あたらしい眼科

556あたらしい眼科Vol.5104，22，No.3（00）556（92）0910-1810/15/\100/頁/JCOPY《第51回日本眼感染症学会原著》あたらしい眼科32（4）：556.560，2015cはじめにアトピー性皮膚炎は，「増悪，寛解を繰り返す掻痒のある湿疹を主病変とする疾患であり，患者の多くはアトピー素因を持つ」と定義されている1）．アトピー性皮膚炎の眼合併症として，円錐角膜，白内障および網膜.離などがあげられ，視力予後に関係する眼合併症として注意喚起されている2）．一方，アトピー性皮膚炎のもう一つの合併症として皮膚感染症があげられる．アトピー性皮膚炎では皮膚の易感染性による感染性皮膚疾患として，ブドウ球菌，連鎖球菌による伝染性膿痂疹，単純ヘルペスウイルスによるカポジ（Kaposi）水痘様発疹症，伝染性軟属腫ウイルスによる伝染性軟属腫が多い．さらにこれらの感染性皮膚疾患から角結膜炎に波及し，伝染性膿痂疹ではカタル性結膜炎やブドウ球菌角膜炎3），カポジ水痘様発疹症では単純ヘルペス結膜炎および角膜炎4），伝染性軟属腫では濾胞性結膜炎がみられる5）．しかしながら，アトピー性皮膚炎の易感染性を背景に発症する細菌性角膜炎の詳細については不明な点が多い．今回，筆者らは，アトピー性皮膚炎を有する症例に発症した細菌性角膜炎の特徴について検討した．〔別刷請求先〕庄司真紀：〒173-8610東京都板橋区大谷口上町30-1日本大学医学部視覚科学系眼科学分野Reprintrequests：MakiShoji,M.D.,DivisionofOphthalmology,DepartmentofVisualSciences,NihonUniversitySchoolofMedicine,30-1Oyaguchi-Kamichou,Itabashi-ku,Tokyo173-8610,JAPANアトピー性皮膚炎症例における細菌性角膜炎の検討庄司真紀＊1,2稲田紀子＊1庄司純＊1＊1日本大学医学部視覚科学系眼科学分野＊2東京女子医科大学糖尿病センターStudyofBacterialKeratitisinPatientswithAtopicDermatitisMakiShoji1,2），NorikoInada1）andJunShoji1）1）DivisionofOphthalmology,DepartmentofVisualSciences,NihonUniversitySchoolofMedicine,2）DiabetesCenter,TokyoWomen’sMedicalUniversitySchoolofMedicineアトピー性皮膚炎を有する細菌性角膜炎症例の臨床的特徴を検討する目的で，患者背景，誘因，角膜炎の臨床所見，アレルギー性結膜疾患の有無，角膜擦過物からの検出菌および薬剤感受性について調査した．対象は，細菌性角膜炎に罹患したアトピー性皮膚炎患者34例（男性22例，女性12例）で，平均年齢は28.6歳±11.2歳（±標準偏差）である．角膜炎の誘因としては，コンタクトレンズ（CL）装用がもっとも多く17例（50％）で，アレルギー性結膜疾患の合併率は23例（68％）であった．角膜擦過物の細菌分離培養検査では19例23株で菌が検出され，methicillin-senstiveStaphylococcusaureus10株が最多であった．アトピー性皮膚炎患者の細菌性角膜炎の特徴は，CL装用者に発症するブドウ球菌角膜炎であった．Purpose：Toidentifytheclinicalcharacteristicsofmicrobialkeratitispatientswithatopicdermatitis.SubjectsandMethods：Thisstudyinvolved36patients（22malesand12females,meanage：28.6±11.2（±SD）years）withatopicdermatitiswhosufferedfrommicrobialkeratitis.Inallpatients,dataregardingpatientdemographics,precipitantsofkeratitis,clinicalobservationofkeratitis,presenceofallergicconjunctivaldiseases,andresultsofbacterialcultivationandantibioticsusceptibilitytestswereevaluated.Results：Forprecipitantsofkeratitis,contactlens（CL）wearwasmostcommon［17of34patients（50％）］,andtheincidenceofcomplicationofallergicconjunc-tivaldiseaseswere23of34cases（68％）.Inthecornealabrasionspecimensof19patients,23bacterialstrainsweredetectedbythebacterialcultivationtest,with10strainsofmethicillin-sensitiveStaphylococcusaureusbeingtheonesmostisolated.Conclusions：Inthisstudy,theclinicalcharacteristicofbacterialkeratitisinthepatientswithatopicdermatitiswasfoundtobestaphylococcalkeratitisthatdevelopedduetoCLwear.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）32（4）：556.560,2015〕Keywords：アトピー性皮膚炎，細菌性角膜炎，黄色ブドウ球菌，アレルギー性結膜疾患．atopicdermatitis,bacte-rialkeratitis,Staphylococcusaureus,allergicconjunctivaldisease.（00）556（92）0910-1810/15/\100/頁/JCOPY《第51回日本眼感染症学会原著》あたらしい眼科32（4）：556.560，2015cはじめにアトピー性皮膚炎は，「増悪，寛解を繰り返す掻痒のある湿疹を主病変とする疾患であり，患者の多くはアトピー素因を持つ」と定義されている1）．アトピー性皮膚炎の眼合併症として，円錐角膜，白内障および網膜.離などがあげられ，視力予後に関係する眼合併症として注意喚起されている2）．一方，アトピー性皮膚炎のもう一つの合併症として皮膚感染症があげられる．アトピー性皮膚炎では皮膚の易感染性による感染性皮膚疾患として，ブドウ球菌，連鎖球菌による伝染性膿痂疹，単純ヘルペスウイルスによるカポジ（Kaposi）水痘様発疹症，伝染性軟属腫ウイルスによる伝染性軟属腫が多い．さらにこれらの感染性皮膚疾患から角結膜炎に波及し，伝染性膿痂疹ではカタル性結膜炎やブドウ球菌角膜炎3），カポジ水痘様発疹症では単純ヘルペス結膜炎および角膜炎4），伝染性軟属腫では濾胞性結膜炎がみられる5）．しかしながら，アトピー性皮膚炎の易感染性を背景に発症する細菌性角膜炎の詳細については不明な点が多い．今回，筆者らは，アトピー性皮膚炎を有する症例に発症した細菌性角膜炎の特徴について検討した．〔別刷請求先〕庄司真紀：〒173-8610東京都板橋区大谷口上町30-1日本大学医学部視覚科学系眼科学分野Reprintrequests：MakiShoji,M.D.,DivisionofOphthalmology,DepartmentofVisualSciences,NihonUniversitySchoolofMedicine,30-1Oyaguchi-Kamichou,Itabashi-ku,Tokyo173-8610,JAPANアトピー性皮膚炎症例における細菌性角膜炎の検討庄司真紀＊1,2稲田紀子＊1庄司純＊1＊1日本大学医学部視覚科学系眼科学分野＊2東京女子医科大学糖尿病センターStudyofBacterialKeratitisinPatientswithAtopicDermatitisMakiShoji1,2），NorikoInada1）andJunShoji1）1）DivisionofOphthalmology,DepartmentofVisualSciences,NihonUniversitySchoolofMedicine,2）DiabetesCenter,TokyoWomen’sMedicalUniversitySchoolofMedicineアトピー性皮膚炎を有する細菌性角膜炎症例の臨床的特徴を検討する目的で，患者背景，誘因，角膜炎の臨床所見，アレルギー性結膜疾患の有無，角膜擦過物からの検出菌および薬剤感受性について調査した．対象は，細菌性角膜炎に罹患したアトピー性皮膚炎患者34例（男性22例，女性12例）で，平均年齢は28.6歳±11.2歳（±標準偏差）である．角膜炎の誘因としては，コンタクトレンズ（CL）装用がもっとも多く17例（50％）で，アレルギー性結膜疾患の合併率は23例（68％）であった．角膜擦過物の細菌分離培養検査では19例23株で菌が検出され，methicillin-senstiveStaphylococcusaureus10株が最多であった．アトピー性皮膚炎患者の細菌性角膜炎の特徴は，CL装用者に発症するブドウ球菌角膜炎であった．