．これらの試験液を含む容器を22.5±2.5℃の条件下で遮光保存し，28日後の試験溶液中生菌数の確認を行った．生菌数の858あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016確認にはカンテン平板混釈法を用い，対照に用いた薬剤不含有培地での菌の発育を確認後，菌の発育が肉眼的に認められないwellのうち最小の薬剤濃度をMICとした1）．3.角膜上皮細胞傷害性の評価培養細胞は理化学研究所より購入した不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T，RCBNo.1384）を用い，角膜細胞傷害性の評価は，筆者らが確立し報告してきたinvitro角膜上皮細胞傷害性評価法に従った2.4）．HCE-T細胞を96wellプレートに100mL（1×104個）ずつ播種し，37℃，5％CO2インキュベーター内で24時間培養したものを実験に用いた．実験操作は以下のようにして行った．HCE-T細胞を10.120秒薬剤にて処理後，PBSにて2回洗浄し，各wellに100mLの培地およびCellCountReagentSF（ナカライラスク社製）20mLを加え，37℃，5％CO2インキュベーター内で1時間処理後，450nmの吸光度（Abs）を測定した．薬剤処理後の細胞死亡率（％）は次式（1）により算出した．細胞死亡率（％）＝（Abs未処理.Abs薬剤処理）/Abs未処理×100（1）4.統計解析実験は1群に対し8回（検体）行い，得られたデータは平均値±標準誤差（SE）として表した．各々の実験値はStudentのt-testにより解析した．また，本研究ではp値が0.05以下を有意差ありとした．II結果1.EDTA添加に伴う種々保存剤の抗菌力の変化表1はEDTAおよび種々保存剤のMICを示す．また，図1にはEDTAと種々保存剤併用処理時における抗菌力の変化を示す．EDTAのMICは700mg/mLであり，今回使用した保存剤のMICはBAC＞CHG＞Mp＞SC＞PPの順であった．これら保存剤にEDTAを添加したところ，MP，PP，SCおよびCHGにおいて抗菌力の低下がみられた．一方，BACではEDTAの添加により抗菌力の増大が認められ，MICより低い濃度においても十分な抗菌力を示した．表1眼科用添加物のE.coliに対する最小阻害濃度眼科用添加物MIC（μg/mL）BAC（ベンザルコニウム塩化物）16MP（パラオキシ安息香酸メチル）6PP（パラオキシ安息香酸プロピル）1.25SC（亜塩素酸ナトリウム）5CHG（クロルヘキシジングルコン酸塩）8EDTA（エチレンジアミン四酢酸）700（98）A：BACB：MB：MPC：PP1001008080保存効力なし●保存効力ありPP濃度（μg/mL）保存効力なし●保存効力あり保存効力なし●保存効力あり細胞死亡率（％）細胞死亡率（％）SC濃度（μg/mL）BAC濃度（μg/mL）細胞死亡率（％）細胞死亡率（％）CHG濃度（μg/mL）MP濃度（μg/mL）604020604020000010020030040050001002003004005000100200300400500EDTA濃度（μg/mL）EDTA濃度（μg/mL）EDTA濃度（μg/mL）D：SCE：CHG100保存効力なし●保存効力あり保存効力なし●保存効力あり図1EDTAが種々保存剤の抗菌力に与え001002003004005000100200300400500る影響EDTA濃度（μg/mL）EDTA濃度（μg/mL）破線は各保存剤自身（単独）のMICを示す．0A：BACB：MPC：PP8080606040402020MP●MPwithEDTA＊＊00306090120時間（sec）00306090120時間（sec）PP●PPwithEDTAE：CHGD：SC00306090120時間（sec）BAC●BACwithEDTA808080707070細胞死亡率（％）606060505050404040303030202020＊101010SC●SCwithEDTA＊＊CHG●CHGwithEDTA図2EDTA（0.1％）が各種保存剤（0.005208080706050403020＊70＊60504030％）の角膜細胞傷害性に与える影響10細胞死亡率は式（1）を用いて算出した．平0030609012000306090120均値±標準誤差，n＝8．＊p＜0.05vs.コン時間（sec）時間（sec）トロール群（EDTA非添加群）．