Purpose：Toidentifytheclinicalcharacteristicsofmicrobialkeratitispatientswithatopicdermatitis.SubjectsandMethods：Thisstudyinvolved36patients（22malesand12females,meanage：28.6±11.2（±SD）years）withatopicdermatitiswhosufferedfrommicrobialkeratitis.Inallpatients,dataregardingpatientdemographics,precipitantsofkeratitis,clinicalobservationofkeratitis,presenceofallergicconjunctivaldiseases,andresultsofbacterialcultivationandantibioticsusceptibilitytestswereevaluated.Results：Forprecipitantsofkeratitis,contactlens（CL）wearwasmostcommon［17of34patients（50％）］,andtheincidenceofcomplicationofallergicconjunc-tivaldiseaseswere23of34cases（68％）.Inthecornealabrasionspecimensof19patients,23bacterialstrainsweredetectedbythebacterialcultivationtest,with10strainsofmethicillin-sensitiveStaphylococcusaureusbeingtheonesmostisolated.Conclusions：Inthisstudy,theclinicalcharacteristicofbacterialkeratitisinthepatientswithatopicdermatitiswasfoundtobestaphylococcalkeratitisthatdevelopedduetoCLwear.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）32（4）：556.560,2015〕Keywords：アトピー性皮膚炎，細菌性角膜炎，黄色ブドウ球菌，アレルギー性結膜疾患．atopicdermatitis,bacte-rialkeratitis,Staphylococcusaureus,allergicconjunctivaldisease.あたらしい眼科Vol.32，No.4，2015557（93）I対象および方法1.対象対象は，2001年1月.2013年12月に日本大学医学部附属板橋病院眼科で加療し，かつ次の①および②の条件を満たした症例である（本研究は，日本大学医学部附属板橋病院臨床研究審査会の承認を得た）．①アトピー性皮膚炎を発症している，もしくは既往を有する症例．②細菌性角膜炎と臨床診断し，角膜病巣部から細菌分離培養検査を施行した症例．2.方法本研究における検討項目は，患者背景，角膜炎の誘因，アレルギー性結膜疾患の有無，角膜炎の臨床所見，角膜擦過物からの検出菌，薬剤感受性試験結果の6項目である．a.患者背景・角膜炎の誘因初診時に，角膜炎発症時の年齢および性別について調査するとともに，問診の記録から角膜炎の発症に関連する誘因について調査した．b.アレルギー性結膜疾患の有無初診時の細隙灯顕微鏡所見から，アレルギー性結膜疾患の合併の有無について検討した．アレルギー性結膜疾患は，アレルギー性結膜疾患診療ガイドライン6）に従って診断と病型分類を行った．c.角膜炎の臨床所見初診時の感染性角膜炎の所見として，角膜潰瘍の形状，角膜endothelialplaque，虹彩炎および前房蓄膿の有無について調査した．d.角膜擦過物からの検出菌・薬剤感受性試験細菌性角膜炎の原因菌検索として，角膜擦過物を直接チョコレート寒天培地に塗抹して細菌分離培養検査をするとともに薬剤感受性試験を行った．II結果1.年齢分布12年間の調査期間における対象症例数は，34例（男性22例，女性12例）であった．発症年齢は28.6±11.2歳（平均±標準偏差）で，発症のピークは25.29歳であり，おもに20代後半から30代前半に多く発症していた（図1）．2.角膜炎の誘因細菌性角膜炎の誘因としては，コンタクトレンズ（contactlens：CL）装用がもっとも多く17例（50％）で，全体の半数を占めた．CLの種類の内訳は，ソフトCL装用が13例，ハードCL装用が4例（円錐角膜に対してハードCL装用3例を含む）であった．その他の誘因は，結膜異物2例，睫毛乱生1例，春季カタルの治療で免疫抑制薬点眼中の症例が1例であり，残りの13例（38％）は明確な誘因が判明しなかった（表1）．3.合併するアレルギー性結膜疾患細菌性角膜炎に合併するアレルギー性結膜疾患は，アレルギー性結膜炎16例（47％），春季カタル4例（12％），巨大乳頭結膜炎3例（9％）で，アレルギー性結膜疾患の合併率は34例中23例（68％）であった（図2）．さらに，合併するアレルギー性結膜疾患を，CL装用の有無で比較した．CL装用者，すなわちCLが誘因で発症した群においては，アレルギー性結膜炎10例（59％），巨大乳頭結膜炎3例（17％），春季カタル1例（6％）であり，アレルギー性結膜疾患の合併率は17例中14例（82％）であった．CL非装用者，すなわちCL以外の誘因で発症した群においては，アレルギー性結膜炎6例（35％）と春季カタル3例（18％）であり，合併率は17例中9例（53％）であった（図3）．4.角膜病巣部からの細菌分離培養検査結果角膜病巣部からの細菌分離培養検査の結果は，34例中19図1発症年齢発症年齢は25.29歳にピークがみられ，おもに20代後半から30代前半に多く発症している．012345678910■：女性■：男性症例数（例）発症年齢5～9歳10～14歳15～19歳20～24歳25～29歳30～34歳35～39歳40～44歳45～49歳50～54歳55～59歳60～64歳表1感染性角膜炎の誘因誘因症例数（例）頻度（％）コンタクトレンズ（CL）装用1750ソフトCL13ハードCL1円錐角膜＋ハードCL3結膜異物26睫毛乱生13免疫抑制薬点眼中13誘因不明1338合計34100あたらしい眼科Vol.32，No.4，2015557（93）I対象および方法1.対象対象は，2001年1月.2013年12月に日本大学医学部附属板橋病院眼科で加療し，かつ次の①および②の条件を満たした症例である（本研究は，日本大学医学部附属板橋病院臨床研究審査会の承認を得た）．①アトピー性皮膚炎を発症している，もしくは既往を有する症例．②細菌性角膜炎と臨床診断し，角膜病巣部から細菌分離培養検査を施行した症例．2.方法本研究における検討項目は，患者背景，角膜炎の誘因，アレルギー性結膜疾患の有無，角膜炎の臨床所見，角膜擦過物からの検出菌，薬剤感受性試験結果の6項目である．a.患者背景・角膜炎の誘因初診時に，角膜炎発症時の年齢および性別について調査するとともに，問診の記録から角膜炎の発症に関連する誘因について調査した．b.アレルギー性結膜疾患の有無初診時の細隙灯顕微鏡所見から，アレルギー性結膜疾患の合併の有無について検討した．アレルギー性結膜疾患は，アレルギー性結膜疾患診療ガイドライン6）に従って診断と病型分類を行った．c.角膜炎の臨床所見初診時の感染性角膜炎の所見として，角膜潰瘍の形状，角膜endothelialplaque，虹彩炎および前房蓄膿の有無について調査した．d.角膜擦過物からの検出菌・薬剤感受性試験細菌性角膜炎の原因菌検索として，角膜擦過物を直接チョコレート寒天培地に塗抹して細菌分離培養検査をするとともに薬剤感受性試験を行った．II結果1.年齢分布12年間の調査期間における対象症例数は，34例（男性22例，女性12例）であった．発症年齢は28.6±11.2歳（平均±標準偏差）で，発症のピークは25.29歳であり，おもに20代後半から30代前半に多く発症していた（図1）．2.角膜炎の誘因細菌性角膜炎の誘因としては，コンタクトレンズ（contactlens：CL）装用がもっとも多く17例（50％）で，全体の半数を占めた．CLの種類の内訳は，ソフトCL装用が13例，ハードCL装用が4例（円錐角膜に対してハードCL装用3例を含む）であった．その他の誘因は，結膜異物2例，睫毛乱生1例，春季カタルの治療で免疫抑制薬点眼中の症例が1例であり，残りの13例（38％）は明確な誘因が判明しなかった（表1）．3.合併するアレルギー性結膜疾患細菌性角膜炎に合併するアレルギー性結膜疾患は，アレルギー性結膜炎16例（47％），春季カタル4例（12％），巨大乳頭結膜炎3例（9％）で，アレルギー性結膜疾患の合併率は34例中23例（68％）であった（図2）．さらに，合併するアレルギー性結膜疾患を，CL装用の有無で比較した．CL装用者，すなわちCLが誘因で発症した群においては，アレルギー性結膜炎10例（59％），巨大乳頭結膜炎3例（17％），春季カタル1例（6％）であり，アレルギー性結膜疾患の合併率は17例中14例（82％）であった．CL非装用者，すなわちCL以外の誘因で発症した群においては，アレルギー性結膜炎6例（35％）と春季カタル3例（18％）であり，合併率は17例中9例（53％）であった（図3）．4.角膜病巣部からの細菌分離培養検査結果角膜病巣部からの細菌分離培養検査の結果は，34例中19図1発症年齢発症年齢は25.29歳にピークがみられ，おもに20代後半から30代前半に多く発症している．012345678910■：女性■：男性症例数（例）発症年齢5～9歳10～14歳15～19歳20～24歳25～29歳30～34歳35～39歳40～44歳45～49歳50～54歳55～59歳60～64歳表1感染性角膜炎の誘因誘因症例数（例）頻度（％）コンタクトレンズ（CL）装用1750ソフトCL13ハードCL1円錐角膜＋ハードCL3結膜異物26睫毛乱生13免疫抑制薬点眼中13誘因不明1338合計34100例（56％）で菌が検出された．同一症例から複数菌の検出が認められた4例を含め，検出株数は23株であった．結果を図4に示す．検出菌は多い順に，メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（methicillin-senstiveStaphylococcusaureus：MSSA）10株，メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（methicillin-resistantStaphylococcusaureus：MRSA）4株，コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（coagulase-negativeStaphylococcus：CNS）3株であり，ブドウ球菌属が23株中17株を占めた．5.薬剤感受性試験結果角膜病巣部から分離された黄色ブドウ球菌14株（MSSA10株，MRSA4株）に対する薬剤感受性試験結果を表2に示す．今回の臨床分離株に対するセフェム系およびカルバペネム系抗菌薬の薬剤感受性は良好であり，また抗菌点眼薬として使用される抗菌薬のなかでは，ゲンタマイシンで4株，エリスロマイシンで2株，レボフロキサシンで1株の耐性菌がみられた．MRSAに対する治療薬として使用されているバンコマイシンでは全株に感受性があり，アルベカシンでは1株の耐性菌がみられた．16例（47％）4例（12％）3例（9％）11例（32％）34例■：アレルギー性結膜炎■：春季カタル：巨大乳頭結膜炎■：所見なし図2感染性角膜炎に合併するアレルギー性結膜疾患アレルギー性結膜疾患は，34例中23例（68％）に合併している．6.アトピー性皮膚炎症例に合併したブドウ球菌角膜炎の前眼部所見の特徴ブドウ球菌角膜炎と確定診断された17例について，前眼部所見の特徴から軽症から重症の4つのグループに分類した．分類は，角膜膿瘍の形状（小円形，不整形，角膜のびまん性混濁）と前房蓄膿の有無とで行った．小円形の角膜潰瘍を呈し前房蓄膿を伴わないグループをG1，不整形膿瘍に前房蓄膿を伴わないグループをG2，不整形膿瘍に前房蓄膿を伴うグループをG3，角膜のびまん性混濁を認めるグループをG4とした．G17例，G25例，G34例，G41例に分類された（図5）．III考按アトピー性皮膚炎症例に発症した細菌性角膜炎は，12年間の観察期間で34例であり，おもな発症誘因はCL装用（17■：アレルギー性結膜炎■：春季カタル：巨大乳頭結膜炎■：所見なし1例3例（17％）3例（18％）6例（35％）3例（18％）3例（18％）8例（47％）10例（59％）CLあり（17例）CLなし（17例）（6％）図3コンタクトレンズ装用の有無とアレルギー性結膜疾患の有無コンタクトレンズ（CL）装用者では17例中14例（82％）にアレルギー性結膜疾患の合併がみられ，非CL装用者では17例中9例（53％）にアレルギー性結膜疾患の合併がみられる．検出菌株数（株）菌陰性15例（44％）菌検出19例（56％）ブドウ球菌属17/23株（74％）MSSA（methicillin-senstiveStaphylococcusaureus）MRSA（methicillin-resistantStaphylococcusaureus）CNS（coagulase-negativeStaphylococcus）GroupCStreptcoccus＊a-Staphylococcus＊Corynebacteriumsp.＊Propionibacteriumacnes＊＊Pseudomonasaeruginosa計10431112123株＊MSSAと同時検出．＊＊1株のみMSSAと同時検出．図4細菌分離培養結果角膜病巣部からの細菌分離培養から菌が検出された症例は，34例中19例（56％）である．同一症例から複数菌が検出された4例を含め，延べ23株の菌が検出され，17株（74％）がブドウ球菌属である．（94）表2薬剤感受性試験結果（感受性株数/検体数）MSSA（感受性株数/検体数）SBT/IPM/PCGCEZABKGMEMCLDMMINOVCMSTLVFXTEICABPCCS8/81/810/108/99/107/105/79/109/1010/108/97/78/8MRSA（感受性株数/検体数）ABKGMCLDMMINOVCMSTLVFXTEIC4/42/32/32/34/44/41/22/2SBT/ABPC：スルバクタム/アンピシリン，PCG：ベンジルペニシリン，CEZ：セファゾリン，IPM/CS：イミペネム/シラスタチン，ABK：アルベカシン，GM：ゲンタマイシン，EM：エリスロマイシン，CLDM：クリンダマイシン，MINO：ミノサイクリン，VCM：バンコマイシン，ST：スルファメトキサゾール/トリメトプリム，LVFX：レボフロキサシン，TEIC：テイコプラニンG1G2G3G4角膜膿瘍の形状小円形不整形不整形びまん性混濁前眼部写真前房蓄膿××○透見不可その他Endothelialplaque形成（1例）Endothelialplaque形成（3例）症例数（例）7541図5アトピー性皮膚炎症例に合併したブドウ球菌角膜炎の前眼部所見の特徴（17例）角膜炎の病態を角膜膿瘍の形状と前房蓄膿の有無によって，G1.G4に分類した．G1，G2に分類される症例が多いが，前房蓄膿を伴うG3，非典型的なG4症例もみられる．例）であった．装用していたCLの種類は，ソフトCLが14例と多く，ハードCL装用者4例であった．アレルギー性結膜疾患の合併率は68％であったが，所見のない症例もあり，アレルギー性結膜疾患と細菌性角膜炎との関連は不明であった．しかしながら，CL装用が誘因となった感染性角膜炎症例では，CL装用以外を誘因とする感染性角膜炎症例と比較して統計学的有意差はみられなかったものの，アレルギー性結膜疾患を合併している症例が多かった．ソフトCL装用者の場合，アレルギー性結膜炎を合併することによりソフトCLの汚れや固着などが生じやすくなり，感染性角膜炎のリスクファクターになる可能性があり，CLの処方，ケア方法には注意を要する．また，ハードCL装用者4例のうち3例は円錐角膜患者であり，CLを使用せざるえない症例も多い．アトピー素因を有する円錐角膜患者がハードCLを装用する場合には，注意すべき合併症としてブドウ球菌角膜炎が以前から指摘されている．さらに黄色ブドウ球菌角膜炎を発症した場合には，急性水腫様の角膜所見を呈することが多いとされ7,8），鑑別に注意を要することが指摘されている．本症例においても円錐角膜患者から分離された細菌はMRSAであり，また感染性角膜炎の所見は小円形から類円形であり，既報と類似した所見であったと考えられた．アトピー性皮膚炎症例では，アレルギー性結膜疾患があっても視力矯正を優先してハードCLを装用する場合，およびアレルギー性結膜疾患，とくに軽症のアレルギー性結膜炎の合併が自覚されないままソフトCL装用を始める場合が，感染性角膜炎の重要な危険因子となりうると考えられた．角膜擦過物からの細菌分離培養検査では23株が検出されたが，23株中17株がブドウ球菌属であった．通常，CL関連角膜感染症の原因菌は緑膿菌が多いが，本検討で緑膿菌が検出された1例は免疫抑制薬使用中の春季カタル症例であり，CL装用者から緑膿菌は検出されなかった．アトピー性皮膚炎では，皮膚に黄色ブドウ球菌が定着（colonization）または感染（infection）することが多いとされている9）．Parkら10）は黄色ブドウ球菌が皮膚に定着する頻度は，急性期の症例で74％，慢性期の症例で38％，健常対照で3％であったとし，黄色ブドウ球菌の定着が急性期の増悪（95）あたらしい眼科Vol.32，No.4，2015559因子として注目すべきであるとしている．また，アトピー性角結膜炎症例における結膜.内細菌分離培養結果においてもブドウ球菌属が分離される頻度が高いことが報告されている11）．したがって，アトピー性皮膚炎に合併する細菌性角膜炎の原因菌としてブドウ球菌属が多くみられたことは，皮膚からの持ち込み感染，結膜.内細菌の感染などの可能性があると考えられた．今回分離されたブドウ球菌属でかつ薬剤耐性であった菌株はMRSA4株であり，MRCNSはみられなかった．他の株ではセフェム系およびフルオロキノロン系抗菌薬が良好な感受性を示したが，ゲンタマイシンに耐性を示す株がみられた．感染性角膜炎診療ガイドライン12）では，グラム陽性菌による細菌性角膜炎に対する治療には，セフェム系抗菌薬とフルオロキノロン系抗菌薬との併用療法が推奨されているが，今回の臨床分離株の薬剤感受性試験結果からも同様の治療が推奨されると考えられた．また，MRSAに対しては，バンコマイシン軟膏が上市されているほかアミカシンやアルベカシンの自家製剤の使用も報告されている13）．