2.EDTA添加に伴う種々保存剤の角膜細胞傷害性のBAC≒CHG＞SC≫MPの順であった．一方，パラベン類で変化あるPPにおいては処理120秒まで細胞傷害は認められなか図2はEDTAと種々保存剤処理時におけるHCE-T細胞ったが，処理180秒後では細胞傷害がみられ，その細胞死の死亡率を示す．BAC，MP，SCおよびCHGでは処理時間亡率は13.9±2.1（平均値±SE）であった．これら種々保存の増加とともに細胞死亡率の増加が認められ，その傷害性は剤にEDTAを添加したところ，BAC処理群ではその細胞傷（99）あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016859害性に大きな影響はみられなかった．このBAC処理群の結果とは異なり，MP，SCおよびCHG処理群ではEDTAの併用処理により，細胞毒性が有意に低下した．また，PPおよびEDTA併用処理群では，処理0.180秒間において細胞傷害性はみられなかった．III考按EDTAは点眼薬中に多く含まれる安定化剤であり，BAC，MP，PP，SC，CHGは点眼製剤の製造において多用される保存剤である．本研究ではEDTAと各種保存剤（BAC，MP，PP，SC，CHG）の組み合わせが，保存剤の有する抗菌力および角膜上皮細胞毒性（副作用）へ与える影響について明らかにするために検討した．まず，今回用いたEDTAと各種保存剤（BAC，MP，PP，SC，CHG）の抗菌力および角膜上皮細胞傷害性について検討したところ，EDTAの抗菌力はMIC700mg/mLと低かったが，各種保存剤単独では強い抗菌力が確認できた．一方，0.005％における各種保存剤の角膜上皮細胞傷害性は，BAC≒CHG＞SC≫MPの順であり，PPにおいては処理120秒間で細胞傷害性はみられず，毒性は非常に低いものであった．一般に，保存剤の抗菌メカニズムと角膜細胞毒性とは密接にかかわっていることが知られている．今回選択したBACは陽電荷をもつ原子団が菌体表面に吸着することで細胞膜破壊，細胞内の酵素蛋白質の変性，呼吸系の阻害を引き起こす5.7）．また，パラベン類（MPやPP）の抗菌作用発現機構は，膜イオン透過性亢進による膜電位の消失もしくはミトコンドリアの呼吸機能障害によることが先行研究により示唆されており，アルキル側鎖の長さが長い程細胞毒性が低下することが知られている8,9）．これらパラベン類のアルキル側鎖の長さと細胞毒性の関係は，今回示したMP，PPの結果と同様であった（表1および図1）．さらに，SCはアミノ酸のスルフィド（S-H）結合と酵素のジスルフィド（S-S）結合を酸化して細胞の機能を破壊するとともに，細胞膜を直接的に破壊して抗菌活性を示すとされており10），CHGは細胞膜に吸着し，細胞膜傷害と細胞質の漏洩を起こすとともに，酵素蛋白質に吸着して活性阻害を起こすことが知られている11）．一方，本研究では抗菌力の評価に，環境中に存在する菌類の主要な種の一つであるグラム陰性の桿菌E.coliを用いた．グラム陰性菌は細胞膜と外膜の2つの脂質膜に包まれている．この外膜はリポ多糖，リン脂質および数種の蛋白質などからなり，2価陽イオンでそれらの一部が結びつけられているため，陽イオンのキレーターであるEDTAを作用させると，外膜を構成する成分の一部が遊離し，外膜に障害が認められる12,13）．このような膜の傷害によって，外膜により膜内への透過が抑制されていた薬剤が容易に外膜を通過できるよ860あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016うになり，薬効および毒性が高まることが報告されている．したがって，E.coliにEDTAと各種保存剤を併用した際には，薬剤のE.coliに対する膜透過性亢進により抗菌力が高まるが，外膜を持たない角膜上皮細胞に対する細胞傷害性は大きく変化しないものと考えられた．本研究においても，BACとEDTAの組み合わせでは，抗菌力は上昇したが，角膜傷害性においては有意な差はみられなかった．このBACとEDTAの組み合わせの結果とは異なり，パラベン類（MP，PP），SCおよびCHGでは，EDTA併用により抗菌力および角膜傷害性の低下が認められた．EDTA併用処理では薬剤の膜透過性亢進が考えられるが，E.coliに対する抗菌力の低下と角膜上皮細胞における細胞毒性の軽減がともにみられたことから，パラベン類（MP，PP），SCやCHGの薬効（抗菌力）や副作用発現（細胞傷害性）には2価陽イオンがかかわっており，陽イオンのキレーターであるEDTAとの併用はそれらの効力を低下させる可能性が示唆された．