しかし，今回の臨床分離株のなかにもアルベカシンに対する耐性株が検出されていることから，耐性菌をさらに増やさないためにも，これらの薬剤の乱用は避けるべきであると考えられた．17例のブドウ球菌角膜炎の重症度は軽症から重症までみられ，4グループ（G1.G4）に分類した．ブドウ球菌角膜炎は表在性膿瘍を形成し，グラム陰性菌感染症に比べて比較的軽症であるとされ，病巣の特徴として円形，類円形または三日月状やひょうたん型の不整型潰瘍とその周囲を取り囲む細胞浸潤があげられている14.16）．本検討では，12例が前房蓄膿のないG1，G2であったが，前房蓄膿がみられたG3が4例，もっとも重症であったG4の病巣は非典型的であった．G4の症例はシールド潰瘍に細菌感染した症例であり，基礎疾患の重症度によって修飾され重症化した症例であると考えられた．したがって，アトピー性皮膚炎に合併するブドウ球菌角膜炎は重症化する症例もみられることから，薬剤感受性検査を含めた細菌学的検査を行いながら注意して治療を進める必要があると考えられた．利益相反：利益相反公表基準に該当なし文献1）日本皮膚科学会アトピー性皮膚炎診療ガイドライン作成委員会：アトピー性皮膚炎診療ガイドライン．日皮会誌119：1515-1534,20092）ChenJJ,ApplebaumDS,SunGSetal：Atopickeratoconjunctivitis：Areview.JAmAcadDermatol70：569-575,20143）佐藤敦子，岩﨑隆，庄司純ほか：伝染性膿痂疹に合併した角膜膿瘍の1例．日眼会誌102：395-398,19984）塚本裕次，井上幸次，前田直之ほか：アトピー素因のある円錐角膜患者に発症した上皮型角膜ヘルペスの4例．眼紀50：229-232,19995）InoueY：Ocularinfectionsinpatientswithatopicdermatitis.IntOphthalmolClin42：55-69,20026）アレルギー性結膜疾患診療ガイドライン編集委員会：アレルギー性結膜疾患診療ガイドライン（第2版）．日眼会誌114：829-870,20107）西田幸二，井上幸次，中川やよいほか：両眼にAcuteHydrops様所見を呈した角膜感染症の1例．あたらしい眼科7：263-266,19908）遠藤純子，﨑元暢，嘉村由美ほか：急性水症様所見を呈する細菌感染を生じた円錐角膜の2症例．眼科42：711714,20009）菅谷誠：アトピー性皮膚炎と細菌感染．アレルギーの臨床32：497-501,201210）ParkHY,KimCR,HuhISetal：Staphylococcusaureuscolonizationinacuteandchronicskinlesionsofpatientswithatopicdermatitis.AnnDermatol25：410-416,201311）田渕今日子，稲田紀子，庄司純ほか：アトピー性角結膜炎におけるブドウ球菌の関与に関する検討．日眼会誌108：397-400,200412）日本眼感染症学会感染性角膜炎診療ガイドライン第2版作成委員会：感染性角膜炎診療ガイドライン（第2版）．日眼会誌117：467-509,201313）大.秀行：眼感染症Now!薬剤耐性の問題点は？MRSAの治療を教えてください．あたらしい眼科26：139-141,201014）稲田紀子，庄司純，齋藤圭子ほか：アトピー素因を有する患者に合併した角膜感染症の4症例．眼科43：11111115,200115）田渕今日子，稲田紀子，庄司純ほか：アトピー性皮膚炎患者に発症したブドウ球菌性角膜潰瘍の2症例．眼科45：1469-1473,200316）庄司純：細菌性角膜潰瘍．臨眼57：162-169,2003＊＊＊（96）

《第51回日本眼感染症学会原著》あたらしい眼科32（4）：551.555，2015cラクトフェリンの抗アカントアメーバ活性に及ぼすリゾチームおよびムチンの影響鈴木智恵＊1矢内健洋＊1野町美弥＊2今安正樹＊2佐々木香る＊3冨田信一＊1＊1玉川大学農学部＊2株式会社メニコン＊3JCHO星ヶ丘医療センターEffectsofLysozymeandMucinonAmoebicidalActivityofLactoferrinAgainstAcanthamoebasp.AA014ChieSuzuki1）,KenyouYanai1）,MiyaNomachi2）,MasakiImayasu2）,KaoruAraki-Sasaki3）andShinichiTomita1）1）FacultyofAgriculture,TamagawaUniversity,2）MeniconCo.,Ltd.,3）JCHOHosigaokaMedicalCenterアカントアメーバによる角膜炎は，しばしば治療に難渋する．本研究では，Acanthamoebasp.AA014臨床分離株の栄養体を用いて，涙液中に存在するリゾチームやムチンがラクトフェリン（LF）の抗アカントアメーバ活性に及ぼす影響について検討した．アメーバは，脱鉄ウシLF（apo-bLF）30μM，60分間処理によって不定形の状態で死滅し，その生存率は6.33±0.58％であった．apo-bLFはリゾチームとの共存で相加作用を示したが，この作用はムチンの共存で低下する傾向が認められた．また，フローサイトメトリー分析によると，apo-bLFとリゾチームで処理したアメーバはDiBAC4（3）によるピークが右へとシフトしたが，ムチンの共存によってピークは小さくなった．LFはアメーバ表層の負電荷部位との静電的な相互作用によって膜の脱分極を生じ，抗アメーバ活性を発揮しているものと推察した．MedicaltreatmentofAcanthamoebakeratitisisoftendifficult.Inthisstudy,weexaminedtheinfluenceoflysozymeandmucinontheamoebicidalactivityoflactoferrin（LF）againstAcanthamoebasp.AA014clinical-isolatetrophozoites.Inthecaseofthetreatmentwithiron-freebovineLF（apo-bLF）at30μMfor60minutes,themeanratioofcellviabilitywas6.3±0.58％.Themorphologyofdeadcellsshowedanalmostnon-globularform.Althoughtheamoebicidalactivityofapo-bLFincreasedinthepresenceoflysozyme,itdecreasedslightlyinthepresenceofmucin.FlowcytometryrevealedthepeakofAcanthamoebatreatedwithapo-bLFandlysozymewasshiftedtotheright,however,thepeakwassmallbycoexistenceofthemucin.ThedepolarizationofthecellmembranewascausedbyelectrostaticinteractionbetweentheLFmoleculeandthecellmembrane.ThefindingsofthisstudyindicatethattheamoebicidalactivityofLFisexertedbythedepolarizationofamoebacells.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）32（4）：551.555,2015〕Keywords：ラクトフェリン，リゾチーム，ムチン，アカントアメーバ，抗アメーバ活性．lactoferrin,lysozyme,mucin,Acanthamoeba,amoebicidalactivity.はじめにアカントアメーバは，土壌や水環境に生息する自由生活型アメーバであり，ライフサイクル中では栄養体とシスト体の二形態をとる1）．栄養体は不定形であることが多いが，栄養源の枯渇などにより環境が悪化すると自己防御のために球形に変化し，さらに悪化するとシスト体へと形態変化する．通常，アカントアメーバによる角膜炎の治療として，角膜掻爬＋抗真菌薬＋消毒剤の併用療法が行われるが，病期が進み，アメーバがシスト化すると治療は困難となることが知られている2）．また，汚染原因とされるソフトコンタクトレンズのケース内にシスト体として存在する場合，消毒剤に抵抗性となる．したがって，コンタクトレンズの保存液として安全に使用でき，かつシスト体に有効な薬剤の開発が必須である．すでにコンタクトレンズの洗浄保存液としては，この目的でヨード製剤が発売されているが，中和が必要である．また，長期使用によるレンズの劣化や眼に対する副作用なども未知〔別刷請求先〕冨田信一：〒194-8610町田市玉川学園6-1-1玉川大学農学部Reprintrequests：ShinichiTomita,Ph.D.,DepartmentofLifeScience,FacultyofAgriculture,TamagawaUniversity,6-1-1TamagawaGakuen,Machida,Tokyo194-8610,JAPAN0910-1810/15/\100/頁/JCOPY（87）551である．一方，ラクトフェリン（LF）は母乳，涙を含め，もともと生体内に存在する蛋白質である．これまでに筆者らは，牛乳由来のLFがアカントアメーバの類縁種であるHartmannella栄養体の増殖を抑制することを報告した3）．その作用機序として，LFの鉄キレート能の関与以外に，LFとアメーバの特異的な結合から，鉄キレート能以外の作用機序，すなわち膜電位の変動と脱分極の可能性を報告した．このLFの将来的な臨床現場での応用を考えた場合，涙液の混和による影響は無視できない．涙液にはLFやリゾチームのような感染防御因子が存在し，外来微生物の定着や増殖を抑制している．また，ムチンは涙液保持を担うことで眼表面の保護の役割を果たしている4）．そこで，本研究では涙液に存在するリゾチームやムチンがLFの抗アカントアメーバ活性に及ぼす影響について検討するとともに，LFの抗アメーバ活性における作用機序について考察した．I実験方法1.材料アメーバは，大阪大学から分譲されたAcanthamoebasp.AA014臨床分離株の栄養体を用いた．また，脱鉄ウシLF（apo-bLF，牛乳由来，森永乳業社製），リゾチーム（ニワトリ卵白由来，シグマ社製）およびムチン（ウシ顎下腺由来，TypeI-S，シアル酸含有量：9.17％，シグマ社製）を用い§§§§§§0204060801000102030405060生存率（％）†††††※※※※※※※※※※※※※※￡￡†††時間（分）図1apo.bLFのリゾチームおよびムチン存在下におけるAcanthamoebasp.AA014の生存率●：Control，○：apo-bLF30μM，△：リゾチーム130μM，□：apo-bLF＋リゾチーム，◇：apo-bLF＋リゾチーム＋ムチン0.2mg/mL．実験データの各時間における比較はANOVAで行い，差が認められた場合にSNK検定を行った．各時間での異なる記号において有意差あり（p＜0.05）とした．552あたらしい眼科Vol.32，No.4，2015た．2.生存性試験アメーバの生存性は，トリパンブルー法で評価した3）．大腸菌抽出液を塗布した寒天培地で30℃，2日間培養したアメーバを回収後，ノイバウエル計算盤を用いて懸濁液（2×106cells/mL）を調製し，各種蛋白質溶液と等量混合した（1×106cells/mL）．この混合液を10分間隔で採取して，0.25％トリパンブルー溶液（フルカ社製）と等量混合し，位相差顕微鏡（200倍，CX41，オリンパス社製）で形態およびトリパンブルー染色性を観察した．評価方法は冨田ら3）の報告に従い，染色陰性を生細胞，陽性を死細胞とし，それぞれ不定形および球形に分類した．また，各種蛋白質溶液は涙液中の濃度を想定して，apo-bLF30μM5），リゾチーム130μM6）およびムチン0.2mg/mL7）とした．3.細胞膜電位細胞膜電位の変動をフローサイトメトリーで検討した3）．AC#6培地で25℃，5日間静置培養した栄養体を1/4Ringersolution（日本製薬社製）で回収し，洗浄後にノイバウエル計算盤を用いて懸濁液（2×106cells/mL）を調製した．この懸濁液と各種蛋白質溶液を等量混合し，37℃，60分間処理した後（1×106cells/mL），アニオン性膜電位感受性色素Bis（1,3-dibutylbarbituricacid）trimethineoxonol，sodiumsalt（DiBAC4（3），同仁化学研究所社製）で染色し，フローサイトメトリー（FACSCalibur，ベクトン・ディッキンソン社製）で蛍光強度を測定した（FL1チャネル，530nm，アメーバ数が10,000に達した時点で終了とした）．II結果1.生存性に及ぼす影響apo-bLF，リゾチームおよびムチン処理におけるアカントアメーバの生存率を図1に示した．これによると，apo-bLF30μMの場合，60分後の生存率は6.33±0.58％となり未処理（Control）に比べて有意に低下した（p＜0.01）ことから，apo-bLFの非常に高い抗アカントアメーバ活性が認められた．また，リゾチーム130μMでは，60分後の生存率は47.67±10.69％となり，約半数のアカントアメーバは死滅した．さらに，apo-bLFおよびリゾチームが共存した場合，60分後の生存率は4.67±4.62％となりapo-bLF単独と比べて有意差はなかったものの，それぞれ単独での処理よりも生存率は低い傾向であり，相加的な抗アカントアメーバ活性を示した．しかし，apo-bLF，リゾチームおよびムチンが共存した場合，生存率は16.00±9.54％となり，抗アカントアメーバ活性はわずかに低下傾向を示した．ついでapo-bLF，リゾチームおよびムチン処理によるアメーバの形態に及ぼす影響を観察した（図2）．これによると，アメーバの形態はいずれの処理においても死細胞の90（88）％以上が不定形であり，LF，リゾチームおよびムチンがアメーバの形態変化に影響を与えることはほとんどなかった．2.細胞膜電位に及ぼす影響蛍光色素のDiBAC4（3）を用いてLFの細胞膜電位に及ぼす影響を検討した．この蛍光色素は，図3のように細胞膜が脱分極することで色素がアメーバ内に入り込み，蛍光強度が増加する．DiBAC4（3）を用いたフローサイトメトリーでの細胞膜電位の変動をヒストグラムで示した（図4）．これによると，加熱処理（80℃，30分）のピークは，Controlのピークと比べて103付近にシフトし蛍光強度が増加したことから，アカントアメーバの脱分極が認められた．apo-bLFの場合，加熱処理と同様にピークシフトは103付近であり，蛍光強度が増加し，脱分極を生じた．また，リゾチームにおいても蛍光強度の増加は認められたが，ピークは102付近であり，完全な脱分極にまでは至らなかった．さらに，apo-bLFおよびリゾチームの共存では，それぞれ単独で処理した場合よりもDiBAC4（3）の取り込み量は増加し，蛍光強度は増加した．しかし，apo-bLF，リゾチームおよびムチンが共存した場合，ピークは102および103付近に分かれ，蛍光強度は低下した．III考察アカントアメーバ栄養体に対するLFの抗アメーバ活性は，apo-bLF30μMで高い活性を示し，栄養体がシスト化することなく死滅した．また，抗アメーバ活性はリゾチームとの共存で相加作用が認められた．同時に，アメーバ細胞膜はapo-bLFによって脱分極し，その程度はリゾチームの共に高い抗アカントアメーバ活性とともに，鉄キレート作用以外の静電的なアメーバ細胞膜への直接作用も示した8,9）．さらに，LFは細胞膜からリポ多糖（LPS）の遊離を引き起こし，細胞膜を損傷することで細胞死を導く機序も報告されている．たとえば，Yamauchiら10）は，bLFがEscherichiacoliCL991-2のLPSを遊離させることを確認し，ヒトリゾチームによるグラム陰性菌の死滅率が増加したと報告している．また，Ellisonら11）は，ヒトLFがE.coli5448の膜透過性に影響を与えるだけでなく，LPSに直接結合することで抗菌活性に関与していることを示し，LFとリゾチームが相乗的にグラム陰性菌を死滅させることを報告している．すなわち，グラム陰性菌に対するLFの抗菌活性は，リゾチームによって増強される細胞膜への直接的な影響が示されている．本研究でも，アカントアメーバ栄養体の細胞膜電位は，apo-bLF処理において大きく変動し，脱分極を生じた．さらにリゾチームの共存によって，細胞膜の脱分極は増大した．このことから，LFが鉄のキレートのみではなく，LF.100800存在比（％）604020存下でさらに増大することが明らかとなった．しかし，これらの抗アメーバ活性は，ムチンが共存することによりわずかな低下傾向を示した．このLFの抗アメーバ活性は静電的な機序が推測される．従来，LFの抗微生物活性は，微生物の増殖に必須な鉄をキレート化し，増殖環境を鉄欠乏状態にすることで発揮され図2apo.bLF，リゾチームおよびムチン共存下におけると考えられてきた．しかし，筆者らがすでに報告したトリるAcanthamoebasp.AA014細胞の形態：不定形死細胞，パンブルー法およびLogreduction法を用いたapo-bLFの：不定形生細胞，：球形生細胞，：球形死細胞．抗アカントアメーバ活性の検討において，apo-bLFは非常処理時間：60分Ⅰ-AⅠ-BⅡ-AⅡ-B図3apo.bLF処理におけるAcanthamoebasp.AA014のDiBAC4（3）染色性I：Control，II：apo-bLF30μM．A：位相差顕微鏡，B：蛍光顕微鏡．観察条件：励起480nm，蛍光530nm，Bar＝20μm．（89）あたらしい眼科Vol.32，No.4，2015553100FL1-H200Events0101102103100FL1-H200Events0101102103104100FL1-H200Events0101102103104100FL1-H200Events0101102103100FL1-H200Events0101102103100FL1-H200Events0101102103ABCDEF100FL1-H200Events0101102103100FL1-H200Events0101102103104100FL1-H200Events0101102103104100FL1-H200Events0101102103100FL1-H200Events0101102103100FL1-H200Events0101102103ABCDEF図4apo.bLF，リゾチームおよびムチン共存下におけるAcanthamoebasp.AA014のDiBAC4（3）の取り込みによる蛍光強度の変動A：Control，B：加熱（80℃，30分），C：apo-bLF30μM，D：リゾチーム130μM，E：apo-bLF＋リゾチーム，F：apo-bLF＋リゾチーム＋ムチン0.2mg/mL．