以上，点眼薬の処方設計において，添加物EDTAの組み合わせは保存剤の抗菌力，角膜傷害性に影響を及ぼすことを見出した．今後，E.coli以外の菌類に対してどのような影響を与えるかを検討するとともに，パラベン類（MP，PP），SCおよびCHGの保存効果機構と2価陽イオンの関係についても検討を進めていく予定である．本研究結果は，点眼薬処方設計の一つの指標になるものと考える．利益相反：利益相反公表基準に該当なし文献1）瀧沢岳，片岡伸介，小高明人ほか：ホウ酸含有点眼剤組成の抗菌メカニズム．あたらしい眼科27：518-522,20102）長井紀章，村尾卓俊，伊藤吉將ほか：点眼薬含有添加剤であるポリソルベート80及びEDTA点眼が角膜上皮傷害治癒へ与える影響．あたらしい眼科27：1299-1302,20103）NagaiN,YoshiokaC,ManoYetal：Ananoparticleformulationofdisulfiramprolongscornealresidencetimeofthedrugandreducesintraocularpressure.ExpEyeRes132：115-123,20154）NagaiN,ItoY,OkamotoNetal：Ananoparticleformulationreducesthecornealtoxicityofindomethacineyedropsandenhancesitscornealpermeability.Toxicology319：53-6220145）DebbaschC,PisellaPJ,DeSaintJeanMetal：Mitochondrialactivityandglutathioneinjuryinapoptosisinducedbyunpreservedandpreservedbeta-blockersonChangconjunctivalcells.InvestOphthalmolVisSci42：25252533,20016）DeSaintJeanM,BrignoleF,BringuierAF：EffectsofbenzalkoniumchlorideongrowthandsurvivalofChangconjunctivalcells.InvestOphthalmolVisSci40：619-630,（100）19997）DebbaschC,BrignoleF,PisellaPJetal：Quaternaryammoniumsandotherpreservatives’contributioninoxidativestressandapoptosisonChangconjunctivalcells.InvestOphthalmolVisSci42：642-652,20018）BredinJ,Davin-RegliA,PagesJM：PropylparabeninducespotassiumeffluxinEscherichiacoli.JAntimicrobChemother55：1013-1015,20059）NakagawaY,MoldeusP：Mechanismofp-hydroxybenzoateester-inducedmitochondrialdysfunctionandcytotoxicityinisolatedrathepatocytes.BiochemPharmacol55：1907-1914,199810）小林正枝，秋山茂，岩下正人ほか：亜塩素酸ナトリウム製剤の殺菌効力に関する検討．食品衛生学雑誌30：367374,198911）第十六改正日本薬局方解説書廣川書店，C-1563,201112）AsbellMA,EagonRG：Roleofmultivalentcationsintheorganization,structure,andassemblyofthecellwallofPseudomonasaeruginosa.JBacteriol92：380-387,196613）RogersSW,GillelandHEJr,EagonRG：Characterizationofaprotein-lipopolysaccharidecomplexreleasedfromcellwallsofPseudomonasaeruginosabyethylenediaminetetraaceticacid.CanJMicrobiol15：743-748,1969＊＊＊（101）あたらしい眼科Vol.33，No.6，2016861