処理時間：60分．アメーバ間の静電的な相互作用によって，アメーバ細胞膜の脱分極および膜損傷を引き起こしていることが明らかとなった．一方，リゾチーム130μM単独での処理でも，apo-bLFほどではないが，抗アカントアメーバ活性が認められた．リゾチームは，細菌細胞壁のペプチドグリカン成分であるNアセチルムラミン酸およびN-アセチルグルコサミン間のb-1，4結合を加水分解することで抗菌活性を示す．LeonSicairosら12）による報告では，リゾチームが赤痢アメーバ栄養体に対して抗アメーバ活性を示すことから，アメーバ細胞膜には細菌のペプチドグリカンと類似の成分を有している可能性を示唆している．このLFおよびリゾチームの抗アメーバ活性がムチンで阻害傾向を示したことにも静電的な機序が関与していると推測される．塩基性蛋白質であるLFおよびリゾチームは，反応系中では正に帯電しており，負に帯電している細胞膜と静電的に相互作用している．そのため，塩基性蛋白質であるapo-bLFおよびリゾチームの共存は，アメーバ細胞膜への静電的な相互作用を大きくしたと考えられる．一方，ムチン分子は糖鎖非還元末端のN-アセチルノイラミン酸によって分子表面が負に帯電している．したがって，正電荷を有するapo-bLFやリゾチームと，負電荷を有するムチンが共存することにより，それらが静電的に相互作用し合い，apo-bLFやリゾチームの細胞膜への相互作用が弱まったと考えられる．実験に用いた各種蛋白質の濃度は，既報5.7）に基づいて設定し，ウシ顎下腺ムチンのN-アセチルノイラミン酸含有量は9.17％であった．ムチンは250kDa以上の分子量でその50％以上が糖鎖によるものであるが，涙液ムチンのN-アセチルノイラミン酸の含有量は明確ではない．このようなことから，今回の結果が臨床症例の炎症状態の眼表面や涙が付着したソフトコンタクトレンズにおいて，どのように反映されているかは不明であるが，実際の臨床現場でも，涙液中のLF，リゾチーム，ムチンが互いに関与していると考えられる．しかし，本研究から，apo-bLFがアカントアメーバ栄養体に対して高い抗アメーバ活性を有することは明らかであり，アカントアメーバ角膜炎の予防や治療における応用の可能性が示唆される．今後は，臨床的に問題となるシスト体に対するLFの作用およびLFとリゾチーム，ムチンの相互作用について検討する予定である．最後に，アメーバを分譲していただいた大阪大学感染制御部浅利誠志先生ならびに砂田淳子先生に感謝申し上げます．また，bLFを提供していただいた森永乳業株式会社食品基盤研究所山内恒治博士ならびに若林裕之博士に感謝申し上げます．利益相反：野町美弥（カテゴリーE：（株）メニコン），今安正樹（カテゴリーE：（株）メニコン）554あたらしい眼科Vol.32，No.4，2015（90）文献1）MaP,VisvesvaraGS,MartinezAJetal：NaegleriaandAcanthamoebainfections：review.RevInfectDis12：490513,19902）YokogawaH,KobayashiA,YamazakiNetal：Bowman’slayerencystmentincasesofpersistentAcanthamoebakeratitis.ClinOphthalmol6：1245-1251,20123）冨田信一，魚谷孝之，高野真未ほか：ラクトフェリンによるHartmannella細胞の増殖抑制作用．ラクトフェリン2009：137-141，20094）堀裕一：涙液層にかかわる眼組織と涙液層の層別機能．専門医のための眼科診療クオリファイ19ドライアイスペシャリストへの道（横井則彦編），p34-37，中山書店，20135）KijlstraA,JeurissenSHM,KoningKM：Lactoferrinlevelsinnormalhumantears.BrJOpthalmol67：199-202,19836）砂田順，松尾信彦，藤井洋子ほか：シェーグレン病における涙液および唾液リゾチーム濃度の研究．眼臨80：816819,19867）中村葉，横井則彦，徳重秀樹ほか：健常者における涙液中のシアル酸測定．日眼会誌104：621-625,20008）冨田信一，長谷川祥太，魚谷孝之ほか：ラクトフェリンのアカントアメーバ臨床株における抗アメーバ活性．ラクトフェリン2011：35-40,20119）冨田信一，鈴木智恵，野町美弥ほか：Logreduction法によるラクトフェリンの抗アカントアメーバ活性の評価．ラクトフェリン2013：115-120,201310）YamauchiK,TomitaM,GiehlTJetal：Antibacterialactivityoflactoferrinandapepsin-derivedlactoferrinpeptidefragment.InfectImmun61：719-728,199311）EllisonRT,GiehlTJ：Killingofgram-negativebacteriabylactoferrinandlysozyme.JClinInvest88：1080-1091,199312）Leon-SicairosN,Lopez-SotoF,Reyes-LopezMetal：Amoebicidalactivityofmilk,apo-lactoferrin,sIgAandlysozyme.ClinMedRes4：106-113,2006＊＊＊（91）あたらしい眼科Vol.32，No.4，2015555

《第34回日本眼薬理学会原著》あたらしい眼科32（4）：545.549，2015c薬物粒子径変更に伴うブリンゾラミド懸濁性点眼液の眼内薬物移行性評価長井紀章＊1真野裕＊1松平有加＊1山岡咲絵＊1吉岡千晶＊1伊藤吉將＊1岡本紀夫＊2下村嘉一＊2＊1近畿大学薬学部製剤学研究室＊2近畿大学医学部眼科学教室NanosizingoftheParticleinBrinzolamideOphthalmicSuspensionEnhancesItsIntraocularPenetrationNoriakiNagai1）,YuMano1）,YukaMatsuhira1）,SakieYamaoka1）,ChiakiYoshioka1）,YoshimasaIto1）Okamoto2）andYoshikazuShimomura2）,Norio1）FacultyofPharmacy,KinkiUniversity,2）DepartmentofOphthalmology,KinkiUniversitySchoolofMedicine本研究では，市販緑内障治療薬である炭酸脱水酵素阻害薬ブリンゾラミド（BLZ）懸濁性点眼液の薬物粒子径変更に伴う眼内薬物移行性について検討を行った．市販BLZ懸濁性点眼液（エイゾプトR）の薬物粒子微細化には，ビーズミルによる水中破砕法を用いた．市販BLZ懸濁性点眼液の平均粒子径は7.05±0.416μmであったが，ビーズミル法を用いることで，平均粒子径0.423±0.221μmまで微細化でき，ナノオーダーの粒子径を有するBLZ分散液が調製できた（Milled-BLZ分散液）．これらMilled-BLZ分散液の眼内薬物移行性について評価したところ，薬物粒子径をナノオーダーにしたことで主薬の角膜透過性および薬物網膜到達量が有意に向上した．以上，微細化によりBLZ懸濁性点眼液の眼内薬物移行性が高まることが明らかとなった．本研究は，点眼用懸濁液の製剤設計およびバイオアベイラビリティー向上につながるものと考えられる．Inthisstudy,weinvestigatedtheeffectofparticlesizeinbrinzolamide（BLZ）ophthalmicsuspensionontheintraocularpenetrationofthedrug.AsuspensioncontainingBLZnanoparticles（BLZNPssuspension；particlesize：0.423±0.221μm）waspreparedbyuseofthebeadmillmethod.Next,theBLZNPssuspensionandanon-milledBLZsuspension（particlesize：7.05±0.416μm）,respectively,wereinstilledinrateyes,andintraocularpenetrationofthedrugwasthenanalyzed.ThecornealpenetrationofBLZfromtheBLZNPssuspensionwasfoundtobesignificantlyhigherthanthatinthenon-milledBLZsuspension.Inaddition,theamountofBLZintheretinasofeyesinstilledwiththeBLZNPssuspensionwasapproximately2-foldhigherthanthatintheretinasofeyesinstilledwiththenon-milledBLZsuspension.TheseresultssuggestthatthenanosizingoftheparticleinBLZophthalmicsuspensionenhancestheintraocularpenetrationofthedrug,andthatanoculardrugdeliverysystemusingnanoparticlesmayexpandtheirusagefortherapyinthefieldofophthalmology.Thefindingsofthisstudyprovideimportantinformationthatshouldproveusefulfordesigningfurtherstudiestodevelopanti-glaucomadrugs.〔AtarashiiGanka（JournaloftheEye）32（4）：545.549,2015〕Keywords：ブリンゾラミド，粒子径，ビーズミル，薬物眼内移行性，エイゾプトR．brinzolamide,particlesize,beadmill,drugintraocularpenetration,AzoptRophthalmicsuspension.はじめにであり，現在臨床現場ではb遮断薬，プロスタグランジン緑内障は，眼圧上昇により視神経・網膜が圧迫され，その製剤，炭酸脱水酵素阻害薬，選択的交感神経a1遮断薬，a，結果視神経障害がみられる眼疾患であり，先進国において失b受容体遮断薬，副交感神経作動薬など，異なる作用機序を明の第一要因である．この緑内障治療の第一選択は薬物療法有する緑内障治療薬の単剤または併用使用が行われている．〔別刷請求先〕伊藤吉將：〒577-8502東大阪市小若江3-4-1近畿大学薬学部製剤学研究室Reprintrequests：YoshimasaIto,Ph.D.,FacultyofPharmacy,KinkiUniversity,3-4-1Kowakae,Higashi-Osaka,Osaka577-8502,JAPAN0910-1810/15/\100/頁/JCOPY（81）545これら緑内障治療薬の一つである炭酸脱水酵素阻害薬の眼圧下降機序は，毛様体無色素上皮細胞においてH2O＋CO2.H2CO3.H＋＋HCO3.の反応を触媒している炭酸脱水酵素（carbonicanhydraseII）の働きを阻害し，HCO3.の生成を抑制することにより，Na＋の能動輸送機構を抑え，その結果房水産生が抑制されるというものである．さらに，点眼により網膜や脈絡膜へ薬物が移行した際には，網膜のMuller細胞や網膜色素上皮細胞，脈絡膜毛細血管に存在する炭酸脱水酵素を阻害し網膜血流が増加するなど，眼圧下降作用のほかに眼循環に好影響を与える可能性が示唆されている1.3）．一方，炭酸脱水酵素阻害薬点眼により網膜血流を高めるためには，血管拡張をきたすほどの十分な薬物濃度を網膜へ供給する必要があり1.5），現場では炭酸脱水酵素阻害薬の眼内移行性を高めることが期待されている．点眼薬の眼内移行性を高める方法として，粘稠化剤により薬物の結膜.内滞留性を向上させる手法が知られている．しかし，粘稠化剤により滞留性を高めただけでは網膜などの眼後部への到達はわずかである．一方，筆者らは近年“医薬品ナノ結晶点眼製剤”を提案し，点眼液中の薬物粒子サイズをナノオーダーにすることで角膜透過性や結膜からの体内移行性が飛躍期に上昇することを見出し報告している6）．したがって，懸濁点眼薬の薬物粒子径をナノオーダーにすることでバイオアベイラビリティ向上が期待される．本研究では，市販緑内障治療薬である炭酸脱水酵素阻害薬ブリンゾラミド（BLZ）懸濁性点眼液の薬物粒子径変更に伴う眼内薬物移行性について検討を行った．I対象および方法1.実験動物実験には日本白色種雄性ウサギ（2.3kg）および雄性Wistarラット（7週齢）を用いた．これら実験動物は25℃に保たれた環境下で飼育し，飼料（飼育繁殖固形飼料CE-2，CR-3，日本クレア）および水は自由に摂取させた．また，動物実験は近畿大学実験動物規定に従い行った．2.ビーズミル法によるブリンゾラミド懸濁液破砕処理市販緑内障治療薬BLZ懸濁性点眼液1％（エイゾプトR懸濁性点眼液1％，日本アルコン）の薬物粒子微細化は，直径0.1mmのジルコニアビーズおよびBeadSmash12（和研薬社製）を用いた水中破砕法（ビーズミル法）にて行い，BeadSmash12による破砕条件は冷却下（4℃）5,500rpmにて30sec×20回とした6）．得られた分散液中BLZ濃度は0.91％であり（ビーズやチューブへの吸着率9％），分散液中のBLZ濃度を生理食塩水にて0.8％に調製したものを本研究ではMilled-BLZ分散液とした．また，BLZ懸濁性点眼液を生理食塩水にて0.8％に調製したものをBLZ分散液として用いた．薬物粒子径の測定はナノ粒子径分布測定装置SALD-546あたらしい眼科Vol.32，No.4，20157100（島津製作所）にて行い，平均値および標準偏差は内蔵の解析ソフトで算出した（屈折率1.95.0.05i）．3.HPLC法によるBLZの定量試料40μlに，氷冷した0.1μg/mlp-オキシ安息香酸メチル（内標準物質，MeOHにて溶解）80μlを加え，この液をクロマトディスク4A（0.45μm，クラボウ）で濾過後高速液体クロマトグラフィー（HPLC）に注入した．HPLC装置はLC-20AT（島津製作所）を使用した．カラムは，InertsilRODS-3（3μm2.1×50mm，ジーエルサイエンス）を用い，室温にて移動相（リン酸カリウム/アセトニトリル，80/20）で平衡化した．移動相の流速は0.25ml/minとし，255nmの紫外部吸収を測定した．4.Invitroウサギ角膜薬物透過実験実験にはメタアクリル樹脂製角膜透過セルを使用した6）．日本白色種雄性ウサギをペントバルビタール（東京化成工業社製）過剰投与により安楽死後，眼球を摘出し，生理食塩水で洗浄した．角膜は，眼球後部の視神経の部位よりハサミを入れ，強膜部位を1.2mm残し切り取った．この角膜を角膜透過セルに装着し，リザーバー側（房水側）にリザーバー液としてHEPES（＋Glc）緩衝液（10mMHEPES，136.2mMNaCl，5.3mMKCl，1.0mMK2HPO4，1.7mMCaCl2・2H2O，5.5mMGlucose，pH7.4）を3.0ml注加した．ドナー側（涙液側）にはBLZあるいはMilled-BLZ分散液を3.0ml注加した．角膜透過セルは，恒温槽中で35oCに保った．BLZ透過量は，リザーバー液を経時的に50μlずつ採取し，上記HPLC法により測定した．得られたデータは，次式に従い，非線形最小二乗法コンピュータプログラムMULTIを用いて当てはめ計算を行い，速度論的パラメータの算出を行った．t＝d26D（1）JC＝Km・D・CBLZ＝KpCBLZd（2）Qt＝Jc・A・（t.t）（3）ここで，JcはBLZの透過速度，Kmは角膜/製剤の分配係数，Dは角膜内での拡散係数，tlagはラグタイム，dは角膜の厚さ（平均0.0625cm），Aは用いた角膜の有効角膜面積（0.78cm2），Qはt時間にリザーバー側に透過した積算薬物量，CBLZはBLZ分散液中のBLZ濃度である．JCおよびtは（3）式に当てはめ算出した．角膜透過係数KpはJc/CBLZから算出した6）．5.Invivoウサギ眼内薬物移行実験日本白色種雄性ウサギに，耳静脈よりペントバルビタール（0.6ml/kg）を投与し全身麻酔した．麻酔後，眼球に局所麻酔薬0.4％ベノキシール液を点眼し，マイクロシリンジで（82）ファイコンチューブ（0.5-1.0，冨士システムズ）と連結した29ゲージ注射針を角膜近傍の強膜部分より前眼房に挿入することによりカニューレを装着した．その後，片眼にBLZまたはMilled-BLZ分散液40μlを点眼し，定めた時間間隔でカニューレより房水を5μlずつ採取し，房水中BLZ濃度を上記HPLC法により測定した（図1）．また，得られたデータから台形法を用い房水中BLZ濃度-時間曲線下面積（areaundertheBLZconcentration-timecurve：AUC）を算出した6）．6.網膜中薬物到達量の測定BLZまたはMilled-BLZ分散液をWistarラットに点眼し，点眼1時間後にペントバルビタール（東京化成工業）を過剰投与することで安楽死させた．その後，眼球を摘出し，網膜を回収した．網膜中BLZ量は上記HPLC法にて測定した．7.統計解析データは，平均値±標準誤差（SE）として表した．各々の実験値の解析にはStudentのt-testを用い，p値が0.05以下を有意差ありとした．II結果1.ビーズミル処理に伴う市販BLZ懸濁液の薬物粒子径変化図2はBLZおよびMilled-BLZの粒度分布曲線を示す．BLZ分散液の平均粒子径は7.09±0.413μmであり，市販BLZ懸濁性点眼液1％の平均粒子径と比較し差はみられなかった（7.05±0.416μm，平均値±標準偏差）．一方，MilledBLZ分散液の平均粒子径は0.423±0.221μmと，ナノオーダーまでBLZの粒子を微細化することが可能であった．2.BLZ懸濁液中薬物粒子径の違いが眼内薬物移行性に与える影響図3はBLZおよびMilled-BLZ分散液のinvitroウサギ角膜透過性を，表1は図3中のデータから算出した速度論的パラメータを示す．両分散液ともに実験開始1時間後から薬物図1Invivoウサギ眼内薬物移行実験操作写真Cumulativedistribution（%）Cumulativedistribution（%）8015601040520000.010.050.10.5151050100500Particlediameter（μm）10020100A：BLZsuspensions20Frequency（%）Frequency（%）80B：Milled-BLZsuspensions15601040520000.010.050.10.5151050100500Particlediameter（μm）図2BLZおよびMilled.BLZ分散液における粒度分布薬物粒子径はナノ粒子径分布測定装置SALD-7100にて測定した．実線は相対粒子量の頻度を，点線は相対粒子量の積算を示す．（83）あたらしい眼科Vol.32，No.4，2015547の角膜透過が認められたが，粒子径の違いによる差はみられなかった．図4はBLZおよびMilled-BLZ分散液のinvivoウサギ角膜透過性について示す．Invitroウサギ角膜透過実験の結果と異なり，Milled-BLZ分散液処理群のラグタイム（t）は，BLZ処理群のそれより低かった．また，MilledBLZ分散液処理群のAUCは，BLZ処理群のそれの2倍高値であった（AUC,BLZ71±12,Milled-BLZ分散液142±4,μM・min，平均値±SE,n＝6）．図5にはBLZおよびMilledBLZ分散液点眼後の網膜中薬物含量を示す．Milled-BLZ分散液点眼1時間後の網膜中BLZ濃度は，BLZ分散液点眼後0120BLZconcentration（μM）80160100401406020：BLZsuspensions：Milled-BLZsuspensions0123456のそれと比較し有意に高かった．III考按炭酸脱水酵素阻害薬の点眼は眼圧降下作用だけでなく，網膜血流の改善効果が期待できる．本研究では，炭酸脱水酵素阻害薬であるBLZ懸濁性点眼液を用い，薬物粒子径変更に伴う眼内薬物移行性改善効果について検討を行った．まず初めに，ビーズミル法を用い市販BLZ懸濁性点眼液の薬物粒子微細化を試みた（図2）．その結果，平均粒子径7.05±0.416μmであった市販BLZ懸濁性点眼液を，平均粒子径0.423±0.221μmとナノオーダーまで微細化することに成功した．一方，BLZ分散液中薬物濃度を測定したところ，破砕処理過程で使用したチューブやジルコニアビーズへの薬物の付着により，破砕処理前には1％であったBLZが破砕処理後には0.91％と減少が認められた．このため，本研究では生理食塩水にて0.8％に濃度調製した市販BLZ懸濁性点眼液（BLZ分散液）およびビーズミル法にて破砕後のBLZ懸濁液（Milled-BLZ分散液，0.8％）を比較検討に用いた．Invitroウサギ角膜透過実験にて，BLZおよびMilledBLZ分散液の角膜透過性を検討したところ，両分散液間で差はみられなかった（図3および表1）．これらinvitroウサTime（h）図3BLZおよびMilled.BLZ分散液におけるinvitroギ角膜透過実験はドナー側（涙液側）にBLZあるいは角膜透過性（ウサギ）Milled-BLZ分散液を用いており，薬物の溶解を促進する因平均値±標準誤差，n＝6羽6眼，n.s.（notsignificant）．子である涙液がなく，角膜表面において薬物の供給が十分に表1Invitroウサギ角膜透過法におけるBLZおよびMilled.BLZ点眼液の速度論的パラメータJc（nmol/cm2/h）Kp（×10.4cm/h）Kmt（min）D（×10.5cm2/h）BLZ1.41±0.270.77±0.140.45±0.0960.7±1.01.07±0.02Milled-BLZ1.52±0.110.83±0.060.52±0.0765.1±5.71.02±0.08速度論的パラメータは式（1）.（3）を用いて算出した．平均値±標準誤差，n＝6．040103040506070BLZconcentration（μM）26351：BLZsuspensions：Milled-BLZsuspensions＊＊＊＊＊＊BLZconcentration（nmol/g）＊1612840BLZMilled-BLZsuspensionssuspensions20Time（min）図5BLZおよびMilled.BLZ分散液における薬物図4BLZおよびMilled.BLZ分散液におけるinvivo網膜移行性（ラット）角膜透過性（ウサギ）網膜は薬物点眼1時間後に回収した．平均値±標準誤平均値±標準誤差，n＝6羽6眼，＊p＜0.05,vs.BLZsus-差，n＝6羽6眼，＊p＜0.05,vs.BLZsuspensionspensions（Student’st-test）．（Student’st-test）．548あたらしい眼科Vol.32，No.4，2015（84）満たされている条件下での薬物透過性を評価する方法である．したがって，本結果から瞬目などにより涙液代謝がみられない系では，粒子径の違いによる薬物の透過性に差はみられないことが明らかとなった．また，両分散液ともに角膜表面で溶解したBLZが角膜内部へ取り込まれ眼内へ移行することが示唆された．一方，これらinvitroウサギ角膜透過実験の結果と異なり，invivoウサギ角膜透過性実験では，Milled-BLZ分散液処理群のラグタイム（t）は，BLZ処理群のそれより低く，Milled-BLZ分散液処理群のAUCは，BLZ処理群のそれの2倍高値であった（図4）．さらに，Milled-BLZ分散液点眼1時間後の網膜中BLZ濃度は，BLZ分散液点眼後のそれと比較し有意に高かった（図5）．一般に，粒子径が小さいほど比表面積が高まり，薬物の溶解速度が高まることが知られている．本結果においても薬物粒子径の小さいMilled-BLZ分散液中のBLZ結晶はBLZ分散液中の結晶と比較し，点眼後涙液により速やかに溶解されるものと考えられる．これら角膜表面での溶解速度の向上は角膜内への薬物供給量の増加につながり，その結果Milled-BLZ分散液点眼時のtの短縮や眼房水および網膜への薬物到達濃度の増加がみられるものと示唆された．BLZ懸濁性点眼液と網膜血流改善に関してはこれまで多くの報告がなされている．Barnesら1）は家兎に7日間連続してBLZを点眼した際，視神経乳頭部血流が約10％増加したと報告している．また，ヒトに関する報告では，正常眼圧緑内障患者を対象とし，BLZを2週間連続点眼することで，網膜中心動脈で最低流速の上昇，末梢血管抵抗の低下がみられることを江見ら2）が示している．さらに，前田ら3）は，BLZは緑内障眼において，神経乳頭辺縁部および傍乳頭網膜組織血流を増加させることを報告している．一方，BLZ点眼後においても網膜血流改善がみられないとの報告もされており4,5），これら異なる結果の仮説として，BLZ点眼後の組織内CO2濃度が血管拡張をきたすレベルに達するかどうかが一つのキーとして考えられている．このように，BLZによる眼圧と網膜循環血流を同時標的とした治療には，十分な薬物量を網膜まで到達させることが必要である．本研究では，市販BLZ懸濁性点眼液の薬物粒子径を変更することで網膜への薬物到達濃度が増加することを明らかとした．これら粒子径を中心とした処方変更は今後の緑内障治療にきわめて有用であると考えられる．一方，市販点眼製剤を用いた今回の系では計20回ものビーズミル破砕処理が必要であり，より効率的な調製法の確立は今後の薬物への応用において重要な課題である．しかし，筆者らはすでにより破砕に適した添加物（デキストリンやセルロース系化合物など）を選択することで効果的かつ効率的な薬物破砕が可能であることを見出し報告している6）．したがって，今後これらの添加物を用い，ナノオーダーの薬剤生成法の改良を試みる予定である．以上，本研究ではビーズミル法を用い市販BLZ懸濁性点眼液の薬物微細化を行うことにより，主薬の角膜透過性および薬物網膜到達量が向上すること見出した．本研究は，点眼用懸濁液の製剤設計およびバイオアベイラビリティ向上につながるものと考えられる．利益相反：利益相反公表基準に該当なし文献1）BarnesGE,LiB,DeanTetal：Increasedopticnerveheadbloodflowafter1weekoftwicedailytopicalbrinzolamidetreatmentinDutch-beltedrabbits.SurvOphthalmol44：S131-140,20002）江見和雄：正常眼圧緑内障におけるブリンゾラミドの眼血流に対する効果．あたらしい眼科21：535-538,20043）前田祥恵，今野伸介，清水美穂ほか：緑内障眼における1％ブリンゾラミド点眼の視神経乳頭および傍乳頭網膜血流に及ぼす影響．あたらしい眼科22：529-532,20054）前田祥恵，今野伸介，大塚賢二：ブリンゾラミド1回点眼の正常人傍乳頭網膜循環に及ぼす影響．あたらしい眼科21：271-274,20045）SampaolesiJ,TosiJ,DarchukVetal：Antiglaucomatousdrugseffectsonopticnerveheadflow：design,baselineandpreliminaryreport.IntOphthalmol23：359-367,20016）NagaiN,ItoY,OkamotoNetal：Ananoparticleformulationreducesthecornealtoxicityofindomethacineyedropsandenhancesitscornealpermeability.Toxicology319：53-62,2014＊＊＊（85）あたらしい眼科Vol.32，No.4，2015549